西藏東北部熱泉水中硫氧化菌的多樣性及分布特征

寇祝，卿純，袁昌果，李平

1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（武漢）/生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.長(zhǎng)江流域環(huán)境水科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074

硫是生命物質(zhì)的基本組分之一，是構(gòu)成生物有機(jī)體的重要元素，在自然界中廣泛分布。硫可通過(guò)物理化學(xué)以及微生物作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因此硫循環(huán)在全球生物地球化學(xué)循環(huán)中具有重要作用（Zhao et al.，2020）。陸地?zé)崛嬖诹蚧铩钨|(zhì)硫、硫代硫酸鹽、硫酸鹽、硫化礦物等多種形態(tài)的硫，且具有溫度高、有機(jī)質(zhì)含量低、pH 值范圍廣，溶解氧含量低等特點(diǎn)（Shu et al.，2022），這些特征與早期地球環(huán)境相似。因此，研究熱泉環(huán)境中硫的轉(zhuǎn)化過(guò)程，對(duì)理解早期地球元素循環(huán)具有重要意義。

熱泉中的硫能為微生物提供能源，而微生物在硫的形態(tài)轉(zhuǎn)化中又起到重要作用。在好氧、微氧和厭氧條件下，微生物能夠以氧氣或硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行硫氧化（劉陽(yáng)等，2018）。由于硫元素價(jià)態(tài)較多，硫氧化菌（Sulfur-Oxidizing Bacteria，SOB）可能通過(guò)不同的氧化途徑、酶和電子傳遞機(jī)制對(duì)不同價(jià)態(tài)的硫進(jìn)行氧化。Paracoccus 硫氧化途徑（Paracocus Sulfur Oxidation，PSO）介導(dǎo)硫代硫酸鹽的氧化，該途徑的sox基因簇包含soxRSVWXYZABCDEFGH 15 個(gè)基因，且該基因簇編碼PSO 途徑的重要蛋白，其中SoxB 是硫代硫酸鹽氧化生成SO42?的關(guān)鍵蛋白（Wang et al.，2019）。由反向異化亞硫酸鹽還原酶主導(dǎo)（reverse Dissimilatory sulfite reduction，rDsr）的單質(zhì)硫氧化過(guò)程稱(chēng)為Dsr 途徑，包含的主要基因有rhd、tusA、dsrE2和dsrAB，其中關(guān)鍵基因?yàn)閐srAB。除以上兩種途徑之外，sqr、aprA等基因也編碼微生物不同硫氧化途徑中的關(guān)鍵蛋白（Wu et al.，2021）。

以往的研究多使用soxB作為標(biāo)記基因研究各種環(huán)境中的硫氧化菌，結(jié)果表明不同環(huán)境中優(yōu)勢(shì)SOB 可能存在差異?；鹕酵寥溃罾诘?，2020）與沿海沉積物（Alonso-Sáez et al.，2020）中基于soxB基因的優(yōu)勢(shì)硫氧化菌綱均為Alphaproteobacteria；而鹽堿湖中soxB基因硫氧化菌多為Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria 以 及Gammaproteobacteria（Tourova et al.，2013）。陸地?zé)崛幸泊嬖诖罅苛蜓趸饕植加贏lphaproteobacteria、Gammaproteobacteria 和Betaproteobacteria、Aquificae 等菌綱（Jaffer et al.，2019；甄莉等，2019；Castelán-Sánchez et al.，2020）。除soxB基因外，其他硫氧化功能基因也用于各種環(huán)境中的硫氧化菌研究，某些研究還進(jìn)行了功能基因豐度比較以及環(huán)境因子的影響分析。例如，aprA基因也用于熱泉（Kubo et al.，2011）及海底熱液沉積物（Wang et al.，2018）中硫氧化菌的研究，其中與熱液噴口的距離影響著海底熱液沉積物硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)。在海洋高溫油藏采出水（Zhou et al.，2020）硫氧化菌的研究中使用soxB、dsrA和aprA基因作為標(biāo)記因子，qPCR（Real-time Quantitative PCR）結(jié)果表明aprA基因豐度最大，soxB與dsrA基因豐度較低且相差不大。soxB、sqr以及dsrA基因用于研究淡水湖（Kojima et al.，2014）和江河（Luo et al.，2018）中的硫氧化菌，珠江水體中，基于不同基因的主導(dǎo)硫氧化菌在綱水平均為Betaproteobacteria 與Alphaproteobacteria，但目水平上，基于soxB基因的主要SOB 為Burkholderiales，而Nitrosomonadales 是基于dsrA基因的優(yōu)勢(shì)SOB。此外，珠江水體中環(huán)境因子對(duì)不同功能基因硫氧化菌群落結(jié)構(gòu)的影響也不同，基因豐度結(jié)果表明SoxB是該環(huán)境中的關(guān)鍵硫氧化酶（Luo et al.，2018）。前人研究表明，同一區(qū)域水體與沉積物中的硫氧化菌群落結(jié)構(gòu)可能也不同，例如鹽堿湖沉積物中Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度高于水體中Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度（Yang et al.，2013）；存在于云南熱泉沉積物與水體中的硫氧化菌也存在差異（Hou et al.，2013）。綜上所述，前人已在鹽堿湖、淡水湖、江河等環(huán)境中對(duì)硫氧化菌的多樣性及分布特征方面開(kāi)展了大量的研究，但在硫廣泛分布的熱泉水中，不同類(lèi)型的硫氧化菌的相關(guān)研究還較為少見(jiàn)。

