甲殼素納米晶體對帶魚肌原纖維蛋白的冷凍保護作用

黃秋鈺，俞珊，姜海鑫，童志勝，曾榮淮，龐杰，吳春華

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

冷凍作為一種最常用的長期保存魚糜的方法，可以抑制微生物的生長，降低酶的活性。但在凍藏過程中其肌原纖維蛋白質(zhì)不可避免地發(fā)生冷凍變性，從而對魚糜品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，影響其后續(xù)加工性能，造成資源浪費和經(jīng)濟損失[1-3]。目前添加抗凍劑是防止凍藏魚糜品質(zhì)下降的主要方法，工業(yè)上常用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖與4%山梨醇的混合液[4-5]。但由于傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑高甜高熱量的特點與如今消費者追求健康低熱量的消費趨勢不符[6-7]，因此，探尋低熱量、低甜度的糖類（菊粉、殼寡糖、甲殼素水解物、魔芋葡甘聚糖降解物、卡拉膠寡糖等）、酚類和蛋白水解物（抗凍蛋白/肽）等新型抗凍劑，并研究其抗凍效果已成為國內(nèi)外的研究熱點[3，7-10]。

糖類通過改變內(nèi)部結(jié)合水的狀態(tài)和性質(zhì)間接地發(fā)揮抗凍作用，其作用大小與羥基配位有關(guān)[11]，甲殼素納米晶體（chitin nanocrystals，ChNCs）是一種從水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物甲殼素中剝離出來的納米尺寸晶體，具有高比表面積、高結(jié)晶度和良好的穩(wěn)定性等優(yōu)良特性，可作為新型膳食纖維、食品穩(wěn)定劑和生物保鮮劑等應(yīng)用在食品領(lǐng)域中[12]。同時，ChNCs 結(jié)構(gòu)中的羥基、氨基和羧基基團容易與肌原纖維蛋白中的極性殘基基團形成氫鍵或離子鍵，可以提高凍藏魚糜的持水能力，延緩凍藏魚糜凝膠強度下降的趨勢，延緩肌原纖維蛋白氧化等，其優(yōu)勢可使其作為一種潛在的冷凍食品抗凍劑，但關(guān)于將ChNCs 應(yīng)用于水產(chǎn)品抗凍劑的研究鮮有報道。

本研究利用ChNCs 擁有的獨特結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以帶魚肌原纖維蛋白和ChNCs 為研究對象，將ChNCs 加入帶魚魚糜中冷凍保藏，探究ChNCs 對魚肌原纖維蛋白凍藏穩(wěn)定性的影響，以期為冷凍魚糜的低熱量抗凍劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶魚、蔗糖、山梨醇：市售；蛋白定量測定試劑盒（分光光度法）、總巰基（-SH）測試盒（分光光度法）、分型巰基（-SH）測試盒（分光光度法）：南京建成生物工程研究所；甲殼素、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物、亞氯酸鈉、次氯酸鈉、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純）、Tris-HCL 緩沖液（1 mol/L）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機（JJ-2BX）：方科儀器（常州）有限公司；恒溫水浴鍋（HH-1）：常州金壇良友儀器有限公司；精密色差儀（CS-200）：杭州彩譜科技有限公司；均質(zhì)機（T25）：艾卡（廣州）設(shè)備儀器有限公司；離心機（H2-16KR）：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；精密pH 儀（G13505）：美國賽默飛世爾科技公司；流變儀（MCR301）：奧地利安東帕有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA XT plus）：英國Stable Micro System 公司；紫外分光光度計（UV-1780）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 甲殼素納米晶體的制備

參照Wu 等[13]的方法制備甲殼素納米晶體（ChNCs）。

1.3.2 帶魚魚糜的制備

新鮮帶魚經(jīng)前處理后選取去骨去皮肉塊，用清水漂洗3～4 次，再用0.15%鹽水漂洗，并用吸水紙吸去多余水分，斬碎后獲得魚糜。將帶魚魚糜添加10%的玉米淀粉低溫攪拌30 min，保證最終魚糜含水量為80%。再分別與ChNCs 按比例混合攪拌，ChNCs 的添加量分別為0%、1%、3%、5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并以3%的商業(yè)抗凍劑（1.5%蔗糖與1.5%山梨醇混合）做陽性對照，作為將各組樣品裝袋凍藏于-18 ℃的冰柜中儲存0、7、14、21、28、35 d。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

