付敏,陳天寶,歐陽佚亭,賴靖雯,陳敏,曾洪良
(四川省畜牧科學(xué)研究院,動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610000)
肉羊養(yǎng)殖是我國畜禽養(yǎng)殖的重要組成部分,與1961 年相比,2021 年肉羊出欄量增長了34.4 倍,羊肉產(chǎn)量增長了46.7 倍,肉羊產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步增長[1]。然而,我國肉羊養(yǎng)殖也面臨著巨大的挑戰(zhàn):一方面肉羊營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)不完善,導(dǎo)致生產(chǎn)上飼糧配方差異大,能量蛋白質(zhì)不平衡,既浪費(fèi)飼料資源,又造成環(huán)境氮污染。肉羊?qū)︷B(yǎng)分的消化主要通過瘤胃微生物發(fā)酵,只有飼糧提供的能量和氮含量達(dá)到微生物需求平衡時(shí),微生物才能達(dá)到最佳生長狀態(tài),進(jìn)而有利于養(yǎng)分的消化吸收,因此,飼糧適宜的能氮比是合理配制反芻動物飼糧的基礎(chǔ)[2]。研究表明,飼糧適宜的能氮比可以提高肉羊生產(chǎn)性能和養(yǎng)分消化率[3-5];蛋白質(zhì)水平過高導(dǎo)致的能氮不平衡問題,不僅會降低肉羊生產(chǎn)性能,還會增加氮的排泄[5-6],糞便中氮含量與飼料蛋白質(zhì)攝入量有很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系[6-7]。李闖[2]、張繼偉等[4]、柴貴賓等[5]分別提出了不同飼養(yǎng)方式下本地羊適宜的飼糧能氮比,但由于肉羊的窄生態(tài)適應(yīng)性,不同品種肉羊飼糧能氮比適宜值仍然需要根據(jù)品種特性和飼養(yǎng)方式進(jìn)一步探索和研究。另一方面,隨著我國肉羊養(yǎng)殖數(shù)量增加和規(guī)?;潭忍岣撸B(yǎng)殖污染問題日益突出,威脅到生態(tài)環(huán)境和人居安全,而且反芻動物對環(huán)境的影響是其他牲畜的3~10 倍[8]。畜禽糞便排泄參數(shù)不僅能反映畜禽營養(yǎng)健康狀況,更是開展畜禽糞污治理和資源化利用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。國外對羊糞產(chǎn)排特性研究較早,美國農(nóng)業(yè)工程師協(xié)會發(fā)布了羊的糞尿產(chǎn)生量及糞尿中污染物的含量[9],而國內(nèi)對肉羊糞便產(chǎn)排系數(shù)監(jiān)測的重視度不高,研究較晚,楊碩等[10]研究了規(guī)?;驁龆挪囱蚝托∥埠虿煌竟?jié)糞便主要成分含量差異,糞便產(chǎn)生量研究未見詳細(xì)報(bào)道。我國每10 年開展一次的污染普查,只針對生豬、牛、肉雞和蛋雞進(jìn)行產(chǎn)排污系數(shù)原位監(jiān)測,而缺少對羊的產(chǎn)排污監(jiān)測,這給肉羊糞污治理及資源化利用帶來了盲目性。
簡州大耳羊是我國人工培育的肉用山羊新品種,生長快、肉質(zhì)好,在南方地區(qū)廣泛飼養(yǎng)[11]。由于缺少針對性的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)上飼糧能氮比差異較大,這可能導(dǎo)致糞尿特性參數(shù)變化,不利于糞污減排和高效利用。因此,本試驗(yàn)旨在探索全價(jià)顆粒飼糧不同能氮比(代謝能/總氮)對生長育肥期簡州大耳羊糞便排泄參數(shù)、氮排泄參數(shù)以及糞便微生物區(qū)系的影響,為簡州大耳羊的低碳高效養(yǎng)殖和糞便資源化利用提供科技支撐。