西藏地?zé)釁^(qū)是世界上最活躍的地?zé)釁^(qū)域之一，陸地?zé)崛植紡V泛。以往對(duì)西藏陸地?zé)崛械奈⑸镅芯慷嘁?6S rRNA 基因?yàn)橹鳎n天賜，2018；Ma et al.，2021），并發(fā)現(xiàn)如Thiobacillus等硫氧化菌群的存在。近年來(lái)，甄莉等（2019）采用硫氧化功能基因soxB克隆文庫(kù)的方法，分析了西藏南部5 個(gè)地?zé)釁^(qū)的25 個(gè)熱泉沉積物樣點(diǎn)中的硫氧化菌多樣性。其研究采樣點(diǎn)僅限于西藏南部，且該研究?jī)H分析了熱泉沉積物中基于soxB基因的硫氧化菌，而對(duì)于熱泉分布眾多的西藏東北地區(qū)，熱泉水中不同硫氧化途徑的SOB 多樣性及分布特征的研究并未涉及。

因此，本研究旨在通過(guò)構(gòu)建西藏東北地區(qū)熱泉水中SOB 的soxB基因和dsrA基因克隆文庫(kù)，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技術(shù)，分析對(duì)比soxB與dsrA硫氧化途徑SOB 在西藏東北部熱泉水中的多樣性、分布特征及其主控環(huán)境因子。本研究可完善對(duì)西藏?zé)崛w環(huán)境中SOB 多樣性的認(rèn)識(shí)，厘清影響不同硫氧化基因SOB 群落分布的關(guān)鍵環(huán)境因子，為全面理解熱泉微生物硫循環(huán)及其環(huán)境意義奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

西藏處于喜馬拉雅地?zé)釒?，該地區(qū)熱液系統(tǒng)分布廣泛，且已發(fā)現(xiàn)340 余處熱水（呂苑苑等，2014）。西藏地區(qū)地?zé)崴猩楹科毡槠撸瑥?0－126 mg·L?1，控制地?zé)崴楹康年P(guān)鍵因素為巖漿流體的地質(zhì)成因及其化學(xué)成分，其中硫化物的濃度也影響地?zé)崴械纳楹浚℅uo et al.，2019）。本文研究區(qū)域位于西藏東北部的那曲市與昌都市，該區(qū)域處于亞?wèn)|-谷露-那曲裂谷系，斷裂帶水熱活動(dòng)頻繁（呂苑苑等，2014），擁有許多不同環(huán)境梯度的熱泉。西藏北部的高溫沸泉的水化學(xué)特征主要是HCO3-Na 型；西藏東部地區(qū)熱泉的水化學(xué)特征以HCO3-Na 為主，也存在少量HCO3-Cl-Na 型熱泉。熱泉水化特征的不同可能與其形成方式相關(guān)，HCO3-Na 型的熱泉水通常是大氣降水通過(guò)大斷裂深循環(huán)形成，而花崗巖巖體中的放射性元素可能是HCO3-Cl-Na型熱泉的熱量來(lái)源（王尚，2015）。

1.2 樣品采集及理化參數(shù)測(cè)定

本研究采集的熱泉水樣來(lái)自西藏東北部的5 個(gè)地區(qū)：達(dá)巴、卓瑪、濱達(dá)微、卻色以及嘎弄，包括13 個(gè)熱泉，分別為達(dá)巴熱泉（DB1、DB41、DB45、DB5、DB6、DB7、DB8、DB10）、卓瑪熱泉（ZM1、ZM2）、濱達(dá)微熱泉（BDW）、卻色熱泉（QS）和嘎弄熱泉（GN）。采樣點(diǎn)如圖1。

圖1 西藏?zé)崛蓸狱c(diǎn)分布圖Figure 1 Distribution of hot springs water sampling sites in Tibet

采用過(guò)濾法收集熱泉微生物樣品。使用裝有0.22 μm×142 mm 濾膜的Millipore 不銹鋼過(guò)濾器過(guò)濾約10 L 熱泉水，將用于實(shí)驗(yàn)室測(cè)量HCO3?、SO42?、As5+、AsT（總砷）質(zhì)量濃度的水樣分別收集到50 mL 酸洗聚丙烯瓶和棕色玻璃瓶中。過(guò)濾后含微生物的膜放入50 mL 無(wú)菌聚丙烯管，立即儲(chǔ)存于干冰中。按照J(rèn)iang et al.（2016）的方法收集測(cè)砷的水樣，將每個(gè)水樣的10 mL 通過(guò)硅基強(qiáng)陰離子交換筒（Supelco，美國(guó)），用50%的甲醇和去離子水進(jìn)行預(yù)處理。As5+保留在筒中，As3+保留在過(guò)濾后的溶液中。隨后，用10 mL 1 mol·L?1HCl 洗脫，釋放結(jié)合的As5+以洗脫樣品。所有用于微生物群落分析的樣品在野外和運(yùn)輸過(guò)程中保存在干冰中，然后在實(shí)驗(yàn)室?80 ℃的超低溫冰箱中保存，直到進(jìn)一步分析。每個(gè)熱泉水樣及微生物樣品均平行采集3 份。

