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    超高溫滅菌乳中脂肪球粒徑快速檢測研究

    2023-08-08 01:36:52馮立玲胥文玲羅軍昆王清華白曉玲
    中國乳業(yè) 2023年7期
    關鍵詞:染色劑超高溫染色法

    馮立玲,胥文玲,羅軍昆,王清華,白曉玲

    蒙牛乳業(yè)(灤南)有限責任公司,河北唐山 063500

    0 引言

    超高溫滅菌乳的保質期時間較長,在儲存過程會存在多種質量缺陷,如脂肪上浮、結塊、酸包、脹包等問題。其中脂肪上浮現(xiàn)象一直是影響長貨架期超高溫滅菌乳等乳制品質量的首要問題。不同程度的脂肪上浮現(xiàn)象均影響產(chǎn)品的外觀及品質,嚴重時在包裝頂部可形成幾毫米厚的脂肪層,給消費者食用時帶來不愉悅的感受和體驗。降低或減少脂肪上浮現(xiàn)象,成為乳品企業(yè)改善產(chǎn)品品質的重要環(huán)節(jié)。

    牛奶中的脂肪以小液滴形式存在,稱為乳脂肪球[1]。牛奶中的脂肪球由于粒度大小不等、密度小、質量輕而浮在牛奶表面形成一層奶油層,使牛奶產(chǎn)生分層現(xiàn)象[2],因此需要進行均質化處理。均質化處理給牛奶帶來許多優(yōu)點,如脂肪球變小,不形成奶油層;顏色更白、口感更佳;降低脂肪氧化敏感性,具有更強穩(wěn)定性和更長保質期[3~5],成為了現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)中不可或缺的工藝[6]。

    為監(jiān)控均質化效果,對均質化過程中牛奶脂肪球粒度的測定十分必要。激光粒度法作為一種快速、準確的粒度測試方法已被應用,但激光粒度分析儀較貴,檢測成本較高,一般乳品企業(yè)無法承擔[7]。為促進生產(chǎn)過程均質效果改善,同時提升產(chǎn)品穩(wěn)定性,需研發(fā)一種低成本、高效率、快速檢測脂肪球粒徑大小的方法。本文通過試驗論述脂肪球粒徑檢測方法的研發(fā)過程,對比不同染色劑染色脂肪球的現(xiàn)象差異,從而確定出最優(yōu)方案。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    蘇丹Ⅲ,福晨(天津)化學試劑有限公司;甲基紅、次甲基藍、鉻黑T、溴甲酚綠、甲基橙、95%濃度乙醇、草酸銨,福晨(天津)化學試劑有限公司;結晶紫、番紅,北京陸橋技術股份有限公司。

    ME2002E/02電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RX50顯微鏡,寧波舜宇儀器有限公司;玻璃燒杯;載玻片;蓋玻片;滴管;鑷子。

    1.2 染色劑選擇

    蘇丹Ⅲ是一種常用的脂肪類染液,遇脂肪會變?yōu)殚冱S色。甲基橙是分析化學中常用酸堿指示劑,在中性介質中以磺酸鈉鹽形式存在而呈現(xiàn)黃色,超高溫滅菌乳通常為中性樣品,可制備甲基橙指示劑用于該試驗。另外,甲基紅指示劑、次甲基藍指示劑、鉻黑T指示劑、溴甲酚綠指示劑、結晶紫指示劑、番紅指示劑均為實驗室日常檢測常用指示劑,本文引入這些指示劑用來進行試驗,對比染色效果。