本研究采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇32 只體質(zhì)量為(26.16±2.39)kg 的健康簡州大耳羊,隨機(jī)分配到編號為a、b、c、d 的4 個(gè)試驗(yàn)組,每組8 只羊(公母各4只),分別飼喂能氮比(ME/N)為0.59、0.51、0.43、0.35的全價(jià)顆粒飼糧,適應(yīng)30 d后移入羊代謝籠開展12 d全收糞尿試驗(yàn)(預(yù)飼7 d,正式5 d),測定試驗(yàn)羊糞尿和氮排泄參數(shù),然后在正式試驗(yàn)第5 天收集試驗(yàn)羊新鮮直腸糞便測定糞便微生物區(qū)系。試驗(yàn)飼糧配方和能氮比設(shè)計(jì)參照課題組前期研究[3],能氮比為飼糧代謝能濃度與總氮濃度比值,試驗(yàn)飼糧組成及養(yǎng)分含量見表1。
表1 飼糧組成及養(yǎng)分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ),%)Table 1 Composition and nutrient content of experimental diets(DM basis,%)
飼養(yǎng)試驗(yàn)前對羊舍和用具全面清洗、晾干、消毒。飼養(yǎng)期間按照羊場管理規(guī)范進(jìn)行疫病防控和飼養(yǎng)管理,自由飲水,自由采食。正式試驗(yàn)期,對試驗(yàn)羊空腹稱質(zhì)量后移入羊代謝籠,單只單籠飼養(yǎng),先預(yù)飼7 d以確保肉羊體況正常穩(wěn)定,然后連續(xù)開展5 d 的全收糞尿試驗(yàn),準(zhǔn)確稱量每只羊每日的采食量、糞便量和尿液量,記錄圈舍環(huán)境溫度、濕度和試驗(yàn)羊健康狀況等。
飼糧樣品:分別在飼糧加工完成的第1 天、適應(yīng)期第15 天和正式試驗(yàn)期每日采集每組飼料樣品200 g,測定干物質(zhì)含量和總氮含量。
糞便樣品:正式期每日8:00在每只羊的代謝籠特定位置放置干凈帶蓋塑料桶,用于收集試驗(yàn)羊每次全部糞便,于次日8:00稱取前1天糞便總量。糞便混勻后,采用四分法按照糞便總質(zhì)量的20%采集糞便樣品2份測定干物質(zhì)含量、pH和總氮含量,糞便樣品采集方法參照《畜禽糞便監(jiān)測技術(shù)》(GB/T 25169—2022)。
尿液樣品:正式期每日8:00 將干凈的裝有15 mL 4.5 mol·L-1H2SO4的接尿桶(容量5 000 mL)放置于羊代謝籠底部固定位置,收集每只羊全部尿液,于次日8:00 計(jì)量前1 天尿液總量,尿液混勻后,調(diào)整pH≤3(記錄加酸量),并按照總質(zhì)量的20%采集尿液樣品用于測定總氮和氨氮。所有樣品按照標(biāo)準(zhǔn)編號,4 ℃保存,送實(shí)驗(yàn)室檢測。
糞便微生物樣品:在正式期第5 天,用無菌鑷子采集每頭試驗(yàn)羊直腸末端新鮮無污染糞便,裝入5 mL凍存管,并做好標(biāo)記,-80 ℃凍存。
1.4.1 肉羊糞便及氮排泄參數(shù)檢測與計(jì)算
飼料和糞便的干物質(zhì)含量均參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[13]測定,糞便和尿液pH、總氮、氨氮參照NY/T 525—2021 測定。畜禽糞便的排泄量還與體質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[14],為了降低體質(zhì)量變化帶來的排泄量的差異,用單位代謝體質(zhì)量糞便尿液(氮)排泄參數(shù)來衡量糞尿(氮)排泄量更具代表性。通過以下公式計(jì)算:
氮攝入量(g·d-1)=日采食干物質(zhì)量(g·d-1)×飼糧氮含量(%)
日排糞氮(g·d-1)=日排糞便干物質(zhì)量(g·d-1)×糞便總氮含量(%)
日排尿氮(g·d-1)=日排尿液質(zhì)量(g·d-1)×尿液總氮含量(%)
日排總氮(g·d-1)=日排糞氮(g·d-1)+日排尿氮(g·d-1)
氮排泄率(%)=日排總氮(g·d-1)/日攝入氮量(g·d-1)×100%
