胰腺癌組織中MIB1、MAL2表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

朱加娣,吳 宏,陳玲玲,張 晶

如皋市人民醫(yī)院普外科,江蘇如皋 226599

胰腺癌是侵襲性較高的惡性腫瘤,是癌癥相關(guān)死亡的第七大原因[1]。由于解剖位置隱匿,臨床早期癥狀不典型,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已為晚期,生存預(yù)后較差,5年生存率僅10%[2]。深入研究胰腺癌的生物標(biāo)志物,有利于胰腺癌早期診治及預(yù)后判斷。Mindbomb同源物1(MIB1)基因編碼蛋白含多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和 RING 指結(jié)構(gòu)域,具有E3泛素連接酶的活性,參與Notch信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn),MIB1在多形性腺瘤,顱腦惡性腫瘤等腫瘤中表達(dá)上調(diào),其能通過影響腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[3-4]。T細(xì)胞分化蛋白2(MAL2)基因編碼蛋白是一種多跨膜蛋白,是參與構(gòu)成脂筏的一種成分,能夠?qū)⒛そY(jié)合蛋白和外源性物質(zhì)從細(xì)胞基底外側(cè)傳遞到頂端表面。近年來發(fā)現(xiàn),MAL2在乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高,通過內(nèi)吞降解細(xì)胞表面腫瘤抗原,導(dǎo)致免疫細(xì)胞不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞,介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[5-6]。本研究通過檢測MIB1、MAL2在胰腺癌中的表達(dá),探討兩者的臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年1月本院診治的82例胰腺癌患者作為研究對(duì)象。研究對(duì)象中男44例、女38例,平均(56.47±3.47)歲,腫瘤最大徑為1.8～7.2 cm,平均(3.56±1.18)cm。研究對(duì)象按照腫瘤部位分為胰頭部57例,胰體尾部25例;按照分化程度分為高中分化52例,低分化30例;按照臨床分期分為Ⅰ～ⅡA 期42例,ⅡB～Ⅲ 期40例;按照有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為胰腺癌,由兩位病理醫(yī)師共同閱片診斷;(2)既往無放化療等腫瘤治療史;(3)患者能夠配合相關(guān)檢查及治療,臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)伴有嚴(yán)重心肺功能衰竭;(3)患者存在精神障礙性疾病,不能配合相關(guān)治療及隨訪。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

1.2MIB1、MAL2蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測癌及癌旁組織中MIB1、MAL2蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟按照免疫組化兩步法試劑盒說明書進(jìn)行操作(北京中杉金橋,貨號(hào)PV6000)。兔抗人MIB1、MAL2單克隆抗體購自英國abcam公司(貨號(hào)ab124929、 ab1217919),一抗稀釋工作濃度均為1∶100。根據(jù)鏡下免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分與染色面積評(píng)分的乘積進(jìn)行半定量免疫組化染色評(píng)分。免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分:無染色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;染色面積評(píng)分:陽性面積<25%計(jì)1分,25%～<50%計(jì)2分,50%～<75%計(jì)3分,≥75%計(jì)4分。染色深度評(píng)分與染色面積評(píng)分的乘積≥2分為陽性,染色深度評(píng)分與染色面積評(píng)分的乘積<2分為陰性。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測組織MIB1、MAL2 mRNA表達(dá) 用Trizol法提取組織中總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列由上海華大公司設(shè)計(jì)合成。引物序列為MIB1正向:5′-ATGAGTAACTCCCGGAATAACCG-3′,反向:5′- GCCGTTGTCCCACACTACC-3′;MAL2正向:5′-ATCATTGGCATTCGATGGAAG T-3′,反向:5′-CCCGGTGTAGTAATTCGGTAAA A-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向:5′-CAGCCAGAGGAATCTTTGCAG-3′,反向:5′-CCTTTCCCCTACGTCCATTTC-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 變性30 s,62 ℃退火30 s,70 ℃ 延伸30 s,共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系:SYBR Green premix 10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 模板2 μL和ddH2O 6 mL。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法表示MIB1、MAL2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。分別以MIB1、MAL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的平均值3.02、6.65作為閾值,分為MIB1 mRNA高表達(dá)(MIB1 mRNA≥3.02)患者40例(MIB1 mRNA高表達(dá)組)和MIB1 mRNA低表達(dá)(MIB1 mRNA<3.02)患者42例(MIB1 mRNA低表達(dá)組),MAL2 mRNA高表達(dá)(MAL2 mRNA≥6.65)患者43例(MAL2 mRNA高表達(dá)組)和MAL2 mRNA低表達(dá)(MAL2 mRNA<6.65)患者39例(MAL2 mRNA低表達(dá)組)。

