可溶性共刺激分子sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義分析*

周 娟,黃莉莉,芮 棵,張 慧△

1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科,江蘇蘇州 215002;2.江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院檢驗科,江蘇鎮(zhèn)江 212001

近年來,隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式和飲食習(xí)慣的改變,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均有所上升[1]。如果結(jié)直腸癌患者在轉(zhuǎn)移前得到診斷和治療,5年生存率可達(dá)68%,一旦出現(xiàn)浸潤,存活率降至31%,如果發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,則患者存活率急降至5%[2]。目前對于結(jié)直腸癌的診斷及進(jìn)程的判斷,主要依賴于組織病理檢查。因此,亟需尋找合適的無創(chuàng)血清標(biāo)志物用以評判患者的病理特征及進(jìn)展情況。隨著腫瘤免疫和腫瘤微環(huán)境研究的不斷深入,多種共刺激分子成為了目前腫瘤免疫干預(yù)的重要靶點,針對程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)、程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1(PD-L1)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4的多種單抗在臨床抗腫瘤應(yīng)用中顯示出卓越的療效,使得負(fù)性B7 家族免疫檢查點分子在腫瘤免疫治療中的前景受到空前關(guān)注。PD-L1、B7同源體3(B7-H3)、B7同源體4(B7-H4)是目前研究比較多的免疫共刺激分子。近年來越來越多的實驗證實,除了膜表達(dá),這些共刺激分子的可溶性形式在多種實體腫瘤患者血清中異常表達(dá),并且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān),提示這些可溶性分子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[3]。但多種可溶性共刺激分子的比較分析在腫瘤中的研究較少。本研究對68例結(jié)直腸癌患者血清可溶性PD-L1(sPD-L1)、可溶性B7-H3(sB7-H3)、可溶性B7-H4(sB7-H4)表達(dá)水平及與患者的臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究,以期探索sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4在結(jié)直腸癌腫瘤診斷及預(yù)后評判中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 血清標(biāo)本收集于2021年1—12月在江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院確診的68例結(jié)直腸癌患者(結(jié)直腸癌組),年齡38～84歲,男45例,女23例。結(jié)直腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌;(2)術(shù)前未進(jìn)行過任何放、化療,無其他腫瘤史,且臨床病理及隨訪信息均齊全;(3)排除其他系統(tǒng)的疾病。選取同期28例經(jīng)腸鏡檢查確診為良性病變(腸道息肉5例、慢性腸炎23例)患者的血清標(biāo)本作為良性病變組,年齡38～70歲,男17例,女11例。選取同期20例體檢健康者的血清標(biāo)本作為健康對照組,年齡30～75歲,男13例,女7例。各組人群資料見表1。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),受試者均知情同意。

1.2血清收集 采集入組者空腹靜脈血2 mL,置于含促凝劑和分離膠的真空采集管中,室溫下3 000×g離心15 min后,分離血清,置于-80 ℃冰箱凍存。禁止樣本反復(fù)凍融或加熱。

1.3血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測結(jié)直腸癌患者血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表達(dá)水平。sPD-L1表達(dá)水平檢測按照人sPD-L1 ELISA試劑盒 (英國Abcam公司) 說明書進(jìn)行。簡述如下:(1)將所有檢測試劑在室溫平衡30 min;(2)取50 μL樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照加入酶標(biāo)板微孔中,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.00、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 pg/mL。室溫孵育1 h;(3)棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次;(4)加100 μL 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)顯色液至每個酶標(biāo)板微孔中,孵育10 min;(5)加100 μL終止液,在450 nm讀取吸光度(A值)。sB7-H3表達(dá)水平檢測按照人sB7-H3檢測試劑盒(蘇州旭光科星抗體生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。簡述如下:(1)將所有檢測試劑在室溫平衡30 min;(2)取100 μL樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照加入酶標(biāo)板微孔中,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 000.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63 pg/mL。室溫孵育2 h;(3)棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次;洗板:(4)加檢測抗體:加入稀釋好的Antibody-Bio 每孔100 μL,蓋上封板膜,37 ℃孵育1 h。(5)棄去孔內(nèi)液體,洗板3遍。(6)加入Avidin-HRP工作液每孔100 μL,蓋上封板膜,37 ℃孵育1 h。(7)洗板6遍,棄去孔內(nèi)液體。(8)加入TMB,每孔100 μL,室溫避光孵育約15 min。(9)加100 μL終止液,在450 nm讀取A值。sB7-H4表達(dá)水平檢測按照人sB7-H4 ELISA試劑盒(英國Abcam公司)說明書進(jìn)行。簡述如下:(1)將所有檢測試劑在室溫平衡30 min;(2)取50 μL樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照加入酶標(biāo)板微孔中,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、23、47、94、188、375、750、1 500 pg/mL。室溫孵育1 h;(3)棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次;(4)加100 μL TMB顯色液至每個酶標(biāo)板微孔中,孵育10 min;(5)加100 μL終止液,在450 nm讀取吸光度(A值)。最后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)的A值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,帶入樣品的A值,計算sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4的實際表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表達(dá)水平 結(jié)直腸癌組 sPD-L1表達(dá)水平為(0.519±0.082)ng/mL,良性病變組和健康對照組sPD-L1表達(dá)水平分別為(0.501±0.057)、(0.436±0.048)ng/mL,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);結(jié)直腸癌組 sB7-H3表達(dá)水平為(9.128±0.509)ng/mL,良性病變組和健康對照組sB7-H3表達(dá)水平分別為(7.029±0.293)、(6.701±0.373)ng/mL,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);結(jié)直腸癌組 sB7-H4表達(dá)水平為(45.093±6.891)ng/mL,良性病變組和健康對照組sB7-H4表達(dá)水平分別為(30.005±5.271)、(24.684±4.149)ng/mL,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表達(dá)水平比較

