腸桿菌目細菌常見碳青霉烯酶耐藥基因多重PCR檢測方法的建立及應用評價*

楊冰雪,易 淼,袁亞玲,黃金珠,夏培雯,黨梓軍,廖佳佳,羅勝利,夏 云△

1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科,重慶 400042; 2.成都市第二人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,四川成都 610000

耐碳青霉烯的腸桿菌目細菌(CRE)是近年來備受關注的條件致病菌,其與院內感染性疾病的發(fā)病率和病死率密切相關[1]。CRE的出現(xiàn)導致多耐藥細菌感染治療最后手段——碳青霉烯類藥物失活,對全球感染控制和疾病治療形成了極大挑戰(zhàn)[2],CRE的流行病學調查和監(jiān)測對臨床感染性疾病的預防和治療具有重要意義。產碳青霉烯酶是CRE最主要的耐藥機制,根據Ambler分類法可將碳青霉烯酶分為 A、B、D 類酶[3];其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)是A類酶的典型代表,作為KPC的主要生產者,肺炎克雷伯菌是世界范圍內最常見的產碳青霉烯酶的腸桿菌目細菌(CPE)[4-5]。2020年我國國家耐藥監(jiān)測網(CHINET,www.chinets.com)數據顯示,2005-2018年肺炎克雷伯菌對亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEM)的耐藥率分別從3.0%上升至25.0%和2.9%上升至26.3%[6]。B類酶又稱金屬β-內酰胺酶,常見的金屬β-內酰胺酶包括維羅納整合子編碼金屬β-內酰胺酶(VIM)、亞胺培南金屬β-內酰胺酶(IMP) 和新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)[7];自2008年首次在印度發(fā)現(xiàn)NDM以來[8],其在腸桿菌科、不動桿菌屬及假單胞菌屬細菌中多有出現(xiàn)[9],我國2017年一項在腸桿菌科細菌和不動桿菌屬細菌中進行的多中心研究表明含有NDM型基因的致病菌在國內廣泛傳播[10]。文獻[11]調查顯示,2018-2019年在四川地區(qū),NDM在CRE中的檢出率達到42.1%。在D類酶中,OXA-48-like則是全球某些地區(qū)腸桿菌目細菌中最常見的碳青霉烯類型,并且正在逐步進入非流行地區(qū),造成院內感染暴發(fā)[12]。編碼碳青霉烯酶的耐藥基因多位于可移動元件上,比如轉座子、整合子和質粒[13]。耐藥基因的水平轉移和傳播可導致CRE在全球范圍內蔓延[14]。目前用于檢測CRE的方法主要有表型檢測和分子檢測。常見的表型檢測方法包括Triton Hodge 試驗、改良 Hodge 試驗、Carba NP 試驗、碳青霉烯滅活法[包括改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)和乙二胺四乙酸(EDTA)改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM)]及碳青霉烯酶抑制劑增強試驗等[15-16]。大多數檢測方法的優(yōu)點是操作簡單,經濟成本低,但最顯著的問題是耗時較長。分子檢測法通常被認為是碳青霉烯酶檢測的金標準[3],普通PCR是最常用的分子檢測方法,但使用PCR逐一檢測耐藥基因的時間成本高,本研究旨在建立一種快速、準確的多重PCR體系,能同時檢測包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48-like在內的5種碳青霉烯酶耐藥基因,并將其運用于臨床分離的CRE菌株檢測,與普通PCR及碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測結果相比較,從靈敏度、特異度、準確度、一致性等方面進行分析,評價該方法的可行性,從而為臨床提供早期診斷、治療依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科2020年6月至2021年9月臨床鑒定為對碳青霉烯類藥物耐藥的(亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度≥4 μg/mL)非重復腸桿菌目細菌共118株和對碳青霉烯類藥物敏感的腸桿菌目細菌9株。其中CRE包括肺炎克雷伯菌68株,大腸埃希菌29株,陰溝腸桿菌16株,布氏檸檬酸桿菌1株,產氣克雷伯菌2株,產酸克雷伯菌1株,弗氏檸檬酸桿菌1株;敏感菌株包括7株肺炎克雷伯菌,2株大腸埃希菌。主要標本來源包括血液、尿液、傷口分泌物、穿刺液、呼吸道標本及膽汁、肛門拭子等。攜帶blaKPC、blaIMP、blaOXA-48-like的肺炎克雷伯菌,攜帶blaVIM 的銅綠假單胞菌和攜帶blaNDM的大腸埃希菌作為陽性對照,均由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗科微生物實驗室保存。