單位代謝體質(zhì)量糞便日排泄量(g·kg-0.75·d-1)=日排糞便干物質(zhì)量(g·d-1)/羊活體質(zhì)量0.75(kg0.75)
單位代謝體質(zhì)量尿液日排泄量(g·kg-0.75·d-1)=日排尿液質(zhì)量(g·d-1)/羊活體質(zhì)量0.75(kg0.75)
單位代謝體質(zhì)量糞氮日排泄量(g·kg-0.75·d-1)=日排糞氮(g·d-1)/羊活體質(zhì)量0.75(kg0.75)
單位代謝體質(zhì)量尿氮日排泄量(g·kg-0.75·d-1)=日排尿氮(g·d-1)/羊活體質(zhì)量0.75(kg0.75)
1.4.2 肉羊糞便微生物菌群檢測
糞便細(xì)菌多樣性檢測由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成,DNA提取和16S rRNA PCR擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)分析法參照Griffith等[15]的方法。每個(gè)試驗(yàn)組選擇8只羊的糞便樣品進(jìn)行微生物菌群檢測,分析糞便微生物菌群多樣性,及在門和屬水平上的組成和相對豐度。
利用SPSS 20.0 軟件One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析,組間采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較,隨后對飼糧能氮比進(jìn)行線性(Linear)和二次曲線(Quadratic)回歸分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。
2.1.1 對糞便排泄參數(shù)的影響
如表2 所示,飼糧能氮比對試驗(yàn)羊干物質(zhì)采食量、糞便排泄量、尿液排泄量及單位代謝體質(zhì)量糞便日排泄參數(shù)均無顯著影響(PA>0.05),4組試驗(yàn)羊干物質(zhì)采食量平均為1.21 kg·d-1,糞便、尿液排泄量平均為1.25 kg·d-1和0.70 kg·d-1,糞便含水率平均為62.32%,單位代謝體質(zhì)量糞便和尿液日排泄量平均為29.49 g?kg-0.75·d-1和50.59 g?kg-0.75·d-1。隨著飼糧能氮比降低,糞便pH 呈線性增加(PL=0.004),且具有顯著的組間差異(PA=0.029);單位代謝體質(zhì)量尿液排泄量呈線性增加(PL=0.046),從47.35 g?kg-0.75·d-1增加到59.57 g?kg-0.75·d-1,增加了25.81%。
表2 不同試驗(yàn)組簡州大耳羊糞便排泄參數(shù)Table 2 The fecal excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups
2.1.2 對氮排泄參數(shù)的影響
如表3 所示,不同能氮比飼糧對試驗(yàn)羊糞氮、氮排泄率、單位代謝體質(zhì)量糞氮日排泄參數(shù)無顯著影響(PA>0.05),糞氮日排泄量為7.26~8.23 g·d-1,氮排泄率為63.60%~68.55%。但是,隨著飼糧能氮比降低,氮的日攝入量、尿總氮排泄量、尿氨氮排泄量、日排總氮量、單位代謝體質(zhì)量尿氮和單位代謝體質(zhì)量總氮日排泄量均呈線性增加(PL<0.001),且具有顯著的組間差異(PA<0.05),相對于a 組,d 組分別增加了54.90%、152.03 %、605.66%、63.82%、147.50%、60.82%。
表3 不同試驗(yàn)組簡州大耳羊氮排泄參數(shù)Table 3 The nitrogen excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups
2.2.1 糞便樣品16S rRNA 基因測序結(jié)果
