骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展

羅家利 呂帥潔 童培建

由創(chuàng)傷、感染或腫瘤切除等因素引起的骨缺損一直是臨床骨科面臨的重大難題，目前自體骨移植仍是骨修復(fù)的常用治療方式。但自體骨移植存在多種問題，如手術(shù)操作繁瑣，自體骨數(shù)量局限，治療效果及預(yù)后不理想等，因此亟需尋求一種新的有效療法來治療骨缺損疾病[1-2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，在骨組織工程領(lǐng)域備受關(guān)注。近年來，有關(guān)BMSCs 治療骨缺損的研究取得了顯著成果，并已證明此療法能有效修復(fù)骨與軟骨缺損[3-4]。本文結(jié)合近年國內(nèi)外BMSCs 的相關(guān)臨床研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BMSCs 定義與生物學(xué)特性

BMSCs 是存在于骨髓基質(zhì)中的一種具有自我更新和多向分化潛能的基質(zhì)細(xì)胞[5]。大量研究證明，無論是在動(dòng)物模型還是在人類臨床試驗(yàn)中，BMSCs 作為多功能干細(xì)胞在骨缺損的維持、修復(fù)、再生中具有多種優(yōu)勢[6]。BMSCs 在骨缺損治療中的主要特性為：（1）多向分化和自我更新能力：在一定條件誘導(dǎo)下，BMSCs 能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞促進(jìn)骨修復(fù)[7]。（2）歸巢能力：BMSCs 能夠遷移到損傷部位，分泌有助于組織再生的趨化因子、細(xì)胞因子以及生長因子，參與損傷區(qū)域重建[8]。（3）免疫調(diào)節(jié)特性：BMSCs 參與免疫調(diào)節(jié)，與損傷部位脫落分子產(chǎn)生強(qiáng)大的旁分泌效應(yīng)，阻斷并保護(hù)其他細(xì)胞免于凋亡[9]。

2 BMSCs 分離與鑒定

BMSCs 因其干細(xì)胞特性和高度可塑性等優(yōu)點(diǎn)而逐步走向臨床，在體外擴(kuò)增之前，從不同外周組織中分離與鑒定BMSCs 是獲得足夠材料進(jìn)行臨床應(yīng)用的關(guān)鍵先決條件。BMSCs 體外分離方法主要有骨髓細(xì)胞貼壁法、密度梯度離心法、膜過濾分離法等[10]。這些方法各有優(yōu)劣，目前從骨髓中分離BMSCs 的常用方法為密度梯度離心法，此種方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要特殊標(biāo)記介質(zhì)，能有效降低對分離后細(xì)胞的影響。但與其他方法相比，密度梯度離心法不能分離具有相似沉降特性的不同類型細(xì)胞[11-12]。由于缺乏唯一特異性標(biāo)志物，目前對BMSCs 的鑒定方法尚未統(tǒng)一。國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT）在2006 年提出了BMSCs的最低定義標(biāo)準(zhǔn)[13]：（1）BMSCs 必須具有貼壁黏附性；（2）BMSCs 必須表達(dá)CD73、CD105 和CD90，但不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、人類白細(xì)胞抗原-DR；（3）BMSCs 必須具有在體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨母細(xì)胞的能力。

3 單純BMSCs 移植應(yīng)用

臨床用于重建大塊骨缺損的治療選擇主要包括骨移植和Ilizarov 牽引成骨技術(shù)，但均存在諸多限制。在骨組織工程領(lǐng)域，利用BMSCs 誘導(dǎo)骨再生修復(fù)骨缺損已受到廣泛關(guān)注[14-15]。依據(jù)骨化途徑，BMSCs的移植應(yīng)用可分為膜內(nèi)植入（直接成骨）和軟骨內(nèi)植入。

3.1膜內(nèi)植入 膜內(nèi)植入為將未分化的BMSCs 單純植入破損骨膜內(nèi)，使其分化為骨祖細(xì)胞形成成骨中心并分泌類骨質(zhì)捕獲成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞，最終修復(fù)缺損骨小梁基質(zhì)和骨膜。Gjerde等[16]將BMSCs 在含有人血小板裂解物的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增，并植入破損骨骨膜下，在骨缺損愈合后對移植部位進(jìn)行活檢，結(jié)果顯示，BMSCs 膜內(nèi)植入顯著誘導(dǎo)了新骨形成，且未觀察到不良反應(yīng)。Zhao等[17]從兔外周血和骨髓中分離純化BMSCs 和內(nèi)皮組細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)，然后將BMSCs 植入部分脫蛋白的生物骨支架，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞與BMSCs 在支架表面生長良好，與單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs組相比，共培養(yǎng)組在促進(jìn)骨缺損修復(fù)的同時(shí)，還誘導(dǎo)了支架上膠原蛋白生產(chǎn)，加速血管和骨的形成。