1.2儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套板卡(法國生物梅里埃公司);PCR擴增儀(ABI公司);電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);哥倫比亞血瓊脂平板及MH平板(重慶龐通公司);美羅培南藥敏紙片(Oxoid公司);DNA分子量標記物DL2000、Taq酶(TaKaRa公司);瓊脂糖(Hydragene公司);本試驗所用引物合成及擴增產物測序均來自北京擎科生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定及藥敏試驗 收集非重復臨床標本分離株,使用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀進行細菌鑒定及藥敏試驗,將收集的碳青霉烯類藥物耐藥菌株及敏感菌株-80 ℃冷凍保存。

1.3.2碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 根據A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸(APB)抑制,金屬β-內酰胺酶的活性可被EDTA抑制原理,使用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗對試驗菌株進行碳青霉烯酶表型鑒定,具體操作步驟如下:將待測菌調節(jié)成0.5麥氏濃度的菌液,均勻涂布于MH培養(yǎng)基上,隨后貼4張美羅培南紙片(10 μg),在其中兩張紙片上分別滴加APB、EDTA溶液,另一張紙片上同時滴加兩種溶液,最后一張紙片不滴加任何溶液留作空白對照?？諝猸h(huán)境,(35±2)℃培養(yǎng)16～18 h后分別測量4個抑菌圈直徑(dr)。判讀標準:若dr美羅培南+APB-dr美羅培南≥5 mm,則可認為受試菌株產A類酶,若dr美羅培南+EDTA-dr美羅培南≥ 5 mm,則可認為受試菌株產B類酶,若dr美羅培南+EDTA+APB-dr美羅培南≥ 5 mm,則可認為受試菌株同時產A類酶和B類酶。

1.3.3DNA提取 本試驗采用煮沸裂解法提取細菌DNA。將-80 ℃儲存的分離菌復蘇后接種在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)16～18 h,取單個菌落懸浮于1 000 μL蒸餾水中,95 ℃煮沸10 min,在4 ℃,13 000 r/min離心混合物10 min,分離上清液作為DNA樣本保留,并儲存于-20 ℃。

1.3.4引物設計 下載Bate-Lactamase數據庫(http://bldb.eu/BLDB.php?prot=A#GES)已公布的blaKPC基因序列[17],使用軟件ClustalXe 2.0進行序列比對,選擇高度同源區(qū)域,使用primer premier 5 進行blaKPC引物設計。根據已發(fā)表的文獻下載blaNDM,blaIMP,blaVIM,blaOXA-48-like引物[18-19,1]。引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。見表1。

表1 5種碳青霉烯酶耐藥基因擴增引物

1.3.5普通PCR 普通PCR反應體系:premix taq 12.5 μL,正反向引物各(10 μm)1.0 μL,DNA 模板1.5 μL,加雙蒸水(ddH2O)補足至25.0 μL。反應條件:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,57 ℃ (blaKPC、blaNDM、blaVIM)/55 ℃ (blaIMP、blaOXA-48-like) 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán),72 ℃ 7 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,產物送基因測序,測序結果在NCBI網站進行Blast 比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/),確定基因型。

1.3.6多重PCR 多重PCR反應條件采用25.0 μL體系:premix taq 12.5 μL,5種不同引物構成比例見表1,DNA模板1.5 μL,加ddH2O補足25.0 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s,57 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 7 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS25.0 進行數據分析,配對卡方檢驗用于試驗結果分析,采用靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度評價多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗與普通PCR的有效性。Cohen′s kappa (κ)系數評估多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗與普通PCR 的檢測一致性。κ系數的比較含義:κ>0.75,一致性極好;κ為0.40～0.75,檢測方法之間存在一致性;κ<0.40,檢測方法之間一致性較差,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1多重PCR檢測5種碳青霉烯酶耐藥基因 建立多重 PCR 體系,分別擴增含有blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48-like基因的DNA陽性對照模板;另將5種陽性對照DNA模板按等比例混合后進行多重PCR擴增;考慮到多重PCR反應過程中存在引物二聚體及非特異擴增風險增加的問題,另對8株碳青霉烯類藥物敏感的腸桿菌目細菌進行擴增,用于評估多重PCR的正確性。擴增結果使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。在最佳反應條件下,多重PCR能分別正確擴增出5種不同的耐藥基因,也能在單次反應中同時識別出多種耐藥基因(圖1A),整體擴增體系較為穩(wěn)定,對敏感菌的擴增產物中幾乎不含有非特異性擴增產物(圖1B)。

