例談高中生物學常考的幾種PCR擴增技術

沈 艦 紀 磊 何 亮

(1.湖北省十堰市教育科學研究院 2.湖北省十堰市一中 3.湖北省襄陽市一中)

隨著生物技術的飛速發(fā)展,曾經遙不可及的PCR技術逐步走進了高中實驗室,甚至進入到尋常百姓家。考題中有關PCR的問題越來越多,設問考查深度也明顯提升。筆者在走訪調研中發(fā)現,零碎的試題講解效果有限,既無法讓學生系統(tǒng)掌握不同PCR技術的用途,也無法切實提升學生的關鍵能力和探究素養(yǎng)。下面筆者將結合高中生物學?？嫉腜CR類試題,淺談六類PCR擴增技術,為教學提供參考。

1.常規(guī)PCR

人教版教材中介紹的就是常規(guī)PCR流程。在PCR儀中通常要加入7種成分:模板DNA片段、引物、脫氧核苷酸底物、Taq酶、酶所需緩沖液、Mg2+和純凈水。在此提示幾點注意事項:一是引物的長度一般在16 bp以上,以避免其與模板配對時的非特異性結合。但引物越長,需要測定的模板DNA序列越多,制作引物的成本越高,所以18～30 bp是較為理想的長度。二是引物中G+C的含量要盡量控制在40%～60%,這樣可以保證較高的退火溫度,3′末端要盡量避免T(引物末尾堿基是T時錯配的概率遠大于其他3種)。三是緩沖液中需要添加Mg2+來激活Taq酶的活性中心。

常規(guī)PCR的相應例題較為普遍,在此不再贅列。

2.反向PCR

反向PCR多用于擴增的DNA分子中僅部分序列已知,其擴增的思路:先利用多種限制酶對待測DNA片段進行隨機切割,再利用DNA連接酶對片段進行環(huán)化。隨后在已知序列的兩個末端設計引物,進而來擴增已知序列兩側的未知序列。以2022年浙江省某模擬題為例:

例1.反向PCR可利用一段已知DNA序列設計合理的引物,擴增已知序列兩端的未知序列,如圖1所示。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序為“5′-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3′”。下列敘述錯誤的是

圖1 反向PCR流程圖

( )

A.Ⅰ酶切:用一種限制酶切割DNA,以使兩端未知序列形成相同的黏性末端

B.Ⅱ連接:使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵

C.設計的兩種引物分別是“5′-AACTAT GCGCTCATGA-3′”和“5′-AGAGGCTACGCAT TGC-3′”

D.對PCR產物測序,經分析得到了片段F的完整序列,該DNA單鏈序列可能為“5′-AATTC CAGT-……-CTGAATT-3′”

答案：C。兩種引物需與已知序列發(fā)生互補配對,而后向兩側延伸合成未知序列。

反向PCR在基因序列鑒定過程中具有獨到優(yōu)勢,但也存在一些限制條件:一是必須選擇一種合適的限制酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。二是若使用的引物含有待測DNA的某些重復序列,反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

3.多重PCR

多重PCR(MPCR)在高中生物學考題中出現的頻率非常高,顧名思義就是在同一反應體系中使用一對以上的引物對同一DNA分子進行擴增,不同引物結合的位置不同,擴增的產物也有差異。通過比較擴增產物的大小差異即可判斷樣品中有哪些基因。比較典型的是2022年湖南省生物聯賽初賽的一道題:

例2.隨著科學技術的發(fā)展,MPCR技術在擴增方面取得新的突破,不再局限于在同一反應管中進行擴增,而是將不同的引物對和模板分散于相應獨立的空間中進行擴增。下列相關敘述錯誤的是

( )

A.對于同一DNA片段的不同區(qū)段進行擴增時,不同引物的堿基排列順序不能互補

B.同一反應體系中擴增不同模板時需加入更多TaqDNA聚合酶才能使擴增正常進行

C.在目的DNA片段擴增時,若復性階段溫度控制過高,可能導致無產物

D.PCR擴增DNA時打開雙螺旋的方式與細胞內不同,實質都是磷酸二酯鍵斷裂

答案：D。PCR擴增時打開的是DNA的氫鍵,與細胞內打開方式不同,但作用的化學鍵相同,D錯誤。

多重PCR最大的缺陷是由于擴增產物不同,擴增多次后形成二聚體和多聚體的概率逐步增大,導致非特異性擴增大幅上升。

4.巢式PCR

巢式PCR先用待擴增DNA外側的一對引物完成一次PCR,再將其作為模板,根據原來引物內側的序列設置新的引物,再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短,引物更小,因此可以減少第一次擴增中出現的非特異性擴增片段,提升擴增的精確性。但由于操作過程中的開蓋處理,會增加產物污染的概率。以2022年揚州三模22題的一部分為例:

