頂空氣相色譜法測定吡侖帕奈中5種有機(jī)溶劑

顧曉風(fēng)，唐倩倩

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心,江蘇蘇州 215104；2.山東綠葉制藥有限公司,山東煙臺(tái) 264670）

吡侖帕奈由日本衛(wèi)材公司研發(fā),是目前唯一一個(gè)口服速效的高選擇性和非競爭性的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體拮抗劑[1?2],通過直接減弱興奮性遞質(zhì)谷氨酸引起的神經(jīng)毒性,抑制癲癇發(fā)作[3]。作為第三代口服抗癲癇藥,對(duì)于難治性癲癇,尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài),在其它抗癲癇藥控制不佳時(shí),吡侖帕奈作為輔助治療可獲得良好的療效[4?7],其制劑于2012年在美國上市,2019年12月在國內(nèi)上市。

吡侖帕奈原料藥在其合成過程中,使用了乙酸乙酯、四氫呋喃、吡啶和N,N-二甲基甲酰胺4 種溶劑,在最終產(chǎn)物的后處理中,使用了大量甲醇進(jìn)行洗滌[8]。藥物中殘留的有機(jī)溶劑是否得到合理有效的控制,直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量可控性與安全性[9?10]。經(jīng)文獻(xiàn)查閱,尚未見吡侖帕奈原料藥中有機(jī)溶劑殘留量測定的報(bào)道。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use,ICH)和《中華人民共和國藥典》2020 年版四部附錄0861的相關(guān)規(guī)定,筆者采用頂空氣相色譜法[11?16],對(duì)吡侖帕奈原料藥中5種有機(jī)溶劑的殘留量進(jìn)行測定,以確保藥品的安全、有效和質(zhì)量可控。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型,安捷倫科技(中國)有限公司。

頂空進(jìn)樣器：7697 A型,安捷倫科技(中國)有限公司。

電子天平：XS205DU型,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒–托利多公司。

氮?dú)猓杭兌葹?9.999%、蘇州金宏氣體股份有限公司。

吡侖帕奈原料藥樣品：批號(hào)為117H0901,某藥廠提供。

二甲基亞砜：色譜純,德國默克公司。

乙酸乙酯、四氫呋喃、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺和甲醇：分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,1.8 μm,美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：程序升溫,起始溫度為40 ℃,保持4 min,以20 ℃/min 的速率升至200 ℃,保持4 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID),溫度為250 ℃；載氣：氮?dú)?流量為2 mL/min；頂空平衡溫度：100 ℃；平衡時(shí)間：20 min；進(jìn)樣時(shí)間：0.5 min。

1.3 溶液配制

5種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取甲醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺適量,加入二甲基亞砜溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.02、5.00、0.72、0.18、0.92 mg/mL的混合溶液。

5 種溶劑混合對(duì)照品溶液：精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL,置于50 mL 量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至標(biāo)線,搖勻,精密移取5 mL置于頂空瓶中,加蓋密封,即得。

吡侖帕奈原料藥樣品溶液：精密稱取吡侖帕奈原料藥樣品0.1 g,置于頂空瓶中,精密加入二甲基亞砜5 mL,加蓋密封,超聲(500 W,40 kHz)處理2 min使之溶解,即得。

空白溶液：精密移取二甲基亞砜5 mL,置于頂空瓶中,加蓋密封,即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取5種溶劑混合對(duì)照品溶液和吡侖帕奈原料藥樣品溶液,按1.2色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算得到樣品中5 種有機(jī)溶劑的殘留量。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

由于目標(biāo)物N,N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)較高,分別選擇N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亞砜作為溶劑進(jìn)行考察。經(jīng)試驗(yàn),吡侖帕奈在二甲基亞砜中易溶,而在N,N-二甲基乙酰胺中不易分散均勻。進(jìn)一步考察不同濃度的二甲基亞砜水溶液對(duì)目標(biāo)物色譜行為的影響,結(jié)果表明當(dāng)增加二甲基亞砜水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)時(shí),甲醇、乙酸乙酯、四氫呋喃和吡啶色譜峰面積增大,而N,N-二甲基甲酰胺色譜峰面積減小,靈敏度降低。由于N,N-二甲基甲酰胺在該色譜系統(tǒng)中峰面積本身較小,故優(yōu)先考慮N,N-二甲基甲酰胺的檢測靈敏度,最終選擇以二甲基亞砜為溶劑。