3.2軟骨內(nèi)植入 骨化涉及BMSCs 的初始凝聚和最終鈣化骨的形成，膜內(nèi)植入直接完成了這一點(diǎn)，而軟骨內(nèi)植入則增加了一個(gè)中間步驟，使BMSCs 向成軟骨細(xì)胞分化，分泌基質(zhì)形成軟骨板和軟骨膜，以此來調(diào)節(jié)缺損骨骼的生長和最終形態(tài)。通過將預(yù)分化的BMSCs 移植到軟骨形成途徑誘導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨是近年來的研究重點(diǎn)[18-20]。研究表明，相較于膜內(nèi)植入，軟骨內(nèi)植入能夠顯著促進(jìn)血管與骨的形成，且更為可控[21]。Harada等[15]將體外預(yù)分化的BMSCs 移植到軟骨內(nèi)形成間充質(zhì)干細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞，并植入大鼠巨大（15 mm）全層股骨缺損中，結(jié)果顯示，2 周時(shí)骨缺損處明顯有新骨形成，8 周時(shí)新形成的皮質(zhì)骨已成骨愈合，8 周后大鼠股骨的平均生物力學(xué)強(qiáng)度達(dá)到了正常大鼠股骨的75%。Farrell等[22]將全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者體內(nèi)提取的BMSCs 分別使用成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)增，然后植入表達(dá)人胎盤堿性磷酸酶轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)的人工支架培養(yǎng)，28 d 后提取支架進(jìn)行組織形態(tài)計(jì)量學(xué)計(jì)算，結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞培養(yǎng)組骨組織占支架構(gòu)筑面積的（24±10）%，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)組骨組織占支架構(gòu)筑面積的（39±7）%，提示體外誘導(dǎo)BMSCs 軟骨分化進(jìn)行體內(nèi)骨修復(fù)效率更高。

4 BMSCs 復(fù)合支架材料應(yīng)用

運(yùn)用組織工程和細(xì)胞生物學(xué)的原理及方法，將人工支架材料復(fù)合BMSCs 對骨缺損組織的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行修復(fù)和改善已取得了相關(guān)突破和進(jìn)展[23]。人工支架具有良好的生物相容性、可吸收性、可降解性，運(yùn)用支架將植入的BMSCs 固定在損傷部位預(yù)定局部環(huán)境有利于組織的再生和適當(dāng)降解，從而克服了自體骨移植的缺點(diǎn)[24]。

4.1傳統(tǒng)支架材料選擇 人工支架與自體骨具有相似的理化性質(zhì)，擁有良好的生物相容性并可誘導(dǎo)成骨分化，這些支架材料必須包含兩個(gè)基本成分：（1）骨礦物，即磷酸鈣和羥基磷灰石；（2）有機(jī)物，如主要的膠原纖維和成骨生長因子等。支架材料主要分為合成高分子材料和天然高分子材料兩大類，合成高分子材料如納米陶瓷、聚乙乳酸、聚乙醇酸等，天然高分子材料如膠原、明膠、殼聚糖等[25-27]。目前生物支架材料的研究熱點(diǎn)是將不同的生物材料進(jìn)行相應(yīng)組合，以制備高性能復(fù)合材料，克服單一支架材料缺陷。Ruan等[24]將絲素蛋白/殼聚糖/納米納米羥基磷灰石（SF/CS/nHA）3D 支架材料單獨(dú)或與BMSCs 復(fù)合應(yīng)用于兔橈骨節(jié)段性缺損處，結(jié)果顯示SF/CS/nHA可促進(jìn)BMSCs 黏附、生長和鈣結(jié)節(jié)形成，提示負(fù)載BMSCs 的SF/CS/nHA 支架具有較高的修復(fù)橈骨節(jié)段性缺損的效果。Zhu等[28]將由微米晶須和納米顆?；旌辖Y(jié)構(gòu)表面（hBCP）組成的硫酸鈣生物陶瓷植入犬長骨缺損模型，與傳統(tǒng)生物支架材料進(jìn)行對比，結(jié)果顯示hBPC 組植入材料內(nèi)有更多新骨形成并具有更高的骨折負(fù)荷，提示微米/納米混雜結(jié)構(gòu)生物陶瓷增強(qiáng)了局部骨缺損的修復(fù)。