    1.3 試劑配制

    蘇丹Ⅲ指示劑:稱取0.25 g蘇丹Ⅲ粉末于錐形瓶中,加入95%濃度酒精50 mL,充分攪拌混合均勻,過濾后備用。

    甲基紅指示劑:稱取0.1 g甲基紅,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

    次甲基藍指示劑:稱取0.1 g亞甲基藍,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

    鉻黑T指示劑:稱取0.5 g鉻黑T,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

    溴甲酚綠指示劑:稱取0.1 g溴甲酚綠,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

    甲基橙指示劑:稱取0.1 g甲基橙,溶于70 ℃水中,冷卻,稀釋至100 mL。

    結晶紫指示劑:稱取0.1 g甲基紅,用20 mL 95%乙醇溶解;稱取草酸銨0.8 g,用80 mL實驗用水溶解;使用前將上述兩種溶液混合過濾后備用。

    番紅指示劑:稱取2.5 g甲基紅,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。使用前取10 mL已配制的溶液,加入90 mL實驗用水混勻后備用。

    1.4 染色方法

    待測樣品與染色劑混勻后直接檢測,無需其他處理。另外,為降低試驗操作過程中使用酒精燈存在的安全風險,減少常規(guī)制片過程使用酒精燈烘干的操作步驟,借鑒生物檢驗花生中的脂肪實驗操作步驟[8]中染色制片方法。除蘇丹Ⅲ染色法外,本文通過使用蓋玻片,驗證液體樣品不烘干也能實現(xiàn)固定的目的。

    1.4.1 蘇丹Ⅲ染色法

    參考《牛奶脂肪球觀測方法》[9],具體操作步驟如下。

    (1)制片:取若干滴牛奶置于載玻片上,用鑷子固定玻片一端置于酒精燈火焰上方,直至牛奶滴烘干。

    (2)染色:在烘干后的牛奶滴上滴加蘇丹Ⅲ指示劑,靜置染色1~2 min,然后用鑷子夾住載玻片一端置于酒精燈火焰上方,直至蘇丹Ⅲ指示劑烘干。

    (3)觀察:將載玻片置于顯微鏡下,選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡,在100 倍(10×10)條件下,觀察染色后牛奶滴中的脂肪球。

    1.4.2 甲基橙染色法

    (1)制片染色:取1 滴已混合均勻的牛奶樣品置于載玻片上,在滴加牛奶樣品的位置滴加1 滴甲基橙指示劑,再將一片蓋玻片用鑷子輕輕覆蓋在上面。

    (2)分析觀察:將步驟(1)制備好的樣品置于顯微鏡下,在100 倍(10×10)條件下觀察??芍苯佑媚跨R,也可用顯微鏡軟件進行觀察。

    (3)結果判定 :將載玻片置于顯微鏡下,選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡,在100 倍(10×10)條件下,觀察染色后牛奶滴中的脂肪球,也可以利用顯微鏡操作軟件,通過軟件參數(shù)設置,更直接、更清晰觀察脂肪球形態(tài),還可測量脂肪球粒徑大小。

    1.4.3 其他染色劑法

    將結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑,依據(jù)1.4.2步驟操作。

    1.5 結果判定

    鏡檢觀察:未經(jīng)均質處理或均質效果差的樣品,脂肪球大小不均勻,外形不規(guī)則,形態(tài)較大。經(jīng)均質處理后的樣品,脂肪球為大小均勻的球形顆粒,形態(tài)較小。

    本文試驗要求鏡檢觀察的結果為脂肪球外形清晰可見,粒徑大小可通過測量確定具體數(shù)值。

    2 結果與分析

    2.1 試驗結果

    2.1.1 不同染色劑對比

    針對試驗使用的8 種染色劑,在操作便捷性、觀察難易性、染色均勻程度及背景清晰程度等方面進行比較(表1)。甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

    表1 不同染色方法操作對比

    2.1.2 染色劑與樣品的適宜性

    抽取超高溫滅菌乳和調制乳各10 批,分別用8種染色劑進行樣品適宜性驗證(表2)。

    表2 不同染色方法樣品適宜性對比

    適宜性評價標準:染色劑與樣品充分融合,染色均勻,鏡檢觀察時無背景雜質干擾。

    除甲基橙外,其他染色劑與樣品混合的過程中均存在不能充分融合的現(xiàn)象,鏡檢時視野下背景干擾影響觀察效果,故甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