現(xiàn)場(chǎng)采集熱泉水樣，使用Thermo 水化測(cè)定儀（Hach Corp.美國(guó)）現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)熱泉水體溫度、pH 和氧化還原電位（Oxidation-Reduction Potential，ORP）（Qing et al.，2023）。使用Hach DR850 分光光度計(jì)（美國(guó)）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試熱泉水樣中的S2?和FeT（總鐵）的質(zhì)量濃度，其中，S2?質(zhì)量濃度的測(cè)定采用亞甲基藍(lán)分光光度法（Qing et al.，2023），檢測(cè)限為0.01 mg·L?1；FeT質(zhì)量濃度的測(cè)定采用FerroZine 分光光度法（Viollier et al.，2000），檢測(cè)限為0.03 mg·L?1。采用滴定法（DZ/T 0064.49—1993）測(cè)量HCO3?的質(zhì)量濃度，檢測(cè)限為5 mg·L?1。使用離子色譜儀（ICS1100，Dionex，USA）測(cè)量SO42?的質(zhì)量濃度（姜舟，2016），測(cè)定時(shí)使用1.7 mmol·L?1碳酸鈉+1.8 mmol·L?1碳酸氫鈉溶液為流動(dòng)相。As5+、AsT的質(zhì)量濃度使用液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀（LC-HG-AFS，海光AFS-9780，北京）測(cè)定（姜舟，2016），分別配制質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100μg·L?1的As3+、As5+標(biāo)準(zhǔn)溶液，為測(cè)量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用；As3+和As5+的檢出限分別為2×10?9和4×10?9；AsT的質(zhì)量濃度為As3+、As5+質(zhì)量濃度之和。測(cè)量各理化參數(shù)時(shí)均測(cè)量3 組平行樣品，理化參數(shù)得到的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 DNA 的提取和硫氧化基因PCR 擴(kuò)增

樣品DNA 的提取采用FastDNA?SPIN Kit for Soil（MP BIO company，美國(guó)），提取過(guò)程參考試劑盒提供的操作步驟。以提取的總DNA 為模板，使用引物soxB-710F（5′-ATCGGYCAGGCYTTYCCS TA-3′）/soxB-1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTT GC-3′）（楊磊等，2020）和dsrA-625F（5′-TTCAAG TTCTCCGGCTGCSCNAAYGACTG-3′）/dsrA-877R（5′-CGTTSANRCAGTGCATGCAGCG-3′）（Luo et al.，2018）進(jìn)行西藏?zé)崛畼又衧oxB和dsrA基因PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTP，19 μL ddH2O，正反向引物各1 μL，0.5 μL r-Taq DNA聚合酶以及1 μL DNA 模板，共計(jì)25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)（Luo et al.，2018；楊磊等，2020），PCR 產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為10 g·L?1的瓊脂糖凝膠（1 g 瓊脂糖粉溶于100 mL 1×TAE 緩沖液中）電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀(guān)察，并切取目標(biāo)條帶，其中soxB基因目的片段長(zhǎng)度為511 bp，dsrA基因目的片段長(zhǎng)度為252 bp。用試劑盒E.Z.N.A?Gel Extraction Kit（Omega Bio-Tek，美國(guó)）純化PCR 產(chǎn)物，回收DNA。

1.4 硫氧化基因克隆文庫(kù)構(gòu)建及系統(tǒng)發(fā)育分析

克隆文庫(kù)的構(gòu)建結(jié)合前人的方法（Wang et al.，2018）以及試劑盒操作步驟，將純化后的目的片段連接到 pClone007 Versatile Simple Vector 質(zhì)粒（TSINGKE，中國(guó)）載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trelief5α（TSINGKE，中國(guó)）中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布到含Amp（Ampicillin，氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上，將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。針對(duì)每1 個(gè)采樣點(diǎn)建立1 個(gè)克隆文庫(kù)，每個(gè)克隆文庫(kù)隨機(jī)挑選克隆子，使用引物M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′ ） /M13R （ 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′）進(jìn)行PCR（反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；35 次循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min）；72 ℃終延伸10 min）及凝膠電泳確定克隆子是否為陽(yáng)性，得出結(jié)果后選擇20－45 個(gè)陽(yáng)性克隆子送往武漢艾康健生物技術(shù)公司測(cè)序。使用MEGA 7 軟件裁剪測(cè)序獲得的核苷酸序列；核酸序列對(duì)齊后，使用Mothur進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）的劃分，cutoff 值為0.03；劃分得到的每個(gè)OTU 選取1 個(gè)代表序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastx，得到與本研究OTU 相近的氨基酸序列；下載相似性最高的氨基酸序列為參考序列，導(dǎo)入MEGA 7 軟件，與本研究的OTU 序列裁剪對(duì)齊后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。該研究中測(cè)定的克隆序列已經(jīng)遞交至GenBank 中，獲得登錄號(hào)為ON012851－ON012956。

1.5 qPCR 定量實(shí)驗(yàn)

