奶牛乳房炎相關(guān)天然免疫基因的探索分析

黃亨良

興義市南盤江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，貴州興義 562400

0 引言

奶牛乳房炎不但可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降、淘汰率增加[1]，而且治療費(fèi)用高昂。數(shù)據(jù)顯示，由于治療診斷費(fèi)、勞動(dòng)成本和廢棄奶等原因造成的平均損失達(dá)444 美元/頭·年，其中治療費(fèi)用損失達(dá)128 美元/頭·年[2]，給牧場(chǎng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛乳房炎在全世界的發(fā)病率較高，如北馬其頓共和國高產(chǎn)奶牛乳房炎發(fā)病率達(dá)到68.6%[3]，孟加拉乳房炎發(fā)病率達(dá)43.9%[4]。

目前，引發(fā)奶牛乳房炎的病原菌主要分為環(huán)境型病原菌和傳染型病原菌[5]。環(huán)境型病原菌是指由于奶牛居住環(huán)境差而產(chǎn)生的病菌，是引起臨床乳房炎的主要病原菌，主要為桿菌和鏈球菌類[6]。傳染型病原菌是指可以在牛群之間或乳房之間廣泛傳播的病菌，主要為金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌[7]。

奶牛攝入營養(yǎng)不足、生活環(huán)境衛(wèi)生差或處于高溫高濕環(huán)境時(shí)，極易由于免疫力下降而被病原菌感染，而引發(fā)乳房炎[8]。而且產(chǎn)奶量和乳房炎發(fā)病率呈正比[9]，高產(chǎn)奶牛的發(fā)病率遠(yuǎn)高于普通奶牛。

除了提高營養(yǎng)和改善奶牛飼養(yǎng)環(huán)境外，機(jī)體增強(qiáng)免疫力是降低乳房炎發(fā)病率、維持奶牛機(jī)體健康水平，增強(qiáng)生產(chǎn)性能的重要措施。其中天然免疫是機(jī)體免疫屏障的第1道防線，主要包括對(duì)病原菌的識(shí)別，早期細(xì)胞因子的合成，補(bǔ)體的產(chǎn)生及自噬的發(fā)生[10]。因此，增強(qiáng)天然免疫基因的篩選，有助于從分子水平上改善奶牛免疫力，抑制乳房炎發(fā)病率，降低牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 奶牛乳房天然免疫系統(tǒng)的構(gòu)成

奶牛乳房的天然免疫系統(tǒng)主要由皮膚組織、乳頭管、體液和免疫細(xì)胞構(gòu)成[11]。皮膚組織對(duì)防御外界病原菌直接入侵體內(nèi)起主要作用。乳頭管在非擠奶期和奶量較少時(shí)都關(guān)閉，形成將病原菌隔離在外的物理屏障。體液中能發(fā)揮免疫功效的分子主要為補(bǔ)體、溶菌酶、乳鐵蛋白、抗體和轉(zhuǎn)鐵蛋白等；細(xì)胞則主要為巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞和樹突細(xì)胞等[12]。奶牛乳房部位受到病原菌入侵感染時(shí)，巨噬細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞部位的模式識(shí)別受體（TLR和CD14等）會(huì)接收到病原菌的特征信號(hào)，從而激活體內(nèi)的NF-κB或AP-1信號(hào)通路，產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥因子和趨化因子。其中炎癥因子IL-1β和TNF-α等會(huì)將體內(nèi)的炎癥信號(hào)加大，加劇炎癥反應(yīng)。而趨化因子則起到“定位”作用，促使更多白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞進(jìn)入感染部位，殺死入侵的病原菌[13]。病原菌不同，引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)度存在差異。通常革蘭氏陰性細(xì)菌會(huì)引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致明顯的臨床癥狀，而機(jī)體免疫反應(yīng)也較迅速，能及時(shí)處理病原菌后恢復(fù)正常狀態(tài)；革蘭氏陽性細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)較弱，持續(xù)時(shí)間久，機(jī)體無法將這類病原菌很快清除干凈，可引起乳房部位持續(xù)炎癥，造成較大危害[14]。

2 奶牛抗病相關(guān)基因

近年來，為了提高產(chǎn)奶量，通過分子選育技術(shù)對(duì)高產(chǎn)奶牛進(jìn)行基因篩選的研究較多，但對(duì)增強(qiáng)奶牛抗病能力基因的研究較少，仍處于起步階段。根據(jù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查，不同品種的奶牛對(duì)結(jié)核桿菌和布魯氏桿菌的抵抗能力存在基因水平上的差異[15，16]，其中瑞士褐牛比荷斯坦牛巨噬細(xì)胞的活性氮自由基合成能力更強(qiáng)，對(duì)沙門氏菌的吞噬清除能力更強(qiáng)[17]，為通過分子選育，降低奶牛乳房炎患病率提供了依據(jù)。除了將抗菌能力作為篩選基因的檢測(cè)指標(biāo)外，牛奶中體細(xì)胞數(shù)也能夠體現(xiàn)出乳房炎的嚴(yán)重程度，研究者通常會(huì)將體細(xì)胞數(shù)的變化作為篩選抗病基因的一項(xiàng)重要指標(biāo)[18]。目前研究發(fā)現(xiàn)能影響奶牛機(jī)體免疫力的候選基因主要為以下幾種。

