Vitek2 Compact AST-P639中國定制藥敏卡對金黃色葡萄球菌體外藥敏、耐藥表型及AES修正能力評估

梁美春 王萍 張小姣 何秋麗 呂黎 周宜慶 張海旺 茅國峰 王朵

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染最重要和最具挑戰(zhàn)性的病原體之一，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus au‐reus，MRSA）引起抗菌藥物耐藥性不斷增加而越來越受到人們的關(guān)注。因此快速準確的藥敏結(jié)果對臨床實現(xiàn)快、準、狠的個性化抗感染精準治療顯得尤為重要。目前臨床微生物實驗室的體外藥敏試驗多數(shù)采用Vitek2 Compact全自動細菌藥敏分析系統(tǒng)，其自帶的高級專家系統(tǒng)（advanced expert system，AES）可對細菌的藥敏結(jié)果進行自動判斷，根據(jù)藥敏結(jié)果綜合分析篩選出MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗，并根據(jù)耐藥表型對藥敏結(jié)果進行修正。2016年，梅里埃公司聯(lián)合中國的行業(yè)專家共同定制出了更符合中國臨床需求的藥敏卡即中國定制藥敏卡，其中包括革蘭陽性球菌AST-P639藥敏卡，該卡在原來卡片的基礎(chǔ)上刪除了四環(huán)素、呋喃妥因，增加了頭孢洛林、達托霉素、替考拉寧等，基本覆蓋了臨床常用的各類抗菌藥物，無需手工補貼藥敏紙片。為評估AST-P639中國定制藥敏卡（以下稱中國定制卡）對金黃色葡萄球菌體外藥敏、MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗、AES修正能力的準確性和可靠性，本研究以美國臨床和實驗標準化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法、D試驗及PCR測mecA、mecC基因為參考方法，對中國定制卡的可靠性進行評估，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2020年5月至2021年9月紹興市人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)金黃色葡萄球菌100株，其中痰液35株，膿液15株，手術(shù)切緣14株，分泌物14株，血液6株，滲出液11株，其余5株。

1.2 方法標本采集和培養(yǎng)參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版進行，血瓊脂平板購于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3 儀器與試劑采用梅里埃Vitek MS質(zhì)譜鑒定儀及Vitek2 Compact型自動微生物藥敏儀，配套中國定制卡，均購自法國梅里埃公司。萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達托霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平同時采用微量肉湯稀釋法進行藥敏檢測，試劑購自溫州康泰生物科技有限公司（批號：VE06160）。紅霉素紙片（規(guī)格：15 μg，批號：3380421）、克林霉素紙片（規(guī)格：2 μg，批號：3443630）購自英國Oxoid公司；MH瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；PCR儀購自美國塞默飛公司（型號：7300PLUS）；Taq酶和PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自杭州擎科生物工程有限公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司（型號：EPS-300）；紫外成像系統(tǒng)為購自法國Teleflex Incorporated公司（型號：TFX-20M）。

1.4 藥敏試驗質(zhì)譜儀鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，采用PCR方法檢測金黃色葡萄球菌特異性熱核酸酶基因nucA[1]確認菌株為金黃色葡萄球菌。采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，按照CLSIM100 S31[2]判定結(jié)果；中國定制卡的操作按照廠家說明書進行，藥敏結(jié)果根據(jù)系統(tǒng)自帶專家系統(tǒng)自動給出，質(zhì)控菌株采用ATCC29213。

1.5 MRSA表型測定及基因確證試驗中國定制卡以頭孢西丁6.00 μg/mL篩選MRSA表型，并根據(jù)頭孢西丁表型結(jié)果對苯唑西林的藥敏結(jié)果進行修正；采用常規(guī)PCR檢測mecA、mecC基因進行確證。MRSA陽性質(zhì)控菌株為ATCC43300，MRSA陰性質(zhì)控菌株為ATCC29213。