4.2新興生物支架技術(shù) 3D 生物打印支架是目前骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。3D 生物打印技術(shù)用于精確分配負(fù)載細(xì)胞的生物材料，以構(gòu)建復(fù)雜的生物支架。該技術(shù)仍處于早期階段，但3D 生物打印技術(shù)具有廣泛的潛在用途，包括修復(fù)骨缺損處皮膚、軟骨和骨骼[29]。在典型骨組織工程方案中，首先制造3D多孔支架，然后加載特定的活細(xì)胞和/或組織誘導(dǎo)生長因子以啟動(dòng)和促進(jìn)缺損骨的再生或替換，與傳統(tǒng)支架相比，3D 生物打印技術(shù)的主要優(yōu)勢在于可以制造細(xì)胞分布可控的支架[19，30]。該項(xiàng)技術(shù)曾被運(yùn)用于制造硫酸鈣支架，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明低溫3D 打印硫酸鈣支架的可行性，目前更多學(xué)者將研究重點(diǎn)放在使用3D生物打印技術(shù)改善支架生物活性、骨誘導(dǎo)性和機(jī)械性能上，開發(fā)更具生物針對性和連貫性的完美支架[31]。Xu等[32]嘗試?yán)帽磉_(dá)Osx 的病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，上調(diào)成骨相關(guān)基因，然后與包裹重組人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的3D 打印多孔支架結(jié)合，使支架具有血管化和成骨誘導(dǎo)特性，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。

5 基于基因工程的BMSCs 應(yīng)用

將特定基因通過腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、桿狀病毒在體外轉(zhuǎn)染至BMSCs，再輸入患者體內(nèi)是目前基因治療骨缺損的主要研究方向。不同有益基因的基因修飾可以改善BMSCs 在損傷部位的成骨效力與修復(fù)能力[33]。轉(zhuǎn)基因BMSCs 的動(dòng)物研究揭示了基因工程臨床應(yīng)用的可能性與廣泛潛力。Kumar等[34]用腺相關(guān)病毒（AAV）載體將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和VEGF 結(jié)合到BMSCs 中，并植入小鼠脛骨缺損模型中，結(jié)果顯示該實(shí)驗(yàn)組小鼠骨修復(fù)效率、骨密度和生物力學(xué)特性均明顯強(qiáng)于對照組，提示組合基因修飾BMSCs 具有臨床潛力。將基因工程運(yùn)用到生物支架目前仍處于動(dòng)物試驗(yàn)階段，研究發(fā)現(xiàn)，基因激活的納米支架在體外和體內(nèi)都能夠誘導(dǎo)功能性基因的可控、持續(xù)釋放，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs 成骨分化，加速修復(fù)臨界大小顱骨缺損[35]。Leng等[36]將骨誘導(dǎo)基因OimRNAs 與陽離子聚合物聚乙烯亞胺復(fù)合，負(fù)載于脫鈣骨基質(zhì)支架（Oi-mRNA/DBM）并植入大鼠臨界顱骨缺損模型，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因支架能夠有效促進(jìn)BMSCs 在體內(nèi)滲透以及成骨分化，加速骨缺損修復(fù)。

6 小結(jié)

骨缺損疾病是骨科臨床上常見的難題。大量臨床實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs 是治療骨缺損疾病的理想化種子。有關(guān)BMSCs 聯(lián)合生物支架、基因工程治療骨缺損的大量臨床前數(shù)據(jù)已經(jīng)積累，未來BMSCs 的發(fā)展方向便是將實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)移到可行性臨床治療上。對于BMSCs 的研究也面臨著實(shí)際問題，例如，由于患者樣本數(shù)少，缺乏對照，以及大多數(shù)選擇這類新興療法的患者通常都是經(jīng)歷過多次手術(shù)或失敗治療的疑難患者，因此將BMSCs 運(yùn)用于骨缺損疾病治療尚需進(jìn)行大樣本、高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。盡管挑戰(zhàn)諸多，但將BMSCs 和相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為可行的骨缺損臨床治療仍具有可觀前景。