2.1 模式識(shí)別受體基因

模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）是奶牛機(jī)體內(nèi)感應(yīng)外來病原菌入侵的重要受體[19]。特別是肽聚糖識(shí)別蛋白和溶菌酶家族是兩種特別重要的PRR，能對(duì)病原菌中的肽聚糖進(jìn)行特異性識(shí)別，從而在防御和抵抗病原菌入侵等方面起重要作用[20]。王洪亮[21]利用基因組DNA擴(kuò)增肽聚糖識(shí)別蛋白基因序列，并檢測(cè)序列中的多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)調(diào)控肽聚糖識(shí)別蛋白的PGLYRP1基因表達(dá)后，對(duì)金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌有較好的抑制作用。Gao等[22]通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)H與溶酶體表達(dá)的HSPA8基因的表達(dá)能夠降低乳房炎的炎癥。此外，Toll樣受體也是PRR家族中和免疫相關(guān)的重要靶點(diǎn)。Russell等[23]在TLR1基因上發(fā)現(xiàn)1 個(gè)與奶牛臨床乳房炎顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，且通過細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同基因型奶牛產(chǎn)的牛奶中體細(xì)胞表面的TLR1受體的表達(dá)量存在差異，其中CG基因型奶牛的表達(dá)量顯著低于其他基因型的奶牛。不僅如此，Sharma等[24]也在TLR4上發(fā)現(xiàn)3 個(gè)與奶牛體細(xì)胞數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。劉娟[25]發(fā)現(xiàn)TLR1基因的G1498A位點(diǎn)與奶牛的乳脂率、體細(xì)胞數(shù)和乳房炎發(fā)病率顯著相關(guān)。CD14是存在于白細(xì)胞表面的PRR，能識(shí)別外來病原菌的表面抗原脂多糖。有研究發(fā)現(xiàn)，CD14的SNP基因型1908AG外顯子上一個(gè)錯(cuò)義突變就能改變CD14受體在嗜中性粒細(xì)胞的表達(dá)量，從而增強(qiáng)對(duì)病原菌的識(shí)別和滅殺作用，這說明CD14可能是影響奶牛免疫力的候選基因之一[26]。CARD15（NOD2）也是胞內(nèi)的PRR，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，牛CARD15編碼區(qū)的3020堿基發(fā)生錯(cuò)義突變后對(duì)體細(xì)胞數(shù)具有較大影響，因此也被認(rèn)為是乳房炎的候選基因之一[27]。

2.2 趨化因子及其受體基因

趨化因子是一種具有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)行定向趨化能力的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。奶牛被病原菌入侵后，白細(xì)胞能通過表面的受體CXCR1和CXCR2基因識(shí)別感染部位釋放的趨化因子——白介素-8（IL-8），引導(dǎo)自身向受感染部位移動(dòng)，吞噬并殺死病原菌[28]。其中關(guān)于CXCR1基因的研究最多。CXCR1基因的+777位點(diǎn)的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致谷氨酰胺和組氨酸之間發(fā)生替換，而該位點(diǎn)與荷斯坦牛的臨床乳房炎和亞臨床乳房炎密切相關(guān)[29]。該基因的-1768位點(diǎn)與泌乳期奶牛的體細(xì)胞數(shù)顯著關(guān)聯(lián)[30]；+735位點(diǎn)與臨床乳房炎的發(fā)病顯著關(guān)聯(lián)[31]；+777位點(diǎn)與中國荷斯坦牛的體細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)，可作為奶牛亞臨床乳房炎抗性基因的分子輔助標(biāo)記[32]。張亞琴[33]通過研究中國荷斯坦牛的CXCR1和IL-8兩個(gè)基因多個(gè)突變位點(diǎn)多態(tài)性與乳房炎易感性的交互作用，發(fā)現(xiàn)CXCR1基因的-1830位點(diǎn)、-1768位點(diǎn)和IL-8的2789/2862位點(diǎn)的三者交互模型為奶牛乳房炎易感性相關(guān)的最佳選擇模型。