1.6 DNA的提取用無菌環(huán)挑取適量金黃色葡萄球菌單個菌落，于300 μL 0.9%氯化鈉注射液中研磨混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，收集菌體。嚴格按照細菌DNA提取試劑盒說明書進行操作,并對提取后的DNA使用超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度和純度。

1.7 mecA、mecC基因PCR擴增mecA、mecC基因的擴增根據(jù)參考文獻[3-4]進行，引物序列委托杭州擎科生物工程有限公司合成。擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.8 紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗D試驗參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版，紅霉素紙片、克林霉素紙片中心點相距為15～20 mm，在靠近紅霉素紙片一側(cè)克林霉素的抑菌環(huán)有截平現(xiàn)象，即D試驗陽性。中國定制卡采用微量肉湯稀釋法，以克林霉素0.5 μg/mL和紅霉素0.25 μg/mL來監(jiān)測紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥，如果2個孔都明顯渾濁或都不渾濁，則為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陰性，如果第1個孔不渾濁而第2個孔渾濁則為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性。AES根據(jù)紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性結(jié)果，對克林霉素藥敏結(jié)果進行修正。

1.9 相關(guān)定義極大錯誤（very major error，VME）：參考方法判讀為耐藥，待測方法為敏感；大錯誤（major error，ME）：參考方法判讀為敏感，待測方法為耐藥；小錯誤（minor error，MIE）：任何一方為中介，另一方為敏感或耐藥。分類一致性（categorical agreement，CA）：待測方法與參考方法判讀結(jié)果的一致性，如兩者均判讀為敏感、中介或耐藥[5]。

1.10 方法學(xué)比對當待測方法與參考方法的比對結(jié)果同時完全滿足以下要求時，則為可接受：VME＜1.50%、ME＜3.00%、VME+ME＜5.00%、VME+ME+MIE均＜10.00%（即CA＞90.00%）[5]。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理采用WHONET 5.6軟件和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.90為一致性非常好，0.75＜Kappa值＜0.90為一致性較好，0.4＜Kappa值≤0.75為一致性中等，Kappa值≤0.4為一致性較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中國定制卡體外藥敏結(jié)果可靠性分析與參考方法比較，中國定制卡對金黃色葡萄球菌體外藥敏CA為95.38%，VME、ME、MIE分別為0.31%、3.77%、0.54%，均在可接受范圍內(nèi)。其中萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達托霉素CA均為100.00%，紅霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平的CA分別為95.00%、94.00%、98.00%、97.00%。紅霉素的VME為1.00%，ME為2.00%，MIE為2.00%；左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平的ME均為2.00%，利福平出現(xiàn)了1.00%的MIE，而左氧氟沙星出現(xiàn)了4.00%的MIE范圍，但均在可接受范圍內(nèi)。見表1。

表1 中國定制卡與參考方法間的差異性分析

2.2 MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗結(jié)果可靠性分析將100株金黃色葡萄球菌進行DNA提取，采用PCR方法檢測mecA、mecC基因，檢出mecA 71株，未檢出mecC菌株；采用中國定制卡篩選出69株MRSA菌株，CA為98.00%。中國定制卡69株MRSA菌株均檢出mecA基因，2株mecA基因在對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）中檢出。擴增結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴增金葡菌mecA基因凝膠電泳圖

中國定制卡檢出紅霉素耐藥、克林霉素敏感菌株30株，紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性28株，陽性率為93.33%（28/30）；D試驗檢出紅霉素耐藥、克林霉素敏感菌株27株，D試驗陽性27株，陽性率為100.00%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其中紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗2種方法的CA為97.00%。