例3.圖2是巢式PCR工作原理示意圖,請回答:

圖2 巢式PCR示意圖

(1)若用外引物擴增產生了錯誤片段,再用內引物在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率________,因此,相較常規(guī)PCR獲得的產物而言,巢式PCR獲得產物特異性________。

(2)巢式PCR通常在一個試管中進行第一階段反應,然后將中間產物等轉移到第二試管中進行第二階段反應,不在同一試管中進行的主要原因是________。

答案：(1)降低 更強 (2)防止內引物在第一階段PCR中發(fā)揮作用,無法實現巢式PCR高精確擴增的目的

對比巢式PCR和多重PCR,巢式PCR中外側引物和內側引物有一定關聯但不完全相同,兩次PCR模板不同,有先后順序。多重PCR是一次性在緩沖液中加入多對引物對同一DNA分子的不同片段進行擴增。當需要對多個目的基因進行高精度擴增時,可同時采用多重PCR和巢式PCR。

5.實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR建立在早期逆轉錄PCR的基礎上。早期的逆轉錄PCR通過對mRNA逆轉錄形成的產物進行電泳,觀察電泳帶的亮度來衡量mRNA的量,但由于亮度極差很難區(qū)分,且擴增效率達不到100%,因此檢測結果誤差大。

在此基礎上,科學家開始探索檢測每一輪PCR產物的累計數量,熒光定量檢測技術應運而生。這種技術通過熒光標記的方式,對PCR產物進行標記跟蹤,結合電腦軟件對每輪產物進行分析,從而精確計算待測樣品的初始模板量。目前熒光標記的方式比較多,但高中生物學試題?？嫉氖撬馓结?TaqMan探針)標記,以下題為例作重點介紹:

例4.實時熒光定量PCR(QPCR)實現了PCR從定性到定量的飛躍。TaqMan探針是QPCR技術中一種常用探針,圖3為TaqMan熒光探針及其作用原理示意圖:

正向引物:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

若每分子探針水解釋放的R基團熒光強度為A,加入B個模板DNA分子(目的基因),通過QPCR進行擴增。反應體系中熒光信號強度(Rn)與擴增次數(n)之間的關系:Rn=________。

答案：AB×(2n-1)

此類題目多對知識背景進行了簡化。這里補充一個知識:Taq酶不僅具有DNA聚合酶的性質,還兼有5′-3′外切酶的活性,在延伸到探針附近時,能將其5′端切離。

6.不對稱PCR

前五種PCR,加入的均為相向配制的成對引物,如果在反應體系中只加入一種引物,就只能擴增目的基因的一條鏈,這種擴增方式稱為不對稱PCR。這種PCR的主要目的就是讓需要研究的模板鏈含量迅速增加,常用于DNA單鏈的測序以及定點突變的檢測。在實際操作過程中,為了讓模板鏈的基數增加,也可以加一對引物,但兩種引物的濃度差異較大,使得一條鏈的擴增速度遠大于另一條,體現了不對稱的本質。以一道模擬題為例:

例5.不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物,在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中,其擴增產物最初主要是雙鏈DNA,但當限制性引物消耗完后,非限制性引物引導的PCR就會產生大量單鏈DNA。假設反應體系中原來有a個模板DNA,最初10個循環(huán)擴增產生雙鏈DNA,后20個循環(huán)均只擴增一條鏈,則需要限制性引物________個。因為雙鏈DNA和單鏈DNA的________不同,可通過________將其分離。

答案：(210-1)a相對分子質量(堿基數量) 電泳法

需要注意的是在不對稱PCR中,限制性引物與非限制性引物的最佳比例與模板鏈本身、引物的類型和長度等因素都有密切的關系,需要多次摸索和優(yōu)化。

7.結語

本文所列六類擴增技術在高中生物學考題中出現的頻率相對較高,隨著新高考試題對情境挖掘的深度和力度加大,以其他PCR技術為背景的考題肯定會陸續(xù)出現。

此外,各種PCR技術不是孤立的,它們均以常規(guī)PCR為基礎,為實現特定目的而進行了一定改進,但也有各自的局限性,因此在必要時可同時使用幾種擴增技術,如多重巢式PCR、反向實時熒光定量PCR等。

在高考備考中,要關注不同擴增技術的本質差異,同時總結此類試題的解答步驟:一是尋找題圖有效信息,確定所考PCR類型;二是迅速再憶所考PCR的獨特性,猜測出題人可能的意圖;三是根據設問對前述猜測進行驗證,并領悟出題人挖掘的新考點,進而對知識框架進行完善。