2.3 炎癥因子及其受體基因

奶牛乳房炎常伴隨長時(shí)間炎癥，因此，炎癥細(xì)胞因子及其受體基因也是影響乳房炎的重要因素，如TNF-α和IL-1β等炎癥因子能放大炎癥信號(hào)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[34]。Verschoor等[35]在奶牛的IL-10及其受體IL-10Rα基因上分別發(fā)現(xiàn)10 個(gè)和6個(gè)相關(guān)基因位點(diǎn)，其中IL-10Rα上的SNP1185C＞T位點(diǎn)與奶牛的體細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)。Skelding等[36]對(duì)IL-12的IL12RB1/B2和IL-23受體基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與乳房炎相關(guān)的10 個(gè)SNP位點(diǎn)。楊宇澤等[37]發(fā)現(xiàn)，牛整合素（ITGB2）基因的389C＞T位點(diǎn)的基因型與乳脂肪率、乳蛋白率和乳房炎相關(guān)，其中ITGB2基因389位點(diǎn)和774位點(diǎn)的TTCC的復(fù)合基因型可用于中國荷斯坦牛乳房炎抗性和乳品質(zhì)的潛在分子標(biāo)記。Günther等[38]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，都能刺激乳房上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，但在介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程中，大腸桿菌通過上調(diào)TNF-α和IL-1β的表達(dá)來產(chǎn)生快速炎癥，而金黃色葡萄球菌通過IL-6的生成來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

2.4 抗菌肽相關(guān)基因

抗菌肽是一種能直接殺死病原菌的活性多肽，在奶牛機(jī)體中，能表達(dá)產(chǎn)生抗菌肽的相關(guān)基因?qū)档湍膛Ｈ榉垦椎幕疾÷示哂兄匾饔肹39]。其中乳鐵蛋白基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)域序列呈高度多態(tài)性，具有較好應(yīng)用前景，是潛在乳房炎的相關(guān)候選基因。李宏濱[40]通過基因組學(xué)分析對(duì)照β-防御素、AHCY（S-腺苷高半胱氨酸水解酶編碼基因）和MPIF-1（骨髓細(xì)胞前體抑制因子 1 基因）3 種基因與奶牛乳房炎癥的關(guān)聯(lián)性，經(jīng)過3D結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，β-防御素是一種存在于乳房上皮細(xì)胞表面、具有微生物菌落抗性的活性抗菌肽。王靜[41]通過重疊延伸PCR克隆了重組LAP-CATHL2抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其對(duì)由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有良好的治療作用。李云龍等[42]針對(duì)奶牛溶菌酶的多態(tài)性和乳房炎的相關(guān)性進(jìn)行研究，檢測(cè)420 頭奶牛的溶菌酶基因，發(fā)現(xiàn)其外顯子的115位點(diǎn)上存在突變，且該位點(diǎn)與體細(xì)胞數(shù)和305 天產(chǎn)奶量具有較大的關(guān)聯(lián)，可用于奶牛乳房炎抗性和產(chǎn)奶量的分子標(biāo)記。

2.5 其他相關(guān)基因

閆濤濤等[43]發(fā)現(xiàn)，乳房炎奶牛干擾素調(diào)節(jié)因子5（IRF5）的表達(dá)量比正常奶牛顯著上升，可能是通過與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300、C-C基序趨化因子4等蛋白相互作用，調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生概率。吳培等[32]對(duì)奶牛亞臨床乳房炎抗性的多種基因進(jìn)行體細(xì)胞數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPP1的-1301位點(diǎn)、CXCR1的+777位點(diǎn)、NOD2c.4500位點(diǎn)與中國荷斯坦牛體細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)，可作為奶牛亞臨床乳房炎抗性基因的分子輔助標(biāo)記。種麗偉[44]利用基因組、轉(zhuǎn)錄組水平鑒定，驗(yàn)證奶牛乳房炎抗性的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)新疆褐牛乳房炎抗性相關(guān)基因ZRANB3、PIAS1、ACTR3、LPCAT2、MGAT5、SLC37A2。

3 總結(jié)

總之，目前與奶牛天然免疫相關(guān)的基因較多，研究的也較為廣泛，因此篩選對(duì)乳房炎抗性較強(qiáng)的基因，對(duì)奶牛進(jìn)行定向培育、分子育種，在遺傳上降低乳房炎發(fā)病率，對(duì)促進(jìn)奶牛的高效健康育種具有重要意義。此外，天然免疫對(duì)改善奶牛繁殖及泌乳性能也具有重要影響，這是因?yàn)樘烊幻庖卟淮嬖谔禺愋?，篩選天然免疫基因過程也可能對(duì)奶牛機(jī)體的乳腺及繁殖系統(tǒng)起良好調(diào)節(jié)作用。目前對(duì)奶牛相關(guān)天然免疫研究仍存在不足，可繼續(xù)借助基因多態(tài)性、疾病性狀的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步探尋可能影響奶牛天然免疫力的候選基因和標(biāo)記分子，助力分子育種。