2.3 中國定制卡與參考方法的一致性檢驗中國定制卡與參考方法一致性較好（Kappa=0.87，P＜0.01），其中萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達托霉素與參考方法完全一致（Kappa=1.00，P＜0.01），MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗的一致性非常好（Kappa=0.95、0.93，均P＜0.01），克林霉素的一致性較差（Kappa=0.36，P＜0.01），苯唑西林、紅霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、利福平的一致性均為中等。見表1。2.4 AES修正結(jié)果分析及AES修正能力評估中國定制卡檢出35株苯唑西林敏感菌株，因頭孢西丁篩選陽性，AES將4株苯唑西林敏感菌株修正為耐藥，與參考方法比較修正前CA為97.00%，出現(xiàn)了1.00%VME和2.00%ME。AES修正后雖然CA下降為95.00%，ME也上升至5.00%，但避免了VME的出現(xiàn)。被AES修正為耐藥的4株苯唑西林敏感菌株，經(jīng)PCR證實均攜帶mecA基因，為MRSA菌株。中國定制卡檢出73株克林霉素敏感菌株，因紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性，AES將28株克林霉素敏感株修正為耐藥，修正前克林霉素CA為92.00%，VME為1.00%、ME為7.00%；AES修正后雖然避免了VME，但CA下降至66.00%，ME也升至34.00%，遠超出了VME+ME+MIE＜10.00%的可接受范圍。被AES修正的28株菌株經(jīng)D試驗證實，26株為D試驗陽性，即AES存在7.14%（2/28）的錯誤修正率，見表1。

3 討論

Vitek2 Compact全自動細菌藥敏儀自動化流程操作簡便，實現(xiàn)動態(tài)觀察，方便快捷。既往研究表明Vitek2 Compact全自動細菌藥敏儀在測定臨床常用抗菌藥物的體外藥敏、常見耐藥表型[5]和AES修正系統(tǒng)[6]具有較好的可靠性。中國定制卡對金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果、耐藥表型鑒定和AES修正能力目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，中國定制卡對金黃色葡萄球菌體外藥敏的CA為95.38%，略低于田月如等[7]報道的中國定制卡，略高于喬寧等[8]報道的非定制卡，其中萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷與參考方法完全一致（CA均為100.00%，Kappa均為1.00，均P＜0.05），由于萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷、達托霉素對大多數(shù)革蘭陽性菌具有很強的抗菌作用，據(jù)CH‐NET網(wǎng)（http://www.chinets.com/Chinet）顯示，截至2022年上半年止，我國未檢測出對萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷耐藥的金黃色葡萄球菌，所以不能排除因無耐藥菌株而導(dǎo)致的高一致性。復(fù)方新諾明、利福平、左氧氟沙星、紅霉素的CA均＞90.00%，但均出現(xiàn)了不同程度的ME，紅霉素甚至出現(xiàn)了1.00%的VME，這可能會誤導(dǎo)臨床醫(yī)師錯誤選擇抗菌藥物而導(dǎo)致治療失敗。紅霉素、左氧氟沙星、利福平分別出現(xiàn)了2.00%、4.00%、1.00%的MIE，提示在中介范圍內(nèi)的抗菌藥物應(yīng)謹慎使用。

MRSA的耐藥機制主要是由mecA基因編碼與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力低的PBP2a[9]。mecC基因與mecA基因在DNA水平上約有70%相似性，在氨基酸水平上有63%同源性[10]。mecC基因主要與動物有關(guān)，在人類中的患病率極低[11]，目前也德國、英國、丹麥、捷克檢出[4，9-10]，國內(nèi)未見相關(guān)報道，本研究也未檢出mecC基因。中國定制卡篩選的MRSA表型與PCR方法一致性非常好（Kappa=0.95，P＜0.05），CA為98.00%，略高于魏丹丹等[12]報道的非中國定制卡。中國定制卡篩選的MRSA菌株均檢出mecA基因，2株mecA基因在MSSA菌株中檢出，表明定制卡篩選MRSA準確性高，但還是會有2%（2/100）的漏檢，應(yīng)引起關(guān)注。