注:A表示使用多重PCR擴增含有5種碳青霉烯酶耐藥基因的陽性DNA模板,泳道m(xù)為2 000 bp DNA分子量標記物;泳道A～E依次為NDM、KPC、OXA、VIM、IMP;泳道H為單次多重PCR擴增同時含有5種耐藥基因的模板混合物;B表示多重PCR體系擴增對碳青霉類藥物敏感的腸桿菌目細菌DNA;泳道m(xù)～E與A的注解相同,泳道F～N為多重PCR擴增8株對碳青霉烯類藥物敏感菌DNA結果。

2.2普通PCR與多重PCR檢測結果比較 藥敏試驗確定127株細菌中包含9株對碳青霉烯類藥物敏感菌及118株對碳青霉類藥物耐藥菌。普通PCR檢測含有碳青霉烯酶耐藥基因CRE菌株96株(81.36%,96/118),耐藥但不含碳青霉烯酶耐藥基因菌株22株(18.64%,22/118),碳青霉烯酶耐藥基因以blaKPC和blaNDM為主,分別占39.83%(47/118)和38.14%(45/118);含有blaKPC的菌株全部為肺炎克雷伯菌,而含有blaNDM的菌株包括肺炎克雷伯菌9株,大腸埃希菌22株,陰溝腸桿菌12株,弗氏檸檬酸桿菌1株,產酸克雷伯菌1株;共表達blaKPC+blaNDM 3株,包括產氣克雷伯菌,布氏檸檬酸桿菌及肺炎克雷伯菌。多重PCR檢測118株CRE中包含碳青霉烯酶耐藥基因菌株85株(72.03%;85/118);耐藥但不含碳青霉烯酶耐藥基因菌株33株(27.97%;33/118),其中22株與普通PCR檢測結果完全一致,另外11株為普通PCR檢測含有碳青霉烯酶耐藥基因但多重PCR檢測為不含碳青霉烯酶耐藥基因的CRE。在檢測結果不一致的11株CRE菌株中,包括表達blaKPC的4株肺炎克雷伯菌和表達blaNDM的1株肺炎克雷伯菌、 3株大腸埃希菌、2 株陰溝腸桿菌及 1株產酸克雷伯菌;9株敏感菌的多重PCR檢測結果與普通PCR檢測結果一致。共表達blaKPC+blaNDM的3株CRE的多重PCR檢測結果與普通PCR檢測結果一致。見表2。

表2 普通PCR和多重PCR檢測腸桿菌目細菌結果對比(n)

2.3多重PCR與碳青霉烯酶抑制劑增強試驗的耐藥表型檢測結果比較 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗耐藥表型檢測共含有94株產A類酶或B類酶的CRE和24株不產碳青霉烯酶的CRE。在產A類酶46株耐藥菌中,多重PCR檢測含有blaKPC基因CRE 43株;產B類酶的48株耐藥菌中,多重PCR檢測含有blaNDM基因CRE 38株;碳青霉烯酶抑制劑增強試驗表型檢測中未檢測到同時產A+B類酶的菌株,但多重PCR檢測到3株共表達blaKPC+blaNDM基因耐藥菌株;多重PCR檢測含有blaOXA-48-like的菌株碳青霉抑制劑增強試驗表型檢測為不產酶CRE。見表3。

表3 多重PCR和碳青霉酶抑制劑增強試驗檢測127株腸桿菌目細菌基因型及耐藥表型(n)

2.4多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結果分析 以普通PCR檢測方法作為參考,多重PCR檢測靈敏度為88.54%,特異度為100.00%,κ值為0.79。碳青霉抑制劑增強試驗檢測靈敏度為92.71%,特異度為93.55%,κ值為0.81。在CRE檢測中,多重PCR檢測的靈敏度稍低于碳青霉烯酶抑制劑增強試驗(88.54%vs.92.71%),但多重PCR比抑制劑增強試驗檢測擁有更好的特異度(100.00%vs.93.55%),見表4。多重PCR和碳青霉烯抑制劑增強試驗在陽性率檢測上比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),并且二者擁有良好的檢測一致性(κ=0.63)。見表5。