帶魚中提取肌原纖維蛋白參照Cao 等[6]的方法并稍作修改。將1 mol/L Tris-HCl 稀釋成20 mmol/L，稱取魚糜20 g 加入5 倍體積且pH 值為7.2 的20 mmol/L Tris-HCl（含有0.1 mol/L KCl）溶液中，6 000 r/min 均質(zhì)，每均質(zhì)30 s 停止30 s，并重復(fù)均質(zhì)5 次，整個過程均在冰水浴中操作；然后，將勻漿在4 ℃、10 000×g 條件下離心20 min，除去上清液之后，沉淀繼續(xù)用5 倍體積的提取液重復(fù)均質(zhì)3 次；最后，用pH7 的20 mmol/L Tris-HCl（含有0.6 mol/L KCl）溶液均質(zhì)溶解沉淀物，并在4 ℃靜置1 h 后，10 000×g 離心20 min 取上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

1.3.4 鹽溶性蛋白含量測定

取2 g 肌原纖維蛋白溶液，加入9 倍體積的生理鹽水，4 ℃條件下機械勻漿，制備成10%的勻漿液，2 500 r/min 離心10 min，取50 μL 上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 總巰基和分型巰基測定

取5 g 肌原纖維蛋白溶液，加入9 倍體積的生理鹽水制成10%的蛋白勻漿，3 500 r/min 離心10 min，取上清液采用分光光度法測定分型巰基與總巰基含量。

1.3.6 帶魚魚糜流變學(xué)特性測定

使用流變儀測定樣品流變性能。將樣品放置在直徑為60 mm 的板上，狹縫距離設(shè)定為1 mm，流變儀探頭型號選擇PP50，板間距設(shè)置為1.0 mm，掃描頻率為1 Hz，應(yīng)變?yōu)?5%，溫度掃描設(shè)置在25～90 ℃范圍內(nèi)，升溫速率為5 ℃/min。

1.3.7 帶魚魚糜凝膠強度、持水性和白度測定

1.3.7.1 凝膠強度

破裂強度（B，g）和凹陷深度（C，cm）通過質(zhì)構(gòu)儀測量[14]。魚糜在80 ℃蒸煮20 min，室溫下平衡30 min 后制成魚糜凝膠。魚糜凝膠切成長度20 mm 的圓柱體，使用P/ 0.25 s 探頭，檢測前和檢測后速度設(shè)定為5 mm/s，中試速度1 mm/s，13.5 mm 的距離，觸發(fā)力為5×g，每個樣品10 個重復(fù)，測量在不同批次的樣品中重復(fù)2 次。凝膠強度（A，g·cm）計算公式如下。

A=B×C

1.3.7.2 持水性

魚糜凝膠的持水能力（water holding capacity，WHC）按Zhou 等[14]的方法測定。稱取20 g（m1）魚糜凝膠放入兩層濾紙折疊的盒子中，放入50 mL 的離心管中，6 000 r/min 離心20 min，去除濾紙稱量離心后魚糜總質(zhì)量，用雙層濾紙包裹魚糜凝膠，4 000 r/min 離心15 min，取下濾紙后，測量凝膠質(zhì)量，記錄為m2。持水率（H，%）的計算公式如下。

1.3.7.3 白度

魚糜及其凝膠的白度用色差儀測定[15]。將魚糜和魚糜凝膠切成20 mm 厚的薄片，然后測量并記錄L*（亮度）、a*（紅/綠）和b*（黃/藍(lán)）的值。白度（W）計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3 個重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過SPSS 軟件進行方差分析（ANOVA）檢驗，確定數(shù)據(jù)的顯著性。數(shù)據(jù)圖表采用OriginPro 2021 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChNCs 對冷凍貯藏中帶魚魚糜鹽溶性蛋白含量的影響

冷凍貯藏中鹽溶性蛋白含量的變化是反映蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)[16]。凍藏期間不同含量ChNCs對魚糜鹽溶性蛋白含量的影響如圖1 所示。