4 組糞便32 個(gè)樣本中共獲得1 616 790 條優(yōu)質(zhì)細(xì)菌16S rRNA 基因序列,每個(gè)樣本平均產(chǎn)生55 751.38條,序列平均長度為371.8 bp,有效標(biāo)記(Effective Tags)中堿基質(zhì)量值大于20(測序錯(cuò)誤率小于1%)和30(測序錯(cuò)誤率小于0.1%)的堿基所占的百分比分別為98.16%和94.30%。
2.2.2 OTUs分析和物種注釋
所有樣品共注釋了41 個(gè)門、74 個(gè)綱、163 個(gè)目、234個(gè)科、419個(gè)屬和146個(gè)種。如圖1所示,4個(gè)組共聚類得到2 538 個(gè)OTU,a、b、c、d 組OTU 數(shù)分別為1 665、1 627、1 663、1 855 個(gè),共用1 170 個(gè)OTU,占OTU總數(shù)的46.10%,獨(dú)有的OTU數(shù)分別為75、81、57、430 個(gè),占OTU 總數(shù)的比例分別為2.96%、3.19%、2.25%、16.94%,表明a、b、c 組相似度較高,差異較小,d組與其他3組差異較大。
圖1 不同試驗(yàn)組糞便微生物Venn圖Figure 1 The venn diagram of fecal microorganisms in different groups
2.2.3 菌群α多樣性分析
由表4 可知,4 個(gè)組的覆蓋度均大于0.99,能準(zhǔn)確地反映試驗(yàn)羊糞便中細(xì)菌的組成。a、b、c組α多樣性差異不顯著,但隨著能氮比降低,Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)均呈顯著下降趨勢(PL<0.05,PQ<0.05),d組的Simpson 指數(shù)顯著低于a、b 組和c 組(PA<0.05),Shannon指數(shù)顯著低于b組(PA<0.05)。
表4 不同試驗(yàn)組簡州大耳羊菌群多樣性指數(shù)Table 4 The microbial diversity index of Jianzhou Da′er goats in different groups
2.2.4 菌群β多樣性分析
主成分分析(PCA)如圖2 所示,主成分1 和主成分2 的貢獻(xiàn)值分別為13.15%和7.98%,a、b、c 3 組樣本差異較小,微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高,而d 組與其他3組距離較遠(yuǎn),差異較大。
圖2 糞便微生物主成分分析Figure 2 The principal component analysis(PCA)of fecal microorganisms
2.2.5 糞便菌群在門和屬水平上的組成與相對豐度
如表5所示,在門水平上厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)是優(yōu)勢菌門,兩個(gè)菌門占總細(xì)菌種類的80%左右。隨著飼糧能氮比降低,厚壁菌門的相對豐度先增加后降低(PQ=0.007),c組最高,但與a、b 組差異不顯著,d 組顯著低于前3 組(PA=0.003);疣微菌門(Verrucomicrobiota)和放線菌門(Ac?tinobacteriota)相對豐度呈線性升高(PL<0.05),且d 組顯著高于前3組(PA<0.05);其他菌群相對豐度沒有受到顯著影響(P>0.05)。
表5 糞便微生物門水平的相對豐度(%)Table 5 The relative abundance of fecal microflora at phylum level(%)
如表6 所示,在屬水平上,擬桿菌屬(Bacteroi?des)、瘤胃球菌科(UCG-005)、另枝菌屬(Alistipes)、理研菌科RC9(Rikenellaceae_RC9)、克里斯滕森菌科R7(Christensenellaceae_R-7)、普雷沃氏菌屬(UCG-002)和艾克曼菌屬(Akkermansia)等是各組糞便優(yōu)勢菌屬。隨著飼糧能氮比降低,艾克曼菌屬(PL=0.002)和擬桿菌屬(PL=0.021)的相對豐度呈線性增加,而且d組艾克曼菌屬相對豐度顯著高于前3組(PA=0.007)。毛螺菌科(Lachnospiraceae_AC2044_group)的相對豐度先增加后降低,呈顯著的二次曲線關(guān)系(PQ=0.042)。
