丹參和甘草提取物抗菌、抗炎作用研究

鐘承志 吳德松 顏宏 郭琰 龔呂東 李婷

摘要：目的 考查丹參和甘草提取物樣品體外抗菌、體內抗炎作用。

方法 （1）采用肉湯連續(xù)二倍微孔稀釋法測定丹參和甘草提取物樣品對痤瘡丙酸桿菌ATCC11827最小抑菌濃度（MIC）；（2）采用內耳廓皮內注射丙酸桿菌建立大鼠痤瘡模型，測定丹參和甘草提取物樣品對丙酸桿菌致炎大鼠耳廓腫脹度的影響；（3）采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法，測定丹參和甘草提取物樣品對二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹度的影響。

結果 （1）體外抗菌實驗結果顯示，丹參和甘草提取物體外對痤瘡丙酸桿菌MIC值分別為16 mg/mL、12.5 mg/mL。（2）丙酸桿菌致炎大鼠痤瘡模型實驗結果顯示，丹參和甘草提取物可明顯降低丙酸桿菌致炎大鼠耳廓腫脹度（P<0.05）。（3）二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗結果顯示，與溶媒組比較，丹參和甘草提取物連續(xù)涂藥7 d，均可明顯降低二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹度（P<0.05）。

結論 丹參和甘草提取物具有抗菌、抗炎及抗痤瘡感染作用，能被廣泛用作化妝品原料藥。

關鍵詞：丹參；甘草；抗菌；抗炎；痤瘡

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2023）07-0001-03

Study on Antibacterial and Anti-Inflammatory Effects of Extractsfrom Salvia Miltiorrhiza and Licorice

ZHONG Cheng-zhi1， 2， WU De-song1， 2， YAN Hong1， 2， GUO Yan1， 2， GONG Lv-dong1， 2， LI Ting1， 2

（1. Yunnan Institute of Materia Medica， Kunming 650111， China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Ethnodrug New Drug Development Enterprise of Yunnan， Kunming 650111， China）

【Abstract】Objective： To study the antibacterial and anti-inflammatory effects of extracts from salvia miltiorrhiza and licorice in vitro. Methods： （1） The minimum inhibitory concentration （MIC） of salvia miltiorrhiza and licorice extract samples against propionibacterium acnes ATCC11827 was determined by continuous two-fold microporous dilution method. （2） The acne model of rats was established by injecting propionibacterium into the inner auricle skin， and the effect of salvia miltiorrhiza and licorice extract samples on the swelling degree of auricle induced by propionibacterium was measured. （3） The effect of salvia miltiorrhiza and licorice extract on the degree of auricle swelling in the mice induced by xylene was determined by the method of xylene induced auricle swelling. Results： （1） The results of antibacterial experiment in vitro showed that the MIC values of salvia miltiorrhiza extract against propionibacterium acnes in vitro were 16 mg/mL and 12.5 mg/mL， respectively. （2） The experimental results of acne model of rats induced by propionibacterium inflammation showed that the extract of salvia miltiorrhiza and licorice could significantly reduce the degree of auricle swelling in the rats induced by propionibacterium inflammation （P<0.05）. （3） The experimental results of ear swelling induced by xylene in the mice showed that compared with the solvent group， the salvia miltiorrhiza and licorice extract applied continuously for 7 days could significantly reduce the ear swelling of mice induced by xylene inflammation （P<0.05）. Conclusion： The extracts of salvia miltiorrhiza and licorice have antibacterial， anti-inflammatory and anti-acne effects， and can be widely used as cosmetic raw materials.

【Key words】Salvia Miltiorrhiza; Licorice; Antibacterial; Anti-Inflammatory; Acne

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，性微寒、味苦，入心、經肝，具有活血化瘀，解毒涼血，消腫止痛，療瘡止痢等功效，常用于婦科病、冠心病、缺血性中風、動脈粥樣硬化、血栓閉塞性脈管炎、遷延性和慢性肝炎等癥的治療［1］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)丹參對心血管系統(tǒng)有顯著影響，對脂質代謝及中樞神經系統(tǒng)都有作用，抗菌作用及降血糖作用明顯［2］。有研究表明丹參對金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株、大腸埃希菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、分枝桿菌、人結核桿菌等都有明顯抑殺作用，臨床應用于痤瘡及一般化膿性感染［3-6］。另外，有研究表明［7］丹參提取物在護膚方面具有抗氧化、消炎、抗衰老等作用。