由圖1 可知，所有冷凍魚糜樣品的鹽溶性蛋白含量均呈現(xiàn)隨著凍藏時間的延長而降低的趨勢，且凍藏35 d 后，不含抗凍劑與加入1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組的樣品的鹽溶性蛋白含量分別降低至（42.29±1.42）%、（47.02±4.85）%、（59.70±1.92）%、（50.35±1.37）%和（62.84±1.57）%。試驗結(jié)果顯示，ChNCs 添加組的肌原纖維鹽溶性蛋白含量比不含抗凍劑組下降幅度小，當(dāng)ChNCs 添加量為3%時，肌原纖維鹽溶性蛋白下降的幅度最小，這可能是由于ChNCs 分子鏈中具有的氨基和羧基等特定官能團取代水分子，從而與蛋白質(zhì)分子作用，延緩蛋白質(zhì)的冷凍變性[5，17]。此外，圖1 結(jié)果顯示在凍藏35 d 時，不添加抗凍劑組的鹽溶性蛋白含量低于添加抗凍劑的試驗組，其中添加1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組鹽溶性蛋白含量最高，而3%ChNCs 的試驗組中鹽溶性蛋白僅次于1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組，這表明3%ChNCs 具備的抗凍效果十分接近1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組效果。

2.2 ChNCs 對冷凍貯藏中帶魚魚糜的總巰基和分型巰基含量的影響

凍藏期間不同含量ChNCs 對魚糜總巰基和分型巰基含量的影響如圖2 所示。

圖2 凍藏期間不同含量ChNCs 對魚糜巰基的影響Fig.2 Effect of different contents of ChNCs on the sulfhydryl groups of surimi during freezing

由圖2a 可知，新鮮帶魚魚糜的總巰基含量為（6.72±0.31）mol/105g，當(dāng)凍藏時間達到35 d 時，新鮮帶魚魚糜的總巰基含量降低至（3.33±0.08）mol/105g。這可能是因為在凍藏過程中肌原纖維蛋白冷凍變性，空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，分子內(nèi)更多的巰基暴露，被氧化為二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量的降低[1，3，9]。與對照組相比，添加ChNCs 的魚糜樣品中的總巰基含量也呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，添加量為1%、3%、5%ChNCs 的魚糜總巰基含量，分別下降41.96%、26.79%和37.50%。此外，添加商用抗凍劑的試驗組的總巰基含量緩慢下降，在凍藏35 d后，總巰基含量下降22.47%。上述結(jié)果表明，ChNCs 等抗凍劑的添加減緩了魚糜中的總巰基含量的下降速度，表明ChNCs 能夠抑制巰基氧化，延緩肌原纖維蛋白的冷凍變性，具有一定的抗凍效果，此結(jié)果與凍藏期內(nèi)的鹽溶性蛋白含量變化一致。

肌肉中較低的分型巰基含量通常表明肌原纖維蛋白氧化程度較高[18]。如圖2b 所示，新鮮帶魚魚糜中的分型巰基含量為（5.12±0.21）mol/105g，隨凍藏時間的延長，分型巰基含量快速降低至（2.24±0.12）mol/105g（凍藏35 d），而加入1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組樣品的分型巰基含量分別降低至（2.53±0.03）、（3.08±0.16）、（2.71±0.43）、（3.46±0.07）mol/105g；此外，在冷凍過程中，對照組中肌球蛋白分子的構(gòu)象變化可能導(dǎo)致分型巰基暴露，導(dǎo)致分型巰基含量降低，而ChCNs 的羥基基團與肌球蛋白形成的強氫鍵阻止分型巰基的暴露[3]。綜上所述，ChNCs 的添加能夠有效抑制帶魚魚糜中更多的分型巰基被氧化，提升帶魚魚糜的抗凍性。