    2.1.3 不同染色劑染色圖片

    用顯微鏡觀察8 種不同染色劑對同一超高溫滅菌乳進行脂肪球染色,各種染色劑染色效果存在差異,其中甲基橙染色效果最好,背景最清晰,染色后的脂肪球更易觀察;相比而言,其他染色劑染色效果較差,染色后的脂肪球不易觀察(圖1)。

    圖1 不同染色劑染色圖片

    2.2 分析方法評價

    2.2.1 蘇丹Ⅲ染色法

    蘇丹Ⅲ染色法為已有參考文獻可查詢的一種脂肪球檢測方法,在試驗中發(fā)現(xiàn)存在4 處缺陷,具體如下。

    (1)試劑配制:蘇丹Ⅲ染液配制過程存在溶解不充分現(xiàn)象,需過濾操作,步驟繁瑣。

    (2)制片:由于需觀測樣品為液體,具有流動性,依據(jù)染色操作要求,為便于觀察,該方法對液體樣品通過烘干操作進行固定。執(zhí)行該步驟需使用酒精燈,由于牛奶營養(yǎng)物質豐富,經(jīng)烘干操作后,部分有機物由于烘烤溫度過高或時間過長容易糊化,染色后背景雜質較多,導致脂肪球不易觀察,干擾實驗人員操作,因此烘干環(huán)節(jié)需優(yōu)化或取消。另外,酒精燈存在火災風險。

    (3)烘干:酒精純度越高,燃燒越充分,燃點越旺盛。該方法使用濃度為95%乙醇配制染色液,染色后烘干操作,載玻片經(jīng)過酒精燈火焰時,極易引起燃燒,危險性較大。

    (4)染色:該步驟需靜置后再次使用酒精燈烘干,耗時較長。

    2.2.2 甲基橙染色法

    該方法操作簡便、快捷高效,具體優(yōu)勢如下。

    (1)取1 滴混勻后的樣品即可滿足實驗要求,不需烘干操作,立即滴加染色液,可實現(xiàn)染色均勻目的。

    (2)染色后無需靜置,增加蓋玻片使用。蓋玻片的作用:可使被觀察物形成薄膜,易透光,便于觀察;可使標本相對固定;便于利用毛細現(xiàn)象,使染色液形成梯度,脂肪球染色更充分;避免標本受污染。

    2.2.3 其他染色劑法

    結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑滴加至牛奶樣品后,指示劑和牛奶樣品都不能有效融合,產(chǎn)生肉眼可見顆粒物質,鏡檢時會發(fā)現(xiàn)染色效果差,背景干擾雜質多,影響觀察效果。

    3 結論與討論

    為降低超高溫滅菌乳貨架期內(nèi)脂肪上浮現(xiàn)象,在牛奶均質化及產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中,對脂肪球粒徑進行監(jiān)控十分必要。在注重產(chǎn)品質量同時,考慮檢測效率成本等因素,乳品企業(yè)尤其需高效率、低成本、快速檢測脂肪球粒徑的方法。

    本文對實驗室日常使用指示劑進行設計,在超高溫滅菌乳中開展脂肪球檢測試驗對比,最終確定甲基橙染色法為最優(yōu)方法。傳統(tǒng)顯微鏡直接觀察方式,只能獲得脂肪球大小的直觀表象,不能了解具體粒徑大小。甲基橙染色法引入顯微鏡操作軟件,通過軟件參數(shù)設置,不但可以更直接更清晰觀察到脂肪球的形態(tài),還可對脂肪球粒徑大小進行測量。同時,所觀察過的圖片可通過軟件存儲,便于后期查閱。該方法快速高效,檢測成本低,簡便易行,操作更安全,可為均質化過程提供有效監(jiān)控數(shù)據(jù),能滿足乳品企業(yè)對脂肪球粒徑進行快速檢測目的。

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