從1.4 的克隆文庫(kù)中挑選陽(yáng)性克隆，在含Amp的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA 濃度，得到的質(zhì)粒DNA 用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備采用7 個(gè)系列10 倍稀釋?zhuān)秶鸀槊亢辽?02－108個(gè)基因拷貝。通過(guò)測(cè)定相關(guān)功能基因的拷貝數(shù)、濃度和堿基對(duì)組成對(duì)DNA 進(jìn)行量化。

在ABI 7500 Fast real-time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）上使用 SYBR Premix ExTaq?Ⅱ（TaKaRa，大連，中國(guó)）進(jìn)行了3 個(gè)重復(fù)的定量PCR。16S rRNA 基因的引物對(duì)為bac-515F （ 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）/bac-806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′），反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；40 次循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s）。soxB基因的引物對(duì)為soxB-432F（5′-GAYGGNGGNGAYACNTGG-3′）/soxB-693B（5′-ATCGGNCARGCNTTYCCNTA-3′），反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min；40 次循環(huán)（95 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s）。dsrA基因的引物對(duì)同1.3，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；40 次循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s）。soxB、dsrA以及16S rRNA 基因的擴(kuò)增效率（amplification efficiencies，%）分別為92.6、91.6 以及87.8。各個(gè)樣點(diǎn)中soxB與dsrA基因的相對(duì)豐度為其在各個(gè)樣點(diǎn)的基因拷貝數(shù)與16S rRNA 基因拷貝數(shù)的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

硫氧化基因soxB與dsrA克隆文庫(kù)的覆蓋度使用公式計(jì)算：

其中：

C——覆蓋度；

n——文庫(kù)中只出現(xiàn)一次的克隆數(shù)量；

N——該文庫(kù)克隆總數(shù)（Jiang et al.，2016）。使用R 4.1.0 進(jìn)行環(huán)境因子與硫氧化菌群落組成和分布的RDA（Redundancy analysis）分析，使用SPSS軟件進(jìn)行環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析、多樣性指數(shù)差異分析、環(huán)境因子與多樣性指數(shù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱泉水體理化特征

西藏東北部5 個(gè)地區(qū)的熱泉溫度為 (25.0±0.1)－(69.8±0.2) ℃，pH 為 (6.59±0.01)－(8.37±0.01)（表1），除BDW 熱泉為酸性熱泉外，其余熱泉均為中性或堿性熱泉。西藏?zé)崛螂x子質(zhì)量濃度較低，為 (0.80±0.04)－(2.56±0.02) mg·L?1。除DB10樣點(diǎn)外，其余達(dá)巴地區(qū)熱泉水樣中硫酸根質(zhì)量濃度較高，為 (455.6±2.1)－(643.3±0.9) mg·L?1。此外BDW 樣點(diǎn)也有較高的硫酸根質(zhì)量濃度，為(620.7±1.3) mg·L?1。西藏東北部熱泉中的砷多以五價(jià)砷的形式存在，其中達(dá)巴熱泉中總砷含量普遍偏高，最高可達(dá) (9 298.58±1.08) μg·L?1，其余熱泉的總砷含量則較低。熱泉水化參數(shù)的Spearman 分析表明，ORP 與溫度（r= ?0.648，t= ?4.333，P=0.017）呈顯著負(fù)相關(guān)，SO42?質(zhì)量濃度與AsT質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.675，t= ?1.564，P=0.029）。

表1 采樣點(diǎn)主要地球化學(xué)參數(shù)Table 1 Main geochemical parameters of hot spring water in Tibet

2.2 硫氧化菌群落α 多樣性

從西藏東北部13 個(gè)熱泉樣品中擴(kuò)增到541 條序列，其中dsrA基因共獲得227 條陽(yáng)性克隆序列，分屬于47 個(gè)OTU；soxB基因共獲得314 條陽(yáng)性克隆序列，分屬于61 個(gè)OTU（表2－3）?；赿srA基因的克隆文庫(kù)覆蓋度為92%－100%（表2），基于soxB基因的克隆文庫(kù)覆蓋度為92%－97%（表3）。α 多樣性指數(shù)（Chao 1、Shannon、Simpson_1?D）分析結(jié)果表明西藏東北部熱泉水中基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)為3－7，Shannon 指數(shù)為1.0－2.6，Simpson_1?D 指數(shù)為0.4－0.8；soxB基因的Chao 1指數(shù)為3.0－12.0，Shannon 指數(shù)為0.9－2.9，Simpson_1?D 指數(shù)為0.3－0.8。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)西藏東北部熱泉中dsrA基因與soxB基因的Shannon 指數(shù)、Simpson_1?D 指數(shù)無(wú)明顯區(qū)別，但Chao 1 指數(shù)呈現(xiàn)出顯著差異（t=2.272，P=0.042）（圖2），結(jié)果顯示西藏?zé)崛谢趕oxB的Chao 1指數(shù)大于基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)（圖2a），表示西藏東北部熱泉水中基于soxB的SOB 物種豐富度較高，在熱泉水體中可能發(fā)現(xiàn)更多種類(lèi)的soxB基因型硫氧化菌。此外，探究環(huán)境因子對(duì)dsrA以及soxB基因α 多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)僅SO42?濃度與基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)顯著呈負(fù)相關(guān)（r= ?0.854，t= ?3.792，P=0.002）（表4），表明西藏東北部熱泉水中基于dsrA基因的SOB 的物種豐富度可能受到SO42?濃度的影響較大，SO42?濃度越高的熱泉水體中dsrA基因型SOB 物種數(shù)量可能越少。