2.3 ChNCs 對冷凍貯藏中帶魚魚糜流變性能的影響

儲能模量G′代表了魚糜凝膠的彈性行為，損耗模量G″則代表了魚糜凝膠的黏性特征[19-20]。ChNCs 的添加量對帶魚魚糜流變性能的影響如圖3～圖4 所示。

圖3 升溫中魚糜凝膠G′的變化Fig.3 Changes of surimi gel G′ during heating

圖4 升溫中魚糜凝膠G″的變化Fig.4 Changes of surimi gel G″during heating

在整個凍藏期間，所有處理組樣品的溫度應(yīng)變曲線都表現(xiàn)出G′遠(yuǎn)大于G″的現(xiàn)象，這表明凍藏期間帶魚魚糜中的具有彈性的成分較多，魚糜顯現(xiàn)出具有較好的彈性[21]。由圖3 可知，在不同凍藏時間內(nèi)G′的總體變化趨勢相似，而不同處理組的魚糜樣品的G′在加熱過程（25～90 ℃）中的曲線變化反映了魚糜的凝膠網(wǎng)絡(luò)隨溫度改變而產(chǎn)生的各種物理變化，因此可以將整個升溫變化過程大致分為3 個階段[20，21]。首先，在25～50 ℃的第一階段內(nèi)，G′隨溫度的升高而逐漸降低，并在接近50 ℃時降低到最低值，這可能與肌球纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，溫度升高提供了過高的能量，破壞了肌球纖維蛋白尾部的螺旋結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致螺旋結(jié)構(gòu)解旋，提高了分子鏈的流動性，不利于魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[20，22]；在50～80 ℃的第二階段，G′隨溫度的升高而快速增大，并在80～90 ℃進入第三階段，G′逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，這是因為溫度進一步升高導(dǎo)致大量的蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出大量的活性基團，增大了蛋白凝膠的交聯(lián)度[21-22]；此外，大量變性蛋白沉降聚集重新形成了結(jié)構(gòu)穩(wěn)固的凝膠網(wǎng)絡(luò)[23]。不同處理組的魚糜樣品的G′大小順序為1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇＞3%ChNCs＞5%ChNCs＞1%ChNCs＞對照組，這表明ChNCs 的添加能夠促進魚糜凝膠的形成。隨著凍藏時間的延長，G′呈現(xiàn)降低趨勢，這表明隨著凍藏時間的延長，魚糜樣品中的彈性組分下降，魚糜凝膠的彈性降低；然而，盡管隨著凍藏時間的延長，試驗組的G′仍然呈現(xiàn)相同的趨勢，這表明ChNCs 和商業(yè)抗凍劑均能夠抑制冰晶生長，為凍藏期間魚糜樣品中的肌原纖維蛋白提供保護，延緩蛋白質(zhì)的冷凍變性。

由圖4 可知，帶魚魚糜中損耗模量G″變化趨勢與G′變化趨勢相似。G″緩慢增加，當(dāng)溫度小于60 ℃時，魚糜內(nèi)部分子之間相互交聯(lián)，有著穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，不會對魚糜內(nèi)分子鏈之間化學(xué)鍵以及三維結(jié)構(gòu)造成破壞，繼續(xù)升高溫度會對魚糜內(nèi)部的結(jié)構(gòu)造成一定破壞，蛋白發(fā)生解鏈，延伸變長，導(dǎo)致流動性增加[24]。

2.4 ChNCs 對冷凍貯藏中帶魚魚糜凝膠性能的影響

2.4.1 帶魚魚糜凝膠的持水性

魚糜凝膠的持水性能體現(xiàn)了魚糜蛋白與水分子結(jié)合的程度，也反映了魚糜凝膠對水分子的束縛能力，是影響魚糜制品的重要因素。凍藏期間帶魚魚糜凝膠的持水性能如圖5 所示。

圖5 凍藏期間魚糜凝膠的持水性能變化Fig.5 Water holding capacity of surimi gel during freezing storage

由圖5 可知，各組魚糜凝膠的持水性能在凍藏過程中不斷降低，這可能是因為在凍藏期間蛋白質(zhì)的變性，空間結(jié)構(gòu)被破壞，水合作用降低和凝膠網(wǎng)絡(luò)的重組導(dǎo)致水分流失[6，16，25]。添加ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇后，魚糜凝膠的持水性能下降速率降低。當(dāng)凍藏35 d 后，添加1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇組的魚糜凝膠的持水性能分別降低至（67.78±1.02）%、（70.94±0.57）%、（67.83±0.54）%和（71.02±0.91）%，相較于對照組的（62.27±0.90）%有較為明顯的提升。上述結(jié)果顯示抗凍劑的添加提升了魚糜凝膠的持水性能，可能的原因是抗凍劑能夠吸收更多的水分，形成更強的蛋白網(wǎng)絡(luò)[26]，并且3%ChNCs 和商業(yè)抗凍劑對魚糜凝膠的提升效果接近，表明ChNCs 可能成為商業(yè)抗凍劑的潛在替代品。