1.4隨訪 所有患者出院后開始進(jìn)行定期隨訪,以門診復(fù)查隨訪或電話隨訪,每個(gè)月隨訪一次,隨訪內(nèi)容為患者生存狀態(tài)。所有患者隨訪兩年,隨訪截至2022年2月。

2 結(jié) 果

2.1胰腺癌組織及癌旁組織MIB1、MAL2蛋白表達(dá) 胰腺癌組織中MIB1及MAL2蛋白黃褐色陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。胰腺癌組織中MIB1陽性表達(dá)率為95.12%(78/82),顯著高于癌旁組織7.32%(6/82),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=126.514,P<0.05)。胰腺癌組織中MAL2陽性表達(dá)率97.56%(80/82),顯著高于癌旁組織9.76%(8/82),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=127.120,P<0.05)。見圖1。

圖1 胰腺癌組織及癌旁組織中MIB1、MAL2蛋白表達(dá)(×200)

2.2胰腺癌及癌旁組織MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)及相關(guān)性 胰腺癌組織中MIB1、MAL2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(3.02±0.66)、(6.65±1.19),明顯高于癌旁組織(1.83±0.40)、(3.56±0.68),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.963、20.415,P<0.05)。見圖2。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織中MIB1與MAL2 mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.427,P<0.05)。

注:與癌旁組織比較,*P<0.05。

2.3胰腺癌組織中MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 不同腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌組織中MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),不同年齡、性別、分化程度、腫瘤最大徑及腫瘤部位癌組織中MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 MIB1 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為8.62(7.40,9.84)個(gè)月、17.86(15.73,19.99)個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果,MIB1 mRNA高表達(dá)組患者累積生存率顯著低于低表達(dá)組患者(χ2=39.338,P<0.001)。MAL2 mRNA低表達(dá)組和高表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為7.14(6.94,8.53)個(gè)月、18.63(15.34,20.50)個(gè)月。MAL2 mRNA高表達(dá)組患者累積生存率顯著低于低表達(dá)組患者(χ2=50.306,P<0.001)。見圖3。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析MIB1、MAL2 mRNA表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.5單因素及多因素COX回歸分析影響胰腺癌患者預(yù)后的因素 以胰腺癌患者的生存狀態(tài)為因變量(賦值:1=死亡,0=存活),納入年齡(賦值:1=≥60歲,0=<60歲)、性別(賦值:1=男,0=女)、腫瘤最大徑(賦值:1=≥4 cm,0=<4 cm)、腫瘤位置(賦值:1=胰頭部,0=胰體尾部)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值:1=有,0=無)、腫瘤分期(賦值:1=ⅡB～Ⅲ期,0=Ⅰ～ⅡA期)、分化程度(賦值:1=低分化,0=高中分化)、MIB1 mRNA(賦值:1=高表達(dá),0=低表達(dá))、MAL2 mRNA(賦值:1=高表達(dá),0=低表達(dá))為自變量,進(jìn)行單因素COX回歸分析。結(jié)果腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MIB1 mRNA、MAL2 mRNA與胰腺癌患者預(yù)后有關(guān)。多因素COX回歸分析,結(jié)果腫瘤分期ⅡB～Ⅲ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MIB1 mRNA高表達(dá)、MAL2 mRNA高表達(dá)是影響胰腺癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2、3。

表2 影響胰腺癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析

表3 影響胰腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

胰腺癌腫瘤異質(zhì)性高,具有生長速度快、轉(zhuǎn)移潛能高、容易產(chǎn)生化療耐藥等特點(diǎn)[7]。盡管最近在癌癥治療方面取得了進(jìn)展,但胰腺癌患者的預(yù)后仍然極差。近年來,臨床上采用腫瘤分期,分化程度等對(duì)胰腺癌臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,但仍然難以預(yù)測不同胰腺癌患者個(gè)體的臨床預(yù)后結(jié)果[8]。因此,揭示胰腺癌的發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效的腫瘤分子標(biāo)志物,有助于胰腺癌患者的臨床診治及改善患者的臨床預(yù)后。