表2 硫氧化基因dsrA 克隆文庫(kù)的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of dsrA gene clone libraries

表3 硫氧化基因soxB 克隆文庫(kù)的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indices of soxB gene clone libraries

表4 環(huán)境因子與dsrA 基因α 多樣性指數(shù)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between environmental factors and alpha diversity index of dsrA

圖2 soxB 與dsrA 基因α 多樣性指數(shù)差異圖Figure 2 Alpha diversity index difference between soxB and dsrA gene

2.3 硫氧化菌群落組成

對(duì)13 個(gè)熱泉水體樣本構(gòu)建克隆文庫(kù)后得到的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明西藏東北部熱泉水體中基于soxB基因的SOB 在綱水平上包含有Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia（圖3），而基于dsrA基因的 SOB 在綱水平上僅包含Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia（圖4），表明在綱水平上，dsrA基因型SOB 物種豐富度低于soxB基因型SOB 物種豐富度?；趕oxB基因的優(yōu)勢(shì)菌綱為Betaproteobacteria（圖3），其相對(duì)豐度在各樣點(diǎn)中占88.0%－100.0%。在基于soxB基因的系統(tǒng)發(fā)育中，達(dá)巴（DB）地區(qū)與卓瑪（ZM）地區(qū)熱泉樣點(diǎn)的SOB 包含有Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，而濱達(dá)微（BDW）地區(qū)熱泉樣點(diǎn) 的 SOB 僅 含 有 Betaproteobacteria 與Alphaproteobacteria，表明綱水平上各地區(qū)熱泉中基于soxB基因的SOB 群落結(jié)構(gòu)存在差異。在屬水平上，各熱泉樣點(diǎn)的硫氧化菌不同，屬于Betaproteobacteria 的 OTU 多與Sphaerotilus、Sulfuricella、Sulfuriferula、Thiobacillus、Comamonas相近，存在于DB41、DB5、DB7、DB8、DB10 以及BDW 樣點(diǎn)中。屬于Gammaproteobacteria 的OTU僅在DB8 與ZM1 樣點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)，其中DB8 樣點(diǎn)的OTU 與Thiocapsa相近，ZM1 樣點(diǎn)的OTU 與Thioalkalivibrio相近。屬于Alphaproteobacteria 綱soxB基因OTU 存在于DB1、DB41、DB5、DB8、DB10、ZM1 樣點(diǎn)中，這些OTU 序列與Paracoccus、Roseinatronobacter相近?；赿srA基因的優(yōu)勢(shì)菌綱也為Betaproteobacteria，除樣點(diǎn)DB1、DB5、QS外，其余樣點(diǎn)中Betaproteobacteria 的相對(duì)豐度在50.0%以上（圖4）。在基于dsrA基因的系統(tǒng)發(fā)育中，達(dá)巴（DB）地區(qū)熱泉樣點(diǎn)的 SOB 包含有Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，卻色（QS）和嘎弄（GN）地區(qū)熱泉樣點(diǎn)的 SOB 含有 Betaproteobacteria 和Hydrogenophilalia，而濱達(dá)微（BDW）地區(qū)熱泉樣點(diǎn)中僅發(fā)現(xiàn)Betaproteobacteria，其 中Gammaproteobacteria 僅存在于DB7 樣點(diǎn)中，表明各地區(qū)熱泉水體中dsrA基因型SOB 在綱水平上群落結(jié)構(gòu)也存在差異。在屬水平上，GN 樣點(diǎn)的1 個(gè)OTU 與Ideonella相近（相似度>90.0%），DB7 樣點(diǎn)中7 個(gè)OTU 與Thiothrix（相似度為96.9%）相近。

圖3 基于Neighbor-joining 方法構(gòu)建的soxB 基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of the deduced soxB amino acid sequences translated from the soxB gene OTU clone sequences

圖4 基于Neighbor-joining 方法構(gòu)建的dsrA 基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 4 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of the deduced dsrA amino acid sequences translated from the dsrA gene OTU clone sequences

目水平上，西藏?zé)崛赿srA與soxB基因的SOB 優(yōu)勢(shì)菌及群落結(jié)構(gòu)存在差異?；赿srA基因的SOB 屬于Rhodocyclales、Nitrosomonadales、Burkholderiales、Hydrogenophilales以 及Thiotrichales，優(yōu)勢(shì)菌目為Rhodocyclales，除GN 樣點(diǎn)外，其余樣點(diǎn)中均存在Rhodocyclales，其相對(duì)豐度在各樣點(diǎn)中為33.3%－96.0%。基于soxB基因的SOB 屬于 Nitrosomonadales、Burkholderiales、Hydrogenophilales、Rhodobacterales、Chromatiales，優(yōu)勢(shì)菌目為Nitrosomonadales，除了BDW 樣點(diǎn)外，Nitrosomonadales 相對(duì)豐度在各個(gè)樣品中占30.0%及以上。