表4 多重PCR和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗和普通PCR檢測結果分析

3 討 論

CRE的出現(xiàn),尤其是對碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌,給發(fā)達國家和發(fā)展中國家的公共醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)造成極大威脅和負擔[20-21]。CRE的傳播具有極高的隱匿性,相對于無癥狀感染者或定植人群,CRE的實驗室陽性病例報告數比例約為1∶100[22],而其他兩類人群可以向陽性病例轉化[23]。因此建立一種快速、準確的實驗室方法用于檢測CRE,為臨床早期提供診斷治療依據具有重要意義。目前,一線臨床實驗室用于檢測CRE及其耐藥表型最常用的方法包括抗菌藥物藥敏試驗和紙片擴散法等,雖然操作簡便但其耗時較長,臨床報告時間在16～24 h,且無法明確具體的碳青霉烯酶類型。本研究建立多重 PCR 檢測法,可在單次試驗中快速篩查5種常見的碳青霉烯酶耐藥基因,并可基于耐藥基因檢測結果預測耐藥表型,與現(xiàn)有檢測方法相比,多重PCR可在3～4 h獲得檢測結果,大幅縮短臨床報告時間,為早期臨床診療提供可靠依據。

在本研究中發(fā)現(xiàn)22株(17.3%,22/127)不產碳青霉烯酶的CRE,其耐藥機制可能是染色體突變(如孔蛋白基因突變、外排泵過表達和(或)青霉素結合蛋白改變)和獲得性非碳青霉烯耐藥機制(如超廣譜β-內酰胺酶的表達獲取或上調、產AmpC酶)[24]。多重 PCR 對這類耐藥細菌的檢測能力有限,但文獻[25]研究證實,CPE病死率(32.4%)高于不產碳青霉烯酶CRE (13.0%),故對CPE的檢測更為重要。3株由多重PCR檢測發(fā)現(xiàn)共表達blaKPC+blaNDM的菌株在碳青霉烯抑制劑增強試驗表型檢測中僅表達一類酶,這可能是因為在缺乏抗菌藥物壓力的傳代培養(yǎng)下,含有耐藥基因的質粒缺乏穩(wěn)定性而丟失[26],導致表型檢測假陰性。7株碳青霉烯酶抑制劑增強試驗表型檢測為產B類酶的CRE在多重PCR檢測中并未檢出相應耐藥基因,可能是因為多重PCR體系引物種類較多,在擴增過程干擾風險增加,因此更難獲得較長片段產物。

此外,1株多重PCR檢測含有blaOXA-48-like耐藥基因的肺炎克雷伯菌在碳青霉烯酶抑制劑增強試驗表型檢測中為假陰性,由于表型檢測中試劑APB、EDTA僅能抑制A類酶和B類酶而對D類酶沒有影響,故不能檢測OXA-48型碳青霉烯酶[27],說明相較于表型檢測,多重PCR在CRE的監(jiān)測中更具全面性。blaOXA-48-like經測序后序列對比鑒定為blaOXA-181。blaOXA-181被認為是除blaOXA-48外最常見的blaOXA-48-like基因,常出現(xiàn)在大腸埃希菌中,目前發(fā)現(xiàn)的blaOXA-181幾乎都位于含有Tn2013的lncX3質粒上[28]。我國最早關于blaOXA-181的報道是文獻[29]發(fā)現(xiàn)的1株大腸埃希菌,本研究中發(fā)現(xiàn)含有blaOXA-181的是肺炎克雷伯菌,耐藥基因在腸桿菌目細菌之間的傳播及基因分子特性值得進一步探究。

近年來,基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、免疫層析法及基于生物發(fā)光技術的碳青霉烯酶藥敏試驗檢測等多種新技術被應用于碳青霉烯酶的檢測[30-32]。這些技術擁有操作簡單、省時的優(yōu)點,但技術設備、耗材及人力成本昂貴,難以在大量基層醫(yī)療機構中展開。目前也有其他多重PCR 技術的報道,例如,YOSHIOKA等[33]使用COBAS?z480同時檢測6種碳青霉烯酶耐藥基因,雖然其時間成本低于多重 PCR,但由于設備的限制需將6種基因分次構建為同時檢測3組耐藥基因的分組,增加了操作過程的復雜性,另外檢測過程中熒光探針的使用也增加了經濟成本。相比之下,多重PCR使用普通PCR設備即可完成,且操作步驟簡單,能快速、方便、準確檢測腸桿菌目細菌中5種常見碳青霉烯酶耐藥基因,與目前臨床應用的碳青霉烯酶抑制劑增強試驗在CRE及其表型檢測結果上具有良好的一致性,極大縮短臨床報告時間,在CRE的監(jiān)測調查中發(fā)揮良好作用,適用于臨床實踐中展開推廣。