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）又名甜草根、粉草、國老等，為豆科甘草屬（Glycyrrhiza L.）多年生草本植物干燥的根及根莖，味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清肺解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明［8-11］甘草具有保肝，抗菌消炎，抗氧化衰老，抗病毒，降糖降脂，抗動脈粥樣硬化，抗腫瘤，鎮(zhèn)咳祛痰，潤喉，解熱等多種藥理活性，被廣泛應用在醫(yī)藥、化妝品、食品等領域。有研究顯示［12］甘草醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性細菌具有顯著抑菌作用。

近年來，雖然國內對丹參和甘草提取物的抑菌特性進行了一些研究，但對其在痤瘡方面的研究較少，為進一步了解丹參和甘草提取物在痤瘡方面的治療作用，本研究通過體外測定痤瘡丙酸桿菌MIC值和體內抗痤瘡感染及對二甲苯所致急性炎癥的抑制作用，來探討丹參和甘草提取物的抗痤瘡和抗炎作用，為其在化妝品方面的研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品制備 丹參提取物制備：取丹參藥材置烘箱中，50℃干燥，粉碎，過60目篩，為丹參干燥粉末。精密稱取丹參干燥粉末8 g，加水50 mL，加熱回流提取1 h，放置至室溫，過濾，濾液濃縮并轉移至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。丹參提取液濃度為320 mg/mL。

甘草提取物制備：稱取甘草粗粉適量，24倍量體積的蒸餾水，99℃下提取2 h。用三層紗布過濾，將濾液在3000 r/min的轉速下離心3 min；取上清液，過濾后用蒸餾水定容至生藥濃度250 mg/mL。

1.1.2 菌株 痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes ATCC11827，購自美國特殊物種貯藏中心（ATCC），保存于云南省藥物研究所藥理研究室。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基配制：沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，取本品50 g，加適量純化水攪拌溶解后定容至1000 mL，分裝，121℃高壓滅菌15 min，取出待其冷卻后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

固體培養(yǎng)基配制：沙氏瓊脂培養(yǎng)基配制：將沙氏液體培養(yǎng)基與10 g瓊脂粉混合，定容至500 mL，使瓊脂濃度達到2%，121℃高壓滅菌15 min，當溶液溫度達到50℃左右時傾倒于滅菌培養(yǎng)皿（直徑=90 mm）中，待其凝固后倒置放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 實驗動物 SPF級SD大鼠（220±20 g）（雌雄各半）、KM小鼠（20～2 g）（全雄），均由廣東醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物飼養(yǎng)管理：塑料盒群養(yǎng)，雌雄分籠，每日飼喂大小鼠生長繁殖飼料，自由飲水，視情況每周更換2～3次墊料。飼料來源于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.1.5 主要試劑 復方醋酸地塞米松乳膏（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：1807006S），紅霉素軟膏（馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司，批號：180811），注射用美羅培南（住友制藥有限公司，批號：160901）；二甲苯（AR）（廣東光華化學廠有限公司，批號：20080508）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140619）；沙氏培養(yǎng)基（Oxoid，批號：CM0147）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20150608）。

1.1.6 主要儀器 JJ2000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠生產；SQP型電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司生產；THZ-D型臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設備廠；Multiskan GO全波長酶標儀，美國Thermo公司；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參和甘草提取物體外對丙酸桿菌MIC值測定［13］ 從菌落平板上挑選丙酸桿菌單克隆，接種于沙氏液體培養(yǎng)基中，37℃、100 rpm/min厭氧振蕩培養(yǎng)168 h。再以37℃、200 rpm/min厭氧振蕩培養(yǎng)48 h。細菌活化后調整細菌濃度調整為1×106 CFU/mL，96孔培養(yǎng)板每排第一孔內加入190 μL菌液，第二至第十二孔均加入100 μL菌液，分別將受試樣品10 μL加入第一孔中，混勻后吸取100 μL菌液加入第二孔中，依次對倍稀釋。同時，設立菌液對照、培養(yǎng)基對照、溶媒對照、陽性對照。其中，溶媒對照和陽性對照加入方法和步驟同受試樣品。將盛有丙酸桿菌的培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，溶液清亮表示無菌生長，溶液混濁表示有菌生長，讀出抑制細菌生長的最低樣品濃度（Minimal Inhibition Concentration，MIC）即為最小抑菌濃度。