2.4 影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子

通過(guò)環(huán)境因子與各樣點(diǎn)硫氧化菌相對(duì)豐度的RDA 分析表明，溫度、SO42?、S2?、pH、HCO3?等是影響西藏東北部熱泉水中硫氧化菌分布的關(guān)鍵環(huán)境因子（圖5）?；赿srA基因的RDA 分析表明（圖5a），GN、DB7 樣點(diǎn)的群落結(jié)構(gòu)分別明顯區(qū)別于其他樣點(diǎn)，其中影響DB7 樣點(diǎn)群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子為HCO3?濃度，而FeT濃度可能對(duì)GN 樣點(diǎn)群落結(jié)構(gòu)的影響較大（圖5a）。HCO3?是衡量堿度的離子之一，表明堿度可能對(duì)DB7 樣點(diǎn)中SOB 的影響較大。在基于soxB基因的RDA 分析中（圖5b），DB8 樣點(diǎn)的群落結(jié)構(gòu)區(qū)別于其他熱泉樣點(diǎn)，這可能是由于DB8 熱泉的水溫更低（(28.5±0.2) ℃）以及pH 值較高（8.01±0.01）（表1）。除DB8 樣點(diǎn)外，其他樣點(diǎn)的SOB 群落結(jié)構(gòu)的差異與SO42?濃度以及S2?濃度存在相關(guān)性（圖5b），表明除DB8 樣點(diǎn)外，其他樣點(diǎn)中SO42?濃度和S2?濃度更能影響熱泉中soxB基因型硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)。S2?與SO42?分別為硫氧化的底物與產(chǎn)物，其在熱泉中的含量影響SOB 的群落組成存在合理性。

圖5 基于各樣點(diǎn)dsrA 基因（a）與soxB 基因（b）的SOB 相對(duì)豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis of SOB relative abundance and environmental factors based on dsrA gene (a)and soxB gene (b)

2.5 不同硫氧化途徑微生物分布特征

通過(guò)qPCR 實(shí)驗(yàn)得到西藏?zé)崛w樣品中soxB、dsrA以及16S rRNA 基因的拷貝數(shù)，并計(jì)算出各個(gè)樣點(diǎn)中soxB與dsrA基因的相對(duì)豐度（表5），即樣品中soxB基因相對(duì)豐度范圍為 0.33%－11.80%，dsrA基因相對(duì)豐度范圍為0.61%－30.25%。由圖6 可以看出，雖soxB與dsrA基因相對(duì)豐度在各樣點(diǎn)中存在差異，但總體來(lái)看，這兩種基因的相對(duì)豐度在熱泉水體環(huán)境中相差不大，表明PSO 以及Dsr 均為熱泉水體中較為重要的硫氧化途徑。通過(guò)RDA 分析熱泉環(huán)境因子對(duì)硫氧化基因相對(duì)豐度的影響（圖7），結(jié)果顯示這兩種硫氧化基因的分布與熱泉水體的AsT濃度、ORP、SO42?濃度、S2?濃度等環(huán)境因子相關(guān)。RDA 分析顯示soxB基因相對(duì)豐度與SO42?濃度、ORP 呈正相關(guān)關(guān)系，與S2?濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖7），表明soxB基因型硫氧化菌更多地存在于偏氧化環(huán)境中，dsrA基因相對(duì)豐度與AsT濃度和HCO3?濃度呈正相關(guān)關(guān)系（圖7），表明dsrA基因型SOB 可能分布于砷濃度、堿度相對(duì)偏高的熱泉。

表5 各樣點(diǎn)中soxB 基因、dsrA 基因、細(xì)菌 16S rRNA 基因拷貝數(shù)及比例Table 5 Abundance and proportion of total bacterial 16S rRNA, soxB and dsrA genes as determined by qPCR

圖6 soxB 基因與dsrA 基因的相對(duì)豐度Figure 6 Relative abundance of soxB gene and dsrA gene

圖7 soxB 與dsrA 基因相對(duì)豐度與環(huán)境因子的RDA 分析Figure 7 RDA analysis of relative abundance of soxB and dsrA genes and environmental factors

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

以往的研究表明西藏?zé)崛练e物基于soxB基因克隆文庫(kù)的 Chao 1 指數(shù)值為 1.0－13.0，Shannon_H 值最高為2.1（甄莉等，2019），與西藏東北部熱泉水體中基于soxB基因克隆文庫(kù)的Chao 1 指數(shù)值（3.0－12.0）和Shannon 指數(shù)值（0.9－2.9）相差不大，表明西藏?zé)崛乃w與沉積物中，基于硫氧化基因soxB的硫氧化菌群落α 多樣性指數(shù)差異不大。與其他環(huán)境中基于硫氧化基因soxB的硫氧化菌群落α 多樣性指數(shù)相比，該研究熱泉水中硫氧化基因soxB基因文庫(kù)的Chao 1 指數(shù)值（3.0－12.0）較小，Shannon 指數(shù)值（最大2.9）卻與其他環(huán)境的無(wú)明顯差異。例如海洋沉積物基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)可達(dá)到104，但Shannon 指數(shù)最高只有4.46（張玉等，2018）；鹽堿湖基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)可達(dá)25，而Shannon 指數(shù)最高也只有2.5（Yang et al.，2013）；五大連池火山群水體基于soxB基因Chao 1 指數(shù)最高為2 165.5，Shannon指數(shù)最低也只有3.71。熱泉基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)值小于其他環(huán)境的Chao 1 指數(shù)值表明熱泉環(huán)境的SOB 物種數(shù)較低，這可能是由于熱泉具有有機(jī)物質(zhì)含量低、溫度高以及溶解氧含量低等特征（Shu et al.，2022）。甄莉等（2019）對(duì)西藏南部熱泉沉積物的研究也表明溶解有機(jī)碳含量越高，基于soxB基因的硫氧化菌α 多樣性越高。