MIB1是一種E3泛素連接酶,可以泛素化Notch配體Delta蛋白,調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移或細(xì)胞衰老等生物學(xué)過程[9]。本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn),MIB1陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,其原因與MIB1的E3泛素連接酶功能有關(guān),MIB1能夠泛素化細(xì)胞膜表面的Notch受體,并促進(jìn)其內(nèi)吞,發(fā)揮激活Notch下游通路的效應(yīng)[10]。本研究中,胰腺癌組織中MIB1 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高,這與FU等[11]利用人類腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中分析的研究結(jié)果報(bào)道一致,提示MIB1可能參與胰腺癌的疾病發(fā)生。胰腺癌中MIB1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與非編碼RNA表達(dá)調(diào)控有關(guān)。研究表明,微小RNA-198能夠靶向調(diào)節(jié)MIB1 mRNA的穩(wěn)定性,腫瘤細(xì)胞中微小RNA-198的表達(dá)下調(diào)引起MIB1 mRNA的穩(wěn)定性增加,促進(jìn)MIB1的蛋白表達(dá),促進(jìn)腫瘤的增殖[12]。本研究中,MIB1表達(dá)與胰腺癌腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示MIB1促進(jìn)胰腺癌的腫瘤進(jìn)展。ZHANG等[13]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),胰腺癌腫瘤細(xì)胞中MIB1的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)抑癌因子致瘤蛋白7的泛素化降解,激活含IQ結(jié)構(gòu)域的GTP激酶活化蛋白1的表達(dá),導(dǎo)致胰腺癌腫瘤細(xì)胞的過度增殖。尚有學(xué)者發(fā)現(xiàn),MIB1能夠通過激活β連環(huán)蛋白的表達(dá),增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的過度增殖及淋巴轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[11]。因此,胰腺癌中MIB1是一種致癌因子,其表達(dá)升高參與促進(jìn)胰腺癌的腫瘤進(jìn)展。研究表明,胰腺癌中Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的過度激活能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性形成[14]。因此,推測MIB1的表達(dá)可能與胰腺癌的臨床預(yù)后有關(guān)。本研究中證實(shí),MIB1 mRNA高表達(dá)是胰腺癌患者生存預(yù)后較差,是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。臨床上,醫(yī)師可以利用胰腺癌癌組織中MIB1的表達(dá)對(duì)患者的臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,對(duì)高危患者進(jìn)行個(gè)體化的治療,以改善患者的生存預(yù)后。

MAL2編碼基因位于8q24.12,屬于蛋白脂質(zhì)家族的成員[15]。MAL2是一種多跨膜蛋白,是脂筏構(gòu)成成分,參與MAL2蛋白的胞吞及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)膜結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能,這與本研究中MAL2蛋白黃褐色陽性染色定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)果一致。近年來發(fā)現(xiàn),MAL2在乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),通過激活胰島素生長因子1受體等癌基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[16-17]。WANG等[18]對(duì)胰腺癌中影響患者預(yù)后的RNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),MAL2mRNA表達(dá)明顯升高,這與本研究報(bào)道結(jié)果一致,但本研究進(jìn)一步在蛋白水平證實(shí)胰腺癌中MAL2表達(dá)升高,提示MAL2表達(dá)可能參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。BHANDARI等[19]研究發(fā)現(xiàn),MAL2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。本研究中,MAL2表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示MAL2表達(dá)升高參與促進(jìn)胰腺癌腫瘤進(jìn)展。FANG等[5]報(bào)道,MAL2的表達(dá)增加能夠通過促進(jìn)如MHC-Ⅰ復(fù)合物和腫瘤相關(guān)抗原等細(xì)胞表面蛋白抗原的內(nèi)吞降解,抑制腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究中,MAL2 mRNA高表達(dá)的胰腺癌患者臨床預(yù)后較差,是患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,表明MAL2可能是新的胰腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步分析MIB1與MAL2表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示兩者在胰腺癌中可能存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌腫瘤細(xì)胞中MAL2能夠與IQGAP1結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2的磷酸化,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20],而胰腺癌中MIB1能促進(jìn)IQGAP1的表達(dá)[12]。因此,胰腺癌中MIB1與MAL2可能是通過調(diào)控IQGAP1的表達(dá),共同促進(jìn)胰腺癌的腫瘤進(jìn)展。但具體作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述,胰腺癌中MIB1、MAL2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高,兩者表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),是影響胰腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。臨床上可根據(jù)胰腺癌組織中MIB1、MAL2的表達(dá)情況,對(duì)患者的臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,并采取相應(yīng)的治療及隨訪方案,以改善患者的臨床預(yù)后。但本研究由于樣本量有限,并且未對(duì)兩者的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入探討,有待今后擴(kuò)大樣本含量,尚需大樣本及納入更多因素的研究予以進(jìn)一步驗(yàn)證。