2.2結(jié)直腸癌患者中血清可溶性共刺激分子的診斷價值 通過ROC曲線分析,當(dāng)sPD-L1作為區(qū)分結(jié)直腸癌組和良性病變組、健康對照組的診斷指標(biāo)時,截斷值(Cut-off值)為0.466 ng/mL,靈敏度為70.59%(95%CI:58.89%～80.08%),特異度為45.83%(95%CI:32.58%～59.71%)。曲線下面積(AUC)為0.569 1(95%CI:0.463 5～0.674 7),P=0.206 2;當(dāng)sB7-H3作為區(qū)分結(jié)直腸癌組和良性病變組、健康對照組的診斷指標(biāo)時,Cut-off值為6.940 ng/mL,靈敏度為69.12%(95%CI:57.36%～78.83%),特異度為58.33%(95%CI:44.28%～71.15%),AUC為0.680 5(95%CI:0.584 8～0.776 1),P=0.001 0;而當(dāng)sB7-H4作為區(qū)分結(jié)直腸癌組和良性病變組、健康對照組的診斷指標(biāo)時,Cut-off值為18.61 ng/mL,靈敏度為58.82%(95%CI:46.96%～69.74%),特異度為50.00%(95%CI:36.39%～63.61%)。AUC為0.569 5(95%CI:0.463 8～0.675 3),P=0.203 2。

2.3結(jié)直腸癌患者血清sPD-L1、sB7-H4、sB7-H3表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 將sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表達(dá)水平分別與患者的性別、年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、分化程度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)通過非配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示,sPD-L1表達(dá)水平與患者的各種病理參數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。sB7-H3表達(dá)水平與患者腫瘤最大徑,TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.042 4、0.006 3、0.037 2);與腫瘤最大徑<5 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較,腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清sB7-H3表達(dá)水平顯著增高。sB7-H4水平則與患者TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.037 2、0.007 8);與TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較,TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清sB7-H4表達(dá)水平明顯增加。見表2。