該研究熱泉水中的SOB 主要為Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，這與以往陸地?zé)崛蜓趸芯康慕Y(jié)果具有一定相似性，但還缺少熱泉優(yōu)勢(shì)菌綱Aquificae。以往的研究發(fā)現(xiàn)Aquificae 廣泛存在于60 ℃以上、高硫化物（12 mg·L?1）熱泉中（Skirnisdottir et al.，2000），而本研究中西藏東北部熱泉的溫度普遍低于60 ℃且硫化物質(zhì)量濃度較低[(0.80±0.04)－(2.56±0.02) mg·L?1]。西藏東北部熱泉的SOB 優(yōu)勢(shì)菌綱（Betaproteobacteria）與深海熱液的 SOB 優(yōu)勢(shì)菌綱（ Gammaproteobacteria、Epsilonproteobacteria）（Wang et al.，2018）存在差異，雖然深海熱液與陸地?zé)崛瑸闊岘h(huán)境，但這兩種環(huán)境的形成機(jī)制與化學(xué)成分的差異（Lu et al.，2021）可能導(dǎo)致兩種熱環(huán)境的優(yōu)勢(shì)SOB 不同。此外，Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria 與Gammaproteobacteria 也是西藏南部熱泉沉積物中發(fā)現(xiàn)的主要硫氧化菌綱（甄莉等，2019），這表明在綱水平上，西藏?zé)崛w與沉積物兩種介質(zhì)中的基于soxB基因的硫氧化菌具有一致性。熱泉水中不同的硫氧化途徑可能由不同的SOB 主導(dǎo)，結(jié)合前人研究還發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境中主導(dǎo)相同硫氧化途徑的SOB 也可能不同。例如本研究西藏東北部熱泉中基于dsrA基因與soxB基因的優(yōu)勢(shì)菌目分別為Rhodocyclales 與Nitrosomonadales；而前人對(duì)珠江水體中硫氧化菌的研究表明基于dsrA基因與soxB基因優(yōu)勢(shì)菌目分別為 Nitrosomonadales 與Burkholderiales（Luo et al.，2018）。此外，在本研究的熱泉水與前人研究的熱泉沉積物這兩種介質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了 Rhodocyclales、Nitrosomonadales、Burkholderiales、Rhodobacterales 以及Chromatiales，但熱泉水中未發(fā)現(xiàn) Neisseriales、Rhizobiales、Rhodospirillales；沉積物中未發(fā)現(xiàn)Thiotrichales（甄莉等，2019），這可能是由于研究介質(zhì)和區(qū)域的不同，溫度、pH 等各種理化參數(shù)也存在較大差異?？偟膩?lái)說(shuō)，結(jié)合以往的研究，可以發(fā)現(xiàn)，各環(huán)境中優(yōu)勢(shì)SOB 在綱水平上多為Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria 和Epsilonproteobacteria，由此可見(jiàn)，Proteobacteria 門(mén)可能是各環(huán)境中硫氧化的主導(dǎo)微生物。

在屬水平上，西藏東北部熱泉水中基于soxB基因的硫氧化菌多是常見(jiàn)的硫氧化菌，如Thiobacillus、Sulfuricella、Sulfuriferula，Sphaerotilus、Comamonas的某些菌株能進(jìn)行硫代硫酸鹽的氧化（Pandey et al.，2009；Watanabe et al.，2016）。Paracoccus是常見(jiàn)的無(wú)色硫細(xì)菌屬，在好氧條件下進(jìn)行硫氧化。Thiocapsa與Thioalkalivibrio均為紫硫菌，在光照厭氧條件下進(jìn)行硫代硫酸鹽的氧化，并可能產(chǎn)生代謝中間產(chǎn)物單質(zhì)硫（劉陽(yáng)等，2018）。RoseinatronobacterthiooxidansALG1 是一個(gè)嚴(yán)格的有氧和專(zhuān)性異養(yǎng)菌，在硫代硫酸鹽存在的情況下，其對(duì)有機(jī)碳的利用效率顯著提高（Sorokin et al.，2000），表明西藏?zé)崛械牧蜓h(huán)與碳循環(huán)可能存在聯(lián)系。在基于dsrA基因的硫氧化菌中，Thiothrix能將H2S 氧化為硫粒積累在菌體內(nèi)，后又能將硫粒氧化為SO42?（Chernitsyna et al.，2020）。研究發(fā)現(xiàn)Thiothrix能在高堿度（750 mg·L?1）好氧顆粒污泥中存在，與堿度呈一定的正相關(guān)關(guān)系（Gao et al.，2019）且Thiothrix更適應(yīng)低溫環(huán)境（Abusam et al.，2019）?；赿srA基因的硫氧化菌還包含有Ideonella，該菌屬在熱泉中并不常見(jiàn)，僅在2002 的一篇文章中發(fā)現(xiàn)熱泉篩選到的某菌株的16S rRNA 基因與Ideonelladechloratans相似性較高（相似度92.1%）（Takeda et al.，2002），而Ideonella的硫氧化功能鑒定還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。從結(jié)果來(lái)看，關(guān)于熱泉dsrA基因型SOB 在屬水平上的多樣性有待進(jìn)一步研究。