1.2.2 丹參和甘草提取物對丙酸桿菌致炎大鼠痤瘡模型耳廓腫脹的影響［14-15］ 參照上述方法進行細菌培養(yǎng)，調整細菌濃度為6×107 CFU/mL。選取體重200～20 g大鼠，動物右耳廓皮內注射備用丙酸桿菌菌液（100 μL/只），注射后3 d，選取造模成功的動物（模型成功標準：注射丙酸桿菌側耳廓出現(xiàn)一個明顯的白色或黃色痘狀突起。）隨機分為模型組、紅霉素組、丹參提取物組、甘草提取物組，10只/組，雌雄各半。各給藥組動物右耳廓均勻涂布各受試樣品（100 μL/只），單層覆蓋。模型組涂布純水（100 μL/只），連續(xù)5 d，1次/d。每隔24 h用千分尺測量一次大鼠左、右耳廓厚度，連續(xù)5 d。計算各組動物耳廓腫脹度，耳廓腫脹度=右耳廓厚度-左耳廓厚度，比較各組動物耳廓腫脹度差異。

1.2.3 丹參和甘草提取物對二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹的影響［16］ 選取SPF級KM小鼠，全雄（20～2 g），隨機分為溶媒組、地塞米松組、丹參提取物組、甘草提取物組，10只/組。各給藥組動物右耳廓均勻涂布各受試樣品（50 μL/只），單層覆蓋。溶媒組涂布純水（50 μL/只），連續(xù)7 d，1次/d。于末次涂藥后1 h，將二甲苯均勻涂布于各組動物右耳廓造模（50 μL/只）。致炎后1 h將動物處死，剪下雙耳用7 mm直徑打孔器分別在同一部位打下耳片稱重。右耳片重量減去左耳片重量即為耳廓腫脹度，將各組耳廓腫脹度進行統(tǒng)計學分析并比較組間差異。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異比較用單因素方差分析P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丹參和甘草提取物體外抗菌作用 結果顯示，菌液對照長菌，培養(yǎng)基對照無菌生長，表明培養(yǎng)基無污染；溶媒對照均有菌生長，表明溶媒對細菌生長無影響。丹參提取物和甘草提取物體外對痤瘡丙酸桿菌ATCC11827 MIC值分別為16 mg/mL、12.5 mg/mL。見表1。

2.2 丹參和甘草提取物對丙酸桿菌致炎大鼠痤瘡模型耳廓腫脹的影響 結果顯示，與模型組比較，陽性對照紅霉素于連續(xù)涂藥第4、5 d，可明顯降低丙酸桿菌致炎大鼠痤瘡模型耳廓腫脹度，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。與模型組比較，丹參提取物和甘草提取物連續(xù)涂藥5 d，均可明顯降低丙酸桿菌致炎大鼠痤瘡模型耳廓腫脹度，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表2。

2.3 丹參和甘草提取物對二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹的影響 結果表明，與溶媒組比較，陽性對照地塞米松連續(xù)涂藥7 d，可明顯降低二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹度，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。與溶媒組比較，丹參提取物和甘草提取物連續(xù)涂藥7 d，均可明顯降低二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹度，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表3。

3 討論

尋常痤瘡是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，具有一定的損容性，主要與雄激素及皮脂增加、毛囊皮脂腺開口處過度角化、痤瘡丙酸桿菌感染及繼發(fā)炎癥反應等四大原因相關。其中作為主要的條件致病菌，痤瘡丙酸桿菌的數(shù)量與疾病嚴重程度密切相關。由于抗生素的使用監(jiān)管不利，使得耐藥痤瘡桿菌的比例逐年上升，而且存在交叉耐藥，嚴重影響了尋常痤瘡的臨床治療。因此，從植物中尋找新的天然抗菌藥物成為治療痤瘡的方向［17］。

本研究結果顯示，丹參和甘草提取物體外對痤瘡丙酸桿菌均有抑制作用，且對體內痤瘡丙酸桿菌致炎的大鼠耳廓腫脹度有抑制作用，說明丹參和甘草提取物對細菌生長具有直接抑制作用，且通過局部涂抹給藥發(fā)揮消炎作用。二甲苯可使小鼠耳廓毛細血管通透性增加，造成局部急性滲出性炎癥水腫，常用于驗證藥物的抗炎作用。研究顯示丹參和甘草提取物均可顯著抑制二甲苯導致的小鼠耳廓腫脹，表明丹參和甘草提取物對非特異性急性炎癥具有顯著的療效。丹參和甘草提取物作為一種天然抗菌物質，在護膚方面的應用廣泛，具有抗氧化、抗衰老、美白等活性。本研究證實，它們在抗菌、抗炎和抗痤瘡方面亦具備明顯的藥效，能較好的應用于化妝品市場。

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（收稿日期：2022-10-17）