苯唑西林不一致的結(jié)果中，1例菌株肉湯稀釋法判讀為耐藥，而中國定制卡在AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對相對耐藥；5株菌株肉湯稀釋法判讀為敏感而中國定制卡判讀為耐藥，其中3株AES修正為相對耐藥，即苯唑西林在AES修正前出現(xiàn)了1.00%的VME，修正后出現(xiàn)了5.00%的ME，同時修正后的CA值略低于修正前，但在AES修正為相對耐藥的4株苯唑西林敏感菌株中均檢出mecA基因，即與AES修正相符。多數(shù)情況下攜帶mecA基因或產(chǎn)生PBP2a的金黃色葡萄球菌對苯唑西林耐藥，中國定制卡檢出6株，肉湯稀釋法檢出7株苯唑西林敏感mecA基因陽性菌株（OS-MRSA），其中中國定制卡中4株苯唑西林敏感菌株AES將其修正為耐藥，即中國定制卡檢出2株、肉湯稀釋法檢出7株OS-MRSA菌株。有研究認為OSMRSA菌株的出現(xiàn)可能與PBP2a蛋白的低表達[13]、me‐cA基因的不穩(wěn)定[14]、青霉素結(jié)合蛋白4（PBP4）和Fem酶活性以及blaR1基因[15]的缺乏有關(guān)，其機制有待于進一步研究。提示當存在OS-MRSA菌株時，中國定制卡AES修正結(jié)果的可靠性較高，可適當避免上述原因造成臨床治療失敗。

克林霉素具有優(yōu)越的藥代動力學(xué)，能口服、經(jīng)濟、有效穿透組織的能力、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，被臨床廣泛應(yīng)用于革蘭陽性菌引起的感染，尤其可作為青霉素和頭孢菌素過敏患者的首選藥物。紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性表現(xiàn)為紅霉素耐藥而克林霉素敏感，但在實際治療中克林霉素的治療是無效的，故紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗結(jié)果可為臨床規(guī)范使用抗菌藥物提供指導(dǎo)。本研究中國定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗與D試驗一致性非常好（Kappa=0.93，P＜0.01，CA=97.00%），與報道一致[16]。中國定制卡檢出紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陽性而D試驗陰性菌株2株，中國定制卡檢出紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗陰性而D試驗陽性菌株1例，其中國定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥陽性率（93.33%）低于D試驗（100.00%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且均高于相關(guān)報道[17]，這可能與各地區(qū)用藥情況和耐藥基因差異有關(guān)。提示中國定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉耐藥的準確性非常高，但應(yīng)注意假陽性和假陰性的發(fā)生。

克林霉素不一致的結(jié)果中，1株肉湯稀釋法判讀為耐藥，中國定制卡在AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對相對耐藥；27株肉湯稀釋法判讀為敏感，中國定制卡AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對相對耐藥；修正前出現(xiàn)了1.00%的VME，修正后雖然出現(xiàn)了很高的ME（34.00%），一致性也較差（Kappa=0.36），但可以避免誘導(dǎo)性耐藥而錯誤的選擇無效抗菌藥物，同時應(yīng)注意AES對克林霉素存在的錯誤修正率（7.14%）。因本研究未對erm基因進行檢測，故不能排除中國定制卡對紅霉素誘導(dǎo)克林霉耐藥表型的準確性、AES錯誤修正率存在一定的影響。

綜上所述，Vitek2 Compact AST-P639中國定制藥敏卡對金黃色葡萄球菌體外藥敏、MRSA表型、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥的篩選有高的準確性，AES對苯唑西林、克林霉素的修正結(jié)果可以有效避免抗菌藥物的錯誤選擇，存在很好的可靠性，且實現(xiàn)了自動化，是微生物日常工作中理想的檢測工具。但由于本研究納入的菌株數(shù)量較少，只對部分抗菌藥物進行評估，結(jié)果存在一定的局限性，為使研究結(jié)果更加準確可靠，有待增加菌株和抗菌藥物以作進一步研究。