表6 糞便微生物屬水平相對豐度(%)Table 6 The relative abundance of fecal microflora at genus level(%)
與豬和雞的糞便相比,肉羊糞便呈顆粒狀,具有含水率較低及適宜的碳氮比等特點(diǎn)[16-17],在糞肥還田利用中深受種植業(yè)主的喜愛,但由于缺少糞便排泄相關(guān)參數(shù)指導(dǎo),糞肥資源化利用效率受到限制。因此,本研究獲取了飼糧不同能氮比條件下簡州大耳羊的糞便排泄參數(shù),并探索其影響規(guī)律和機(jī)理。我國肉羊糞便排泄參數(shù)相關(guān)研究報(bào)道較少,李丹陽等[18]研究報(bào)道半放牧半舍飼貴州半細(xì)毛羊的糞便量、尿液量分別為0.97 kg·d-1·只-1和0.53 L·d-1·只-1,全舍飼湖羊分別為0.99 kg·d-1·只-1和0.56 L·d-1·只-1,略低于本研究結(jié)果。宋大利等[19]報(bào)道的羊糞便排泄量(1.9 kg·d-1)高于本研究,尿液排泄量(0.6 kg·d-1)略低于本研究。分析原因主要是因?yàn)闇y試羊的品種、飼養(yǎng)方式、飼糧形態(tài)都具有較大的差異。本研究結(jié)果表明全價(jià)顆粒飼糧能氮比對試驗(yàn)羊干物質(zhì)采食量、糞便和尿液排泄量均無顯著影響,原因是肉羊干物質(zhì)采食量與飼糧原料組成、形態(tài)、能量和纖維含量顯著相關(guān)[20],本試驗(yàn)中飼糧原料組成、形態(tài)以及能量和纖維水平一致,因此4組試驗(yàn)羊干物質(zhì)采食量無顯著差異,而干物質(zhì)采食量顯著影響糞便排泄量[21-22],因此,糞尿排泄量也無顯著差異,這與前人研究結(jié)果一致。糞便pH 不僅能反映腸道內(nèi)環(huán)境,而且是影響氨氣揮發(fā)的關(guān)鍵因素,一般呈中性或者弱堿性,pH 升高將增加氮的損失[23]。目前未見關(guān)于肉羊糞便pH 的報(bào)道,但有研究顯示生豬 糞 便pH 為6.42~7.64[24],肉 雞 糞 便pH 為6.15~8.17[25],肉牛糞便pH 為6.42~6.9[26],均低于本研究結(jié)果。生豬和肉雞均采用全價(jià)精飼糧飼喂,而肉牛采用全混合日糧飼喂,精飼糧的占比較低,因此生豬和肉雞糞便pH 較肉牛更高,而本研究采用全價(jià)顆粒飼糧飼喂,且營養(yǎng)濃度按照肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的最高生產(chǎn)性能(日增質(zhì)量200 g)進(jìn)行配方,營養(yǎng)密度較大,導(dǎo)致糞便中未消化的堿性物質(zhì)含量較高,而且飼糧能氮比降低,增加了飼糧氮的攝入,導(dǎo)致后腸含氮堿性物質(zhì)增加,進(jìn)而造成糞便pH增加。
本研究結(jié)果表明,飼糧能氮比降低顯著增加了尿氮的排泄,且呈現(xiàn)了顯著的線性相關(guān)性,但對糞氮排泄量沒有顯著影響。這與牛驍麟等[27]用蛋白水平分別為11.5%、14.0%和16.5%的飼糧飼喂32.25 kg左右湖羊的研究結(jié)果一致,同時(shí),樊艷華等[28]和Marini等[29]也得出了相似的試驗(yàn)結(jié)果。糞氮排泄量差異不顯著是由于糞氮主要來源于未消化的日糧氮、未被消化的微生物氮和內(nèi)源氮,排泄量一般比較穩(wěn)定[30];尿氮排泄與反芻動物特殊的消化功能有關(guān),研究表明,反芻動物飼糧中的大部分養(yǎng)分在瘤胃被分解消化,飼糧蛋白質(zhì)被分解為肽、氨基酸和氨,一部分氨被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白,另一部分則被瘤胃壁或后腸吸收,通過血液循環(huán)經(jīng)門靜脈進(jìn)入動物肝臟轉(zhuǎn)化為尿素,其中一部分被尿液排出體外,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不足時(shí),部分尿素重新進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)唾液腺,隨唾液重新進(jìn)入瘤胃[2]。