2.2 頂空條件的選擇

設(shè)定頂空平衡溫度分別為80、90、100、110、120 ℃,結(jié)果表明：隨著溫度的升高,各目標(biāo)物色譜峰面積均增大,當(dāng)溫度為110 ℃及以上時(shí),基線噪音明顯增大,故最終選擇頂空平衡溫度為100 ℃。

設(shè)置頂空溫度為100 ℃,分別設(shè)置頂空平衡時(shí)間為20、30、40 min,考察目標(biāo)物的色譜行為,結(jié)果表明無明顯差異,考慮分析效率,選擇20 min 作為頂空平衡時(shí)間。

2.3 色譜條件的選擇

根據(jù)5 種目標(biāo)有機(jī)溶劑的極性,選擇弱極性及中等極性的色譜柱進(jìn)行分離。分別考察HP-5、DB-17 及DB-624 色譜柱,結(jié)果表明,DB-624 色譜柱分離效果最好。另考察規(guī)格不同的DB-624 毛細(xì)管柱,規(guī)格為30 m×0.32 mm,1.8 μm (流量設(shè)為2 mL/min)和規(guī)格為30 m×0.53 mm,3 μm (流量設(shè)為5 mL/min),均能滿足分析要求。筆者選擇規(guī)格為30 m×0.53 mm,3 μm的DB-624毛細(xì)管柱。

取1.3制備的空白溶液、5種試劑混合對(duì)照品溶液和吡侖帕奈原料藥樣品溶液,按1.2色譜條件進(jìn)行測定,色譜圖見圖1～圖3。由圖1～圖3可知,空白溶液及吡侖帕奈原料藥樣品溶液中其它雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物無干擾,5種試劑混合對(duì)照品溶液中,各色譜峰之間的分離度均大于2.0,滿足分析要求。

圖1 空白溶液色譜圖

圖2 5種溶劑混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 吡侖帕奈原料藥樣品溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系、定量限與檢出限

精密量取5種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液4、2、0.5、0.1、0.02 mL,分別置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亞砜稀釋至標(biāo)線,搖勻,配制成乙酸乙酯質(zhì)量濃度分別為200.08、100.04、25.01、5.00、1.00 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；另精密量取5 種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液4、2、1、0.2、0.05 mL,分別置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亞砜稀釋至標(biāo)線,搖勻,作為甲醇、四氫呋喃的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,甲醇的質(zhì)量濃度分別為120.78、60.39、30.20、6.04、1.51 μg/mL,四氫呋喃的質(zhì)量濃度分別為28.94、14.47、7.23、1.45、0.36 μg/mL；另精密量取5 種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液4、2、1、0.5、0.2 mL,分別置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亞砜稀釋至標(biāo)線,搖勻,作為吡啶和N,N-二甲基甲酰胺的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,吡啶的質(zhì)量濃度分別為7.37、3.69、1.84、0.92、0.37 μg/mL,N,N-二甲基甲酰胺的質(zhì)量濃度分別為36.66、18.33、9.17、4.58、1.83 μg/mL。精密量取上述溶液各5 mL,置于頂空瓶中,密封,進(jìn)樣測定,記錄色譜峰面積,以各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)色譜峰面積y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取5 種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,用二甲基亞砜逐級(jí)稀釋,測定并記錄色譜峰面積,以信噪比為10∶1對(duì)應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度作為定量限,以信噪比為3∶1對(duì)應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度作為方法檢出限。

5 種溶劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限見表1。

表1 5種溶劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別精密移取5種溶劑混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3 mL,置于100 mL容量瓶中,加入二甲基亞砜稀釋至標(biāo)線,搖勻,得到低、中、高三個(gè)濃度水平的5種溶劑混合對(duì)照品溶液。精密稱取吡侖帕奈原料藥樣品(批號(hào)117H0901)9 份,每份0.1 g,分別置于頂空瓶中,每3份為1組。將3組分別精密加入上述5種溶劑混合對(duì)照品溶液各5 mL,加蓋密封,超聲(500 W,40 kHz)處理2 min使樣品溶解,按1.2色譜條件進(jìn)行檢測,計(jì)算平均回收率,結(jié)果見表2。

表2 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了吡侖帕奈中5種殘留溶劑的頂空氣相色譜法,該方法操作簡單,靈敏度高,可用于吡侖帕奈殘留溶劑的質(zhì)量控制。