西藏東北部熱泉水中硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)受堿度、pH、溫度、FeT、SO42?、S2?等環(huán)境因子的影響，這些環(huán)境因子在其他環(huán)境中也表現(xiàn)出對(duì)SOB 的影響。Gupta et al.（2022）的研究表明堿度影響著生物脫硫反應(yīng)器中SOB 的群落組成。Luo et al.（2018）與楊磊等（2020）分別發(fā)現(xiàn)SO42?與S2?也對(duì)火山土壤、珠江中硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。鐵離子與硫氧化菌存在一定相關(guān)性，例如硫氧化菌Sulfobacillusthermosulfidooxidans能在有氧條件下氧化亞鐵離子（Zhang et al.，2019）；Zhao et al.（2020）的研究表明Thiobacillussp.還能在厭氧條件下通過(guò)異化Fe(III)還原獲得能量，然后將單質(zhì)硫氧化為硫酸鹽。溫度和pH 是影響溫泉微生物分布的兩個(gè)最重要的控制因素，例如，在滇西南熱泉中，微生物的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與pH 以及溫度的相關(guān)性（Guo et al.，2021）。研究表明細(xì)菌群落可能會(huì)隨著pH 值的適度變動(dòng)而變化，且pH 值可能通過(guò)直接生理機(jī)制影響細(xì)菌群落，也可能反映其他未測(cè)量因素的間接影響（Chen et al.，2020）。此外，在西藏南部熱泉沉積物硫氧化菌的研究中，基于soxB基因的SOB 群落組成也受到溫度、pH 以及硫化物濃度的影響（甄莉等，2019），表明溫度、pH 以及硫化物濃度可能是影響西藏?zé)崛w以及沉積物中基于soxB基因SOB 群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子。

該研究熱泉水中soxB基因型硫氧化菌更多地存在于偏氧化環(huán)境中，邵博（2019）的研究也顯示氧氣濃度的增加能提高水體中soxB基因的表達(dá)豐度。另外，微生物硫氧化PSO 途徑的Sox 系統(tǒng)不僅能將硫代硫酸鹽直接氧化為硫酸鹽，而且還能將HS?和S0作為適當(dāng)?shù)闹虚g體通過(guò)酶促或非酶促結(jié)合到載體蛋白SoxY 中氧化硫化物和硫（Wu et al.，2021），說(shuō)明Sox 系統(tǒng)在熱泉更多的硫氧化途徑中起重要作用。砷在本研究熱泉水中濃度較高且可能影響含dsrA基因SOB 的分布，除熱泉外，前人的研究表明高砷地下水中dsrA基因豐度也與As 濃度存在關(guān)系，即呈正相關(guān)（Li et al.，2017），這可能是由于硫和砷往往共存于環(huán)境中，并具有相似的微生物氧化還原轉(zhuǎn)化（Wang et al.，2018）。此外，dsrA編碼的蛋白是一種雙向蛋白酶，能進(jìn)行亞硫酸鹽的還原以及胞內(nèi)單質(zhì)硫的氧化，所以高砷地下水中基于dsrA基因的硫相關(guān)微生物不僅包括硫氧化菌，還發(fā)現(xiàn)典型硫酸鹽還原菌Desulfovibrio、Desulfobulbus等（Li et al.，2017），表明在高砷（規(guī)定飲用水中砷含量≤10 μg·L?1）環(huán)境中，As 濃度可能還影響著硫酸鹽還原菌，因此可看出砷可能是影響高砷環(huán)境中硫循環(huán)微生物的關(guān)鍵環(huán)境因子。反之，硫循環(huán)微生物又影響著高砷環(huán)境中砷形態(tài)和價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)變，例如某些硫循環(huán)微生物可直接氧化三價(jià)砷；或氧化硫/還原硫酸鹽造成亞砷酸鹽與硫代硫酸鹽之間的形態(tài)轉(zhuǎn)變（Wang et al.，2018）；或促進(jìn)含砷硫化礦物的形成與溶解（Zecchin et al.，2019）。綜上所述，硫循環(huán)微生物與高砷環(huán)境中的砷含量息息相關(guān)，了解環(huán)境中硫循環(huán)微生物與砷的關(guān)系有助于了解環(huán)境中砷的遷移轉(zhuǎn)化以及對(duì)砷污染的修復(fù)。

3.2 結(jié)論

西藏東北部熱泉水中硫氧化菌主要為Betaproteobacteria，此外，還包括Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia。不同硫氧化途徑由不同SOB 主導(dǎo)，其中基于dsrA基因的優(yōu)勢(shì)硫氧化菌目為Rhodocyclales（33.3%－96.0%），基于soxB基因的優(yōu)勢(shì)硫氧化菌目為Nitrosomonadales（30.0%－91.7%）。溫度、SO42?、S2?、pH 等環(huán)境因子是影響西藏?zé)崛畼又蠸OB 的分布的關(guān)鍵環(huán)境因子，soxB基因型SOB 主要分布于偏氧化的熱泉，而dsrA基因型SOB 主要分布于砷濃度和堿度相對(duì)偏高的熱泉。