因此,隨著能氮比降低,飼糧氮濃度升高,多余的氮以尿素的形式通過尿液排出體外,導(dǎo)致尿液中的氮排泄量增加,而當(dāng)尿液中尿素排出體外遇到糞便尿素酶時(shí)會轉(zhuǎn)化為氨,導(dǎo)致尿總氮和氨氮的量顯著增加。而尿氨氮容易揮發(fā),且具有刺激性氣味,尿氨氮排泄量的增加不但增加了氮的損失,還會導(dǎo)致圈舍內(nèi)NH3的濃度增加,影響動物健康。
16S rRNA 高通量測序技術(shù)可以很好地揭示肉羊糞便微生物多樣性。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可反映菌群的多樣性,d 組的Simpson 指數(shù)最低,說明糞便菌群的多樣性和均勻度低于前3組,這與PCA 結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn),擬桿菌門和厚壁菌門為試驗(yàn)羊主要優(yōu)勢菌門,這與魏子維等[31]對雷州山羊及潘鋒等[32]對肉牛糞便微生物的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,隨著飼糧能氮比降低,d 組的厚壁菌門相對豐度顯著降低。研究表明,厚壁菌門主要與碳水化合物和蛋白質(zhì)的吸收有關(guān)[33],厚壁菌門相對豐度越高,可能越有利于飼糧蛋白質(zhì)的消化吸收,其相對豐度降低不利于蛋白質(zhì)的消化吸收。付敏等[3]的研究表明在飼糧能氮比為0.43 時(shí),簡州大耳羊生長性能最佳,能氮比為0.35 時(shí),生長性能下降。因此,飼糧能氮比可能會通過影響肉羊后腸菌群的相對豐度,進(jìn)而影響生長性能。與此同時(shí),本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)飼糧能氮比為0.35 時(shí),疣微菌門和放線菌門的相對豐度顯著增加,而疣微菌門具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫的能力[34],放線菌主要通過產(chǎn)生多種抗生素消滅致病菌群來保護(hù)宿主,部分放線菌還能分泌蛋白酶等幫助宿主消化分解飼糧營養(yǎng)物質(zhì)[35],由此推斷,在能氮比降低到0.35時(shí),肉羊后腸可能存在潛在的健康問題,誘導(dǎo)了機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),同時(shí)分泌抗生素抵抗致病菌。研究表明,擬桿菌屬能產(chǎn)生纖維素酶,提高動物對飼糧的消化吸收[36],在屬水平上,本研究最主要的優(yōu)勢菌是擬桿菌屬,說明后腸仍然具有較多的待消化養(yǎng)分,需要微生物分泌更多酶幫助消化。本試驗(yàn)中,飼糧能氮比降為0.35 時(shí),艾克曼菌屬的相對豐度顯著提高,研究認(rèn)為艾克曼菌可以改善腸道屏障功能、增厚黏膜層,其數(shù)量的增加有助于緩解炎癥性腸病癥狀[37],因此,飼糧能氮比過低可能增加了后腸的消化負(fù)擔(dān),可能導(dǎo)致后腸黏膜炎癥。
(1)飼糧能氮比對試驗(yàn)羊糞便和尿液排泄參數(shù)無顯著影響。
(2)隨著飼糧能氮比降低,糞便pH和尿氮排泄量顯著提高。
(3)飼糧能氮比降低到0.35 時(shí),糞便菌群的多樣性和相對豐度受到顯著影響,糞便菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,不利于動物對養(yǎng)分消化吸收,進(jìn)而影響動物腸道健康。