表2 血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率第三高的腫瘤,也是全球第二大癌癥死亡原因。2020年,全球約有190萬新發(fā)結(jié)直腸癌患者,935 000例結(jié)直腸癌患者死亡[4]。多項研究表明在腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)的PD-L1、B7-H3、B7-H4等共刺激分子與多種實體腫瘤的進(jìn)展,及預(yù)后相關(guān),可作為腫瘤治療的靶點及預(yù)測腫瘤進(jìn)展的分子標(biāo)志[5-9]。目前,檢測這些負(fù)性共刺激分子在腫瘤細(xì)胞表達(dá)水平,主要通過對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化分析,而病理組織的取樣對患者創(chuàng)傷較大。血清中出現(xiàn)的這些B7家族可溶性蛋白的來源被認(rèn)為是腫瘤組織中高表達(dá)的細(xì)胞分泌并釋放入血的。因此,血清中可溶性B7分子蛋白的表達(dá)水平一定程度上反映病變組織的B7分子表達(dá)水平,這是本課題的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示,與健康對照組相比,結(jié)直腸癌組血清sPD-L1水平并沒有顯著增加,同時sPD-L1水平也與患者的病理參數(shù)無明顯相關(guān),這與WU等[10]在胰腺癌患者中研究結(jié)果相類似。但是腫瘤患者血清sPD-L1水平是否與患者的臨床病理參數(shù)具有相關(guān)性,不同的研究得出了不同的結(jié)論[5,11]。這提示不同細(xì)胞表達(dá)的PD-L1在腫瘤進(jìn)展中的作用不盡相同。很重要的一個原因是不同腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)差異很大,且很多腫瘤的PD-L1表達(dá)率整體較低[12]。在非小細(xì)胞肺癌治療中患者PD-L1的表達(dá)率>1%時,帕博利珠單抗(抗PD1單抗)就可以使一線化療失敗的肺癌患者獲益[13]。相對于B7-H3和B7-H4在多種腫瘤組織中廣泛的表達(dá),PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)水平并不高[14],這也許是sPD-L1在腫瘤患者血清中表達(dá)不高的原因。同樣,較少的sPD-L1進(jìn)入血液循環(huán)也使sPD-L1表達(dá)水平很難作為結(jié)直腸癌患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示,與腫瘤最大徑<5 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較,腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清sB7-H3表達(dá)水平顯著增高,這與在卵巢癌、膀胱癌及骨癌中研究結(jié)果相一致[3]。與sPD-L1不同,結(jié)直腸癌組sB7-H3表達(dá)水平顯著高于健康對照組(P=0.013 6)。同樣與腸癌組織的PD-L1表達(dá)水平不同,有研究顯示,B7-H3在腸癌組織中有超過50%的表達(dá)率,而在正常組織中則低表達(dá)[6],提示B7-H3是一種腫瘤特異性標(biāo)志物。這種腫瘤組織的表達(dá)差異很可能是血清sB7-H3表達(dá)具有結(jié)直腸癌診斷潛能的原因。HUANG等[15]研究也發(fā)現(xiàn),血清sB7-H3與胃癌組織中腫瘤細(xì)胞來源的B7-H3表達(dá)具有很強(qiáng)的相關(guān)性,提示sB7-H3主要來源于腫瘤細(xì)胞表達(dá)的膜型B7-H3,而非腫瘤微環(huán)境中表達(dá)的膜型B7-H3。這些研究結(jié)果提示,結(jié)直腸癌患者血清sB7-H3可能參與了疾病進(jìn)程,其表達(dá)水平的異常增加可作為結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后判斷的潛在的分子標(biāo)志。

目前有研究指出,對于sB7-H4在腫瘤中的診斷價值研究結(jié)論不一致,MACH等[7]研究發(fā)現(xiàn),僅有14%的卵巢上皮癌患者血清中可以檢測到sB7-H4,且血清sB7-H4表達(dá)水平與患者的FIGO分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、順鉑的耐藥性等病理參數(shù)無相關(guān)性。而在肝癌、腎癌的研究中,sB7-H4與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、TNM分期顯著相關(guān)[3]。本研究結(jié)直腸癌患者的sB7-H4表達(dá)水平高于健康對照組,但由于腫瘤患者之間差異很大(變異系數(shù)高),因此結(jié)果并無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.101 7)。有研究報道B7-H4與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),包括腸癌、胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[3,16]。盡管B7-H4介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未明確,但B7-H4與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有很強(qiáng)的相關(guān)性,本研究結(jié)果也說明了除了腫瘤細(xì)胞膜表面的B7-H4以外、可溶性B7-H4也與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,考慮到sB7-H4與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.007 8),盡管血清sB7-H4表達(dá)水平不是診斷結(jié)直腸癌的良好分子指標(biāo),但卻是預(yù)測腫瘤不良進(jìn)展,特別是預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的優(yōu)良指標(biāo)。

目前,市面上有多種可溶性共刺激分子的ELISA檢測試劑盒,由于包被/檢測抗體的不同,以及不同試劑制作過程中的差異導(dǎo)致同一種可溶性共刺激分子的不同檢測試劑盒之間存在較大的濃度量值差異,量值溯源很難統(tǒng)一。因此,相對于可溶性共刺激分子的絕對表達(dá)水平,同一試劑盒檢測的相對表達(dá)水平差異更具有參考價值。但隨著可溶性共刺激分子應(yīng)用范圍的不斷拓展,量值溯源,統(tǒng)一蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,建立標(biāo)準(zhǔn)參考系統(tǒng),更有利于可溶性共刺激分子的臨床應(yīng)用。

綜上所述,結(jié)直腸癌患者血清sB7-H3表達(dá)水平顯著升高,是診斷結(jié)直腸癌疾病的良好標(biāo)志物。血清sB7-H3表達(dá)水平與患者的多項病理參數(shù)相關(guān),可作為結(jié)直腸癌進(jìn)展與預(yù)后判斷的潛在分子標(biāo)志,而血清sB7-H4表達(dá)水平則是判斷結(jié)直腸癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的優(yōu)良分子標(biāo)志物。