2.4.2 帶魚魚糜凝膠的白度

白度主要通過色差參數(shù)L*、a*和b*計算獲得，反映了凍藏期間魚糜凝膠的顏色變化差異。Tao 等[21]研究表明白度主要由魚糜凝膠內(nèi)部的蛋白質(zhì)組成成分、變性蛋白質(zhì)的聚集程度和魚糜凝膠表面的光學(xué)參數(shù)決定。凍藏期間魚糜凝膠的白度變化如圖6 所示。

圖6 凍藏期間魚糜凝膠的白度變化Fig.6 Whiteness of surimi gel during freezing storage

由圖6 可知，對照組的初始白度為64.64±1.32，而隨著ChNCs 和商業(yè)抗凍劑的添加魚糜凝膠的白度有不同程度的上升，添加1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5% 山梨糖醇的魚糜凝膠的白度分別為68.99±0.87、69.89±0.51、67.99±0.81 和68.97±0.79；而隨著凍藏時間的延長，白度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，表明魚糜凝膠中的變性蛋白質(zhì)聚集，與文獻報道結(jié)果一致[3，22，27]。冷凍魚糜的白度還與致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，由于凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密性，使其透明度存在差異，因此添加量過多時白度值反而下降，5% ChNCs 組白度均低于3%ChNCs[28]。

2.4.3 帶魚魚糜凝膠的凝膠性能

魚糜經(jīng)過加熱蒸煮后能夠形成具有三維網(wǎng)絡(luò)的魚糜凝膠。凍藏期間魚糜凝膠的凝膠強度變化如圖7所示。

圖7 凍藏期間魚糜凝膠的凝膠強度變化Fig.7 Gel strength of surimi gel during freezing storage

由圖7 可知，所有魚糜凝膠隨著凍藏時間的延長，凝膠強度逐漸降低，表明魚糜凝膠不斷弱化，凝膠蛋白網(wǎng)絡(luò)逐漸被破壞。在第0 天時，相較于對照組（356.60±7.01）g·cm，添加ChNCs 和商業(yè)抗凍劑的試驗組凝膠強度更高，其中商業(yè)抗凍劑效果最好，為（548.10±12.58）g·cm，這表明添加的抗凍劑等外源物能夠有效提高魚糜凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)凍藏35 d 后，對照組魚糜凝膠強度降低至（144.08±11.23）g·cm，而試驗組魚糜凝膠分別為（205.43±7.44）g·cm（1% ChNCs），（328.53±10.69）g·cm（3%ChNCs），（250.68±7.62）g·cm（5%ChNCs）和（363.59±6.58）g·cm（1.5%蔗糖+1.5%山梨糖醇組）。從上述結(jié)果可以看出，在凍藏期間，未經(jīng)處理的對照組魚糜凝膠弱化，而添加了抗凍劑處理后的試驗組不僅能在凍藏前期提升魚糜凝膠的凝膠強度，還能在凍藏期間抑制魚糜凝膠的弱化作用。此外，3%ChNCs 具備的抗凍效果十分接近商業(yè)抗凍劑的效果。

綜上所述，ChNCs 的添加對冷凍貯藏中帶魚魚糜中的鹽溶性蛋白的含量、巰基含量和魚糜的流變學(xué)性能產(chǎn)生了積極的影響，這表明ChNCs 具有的抗凍性能顯著保護帶魚魚糜中肌原纖維蛋白的完整性；此外，ChNCs 還能增強魚糜凝膠的凝膠強度、持水性、白度和質(zhì)構(gòu)等理化特性，在凍藏期間抑制冰晶生長和凝膠弱化作用?；谏鲜鲈囼灲Y(jié)果，假想ChNCs 的可能抗凍保護機制如圖8 所示。

ChNCs 作為一類甲殼素改性多糖，具有羥基、氨基和羧基等特殊官能團，表面帶負(fù)電荷，能夠通過氫鍵或靜電相互作用與肌原纖維蛋白相互作用，從而延緩冰晶生長和氧化等理化變化對蛋白質(zhì)的損害，防止其冷凍變性[16]。另一方面，多數(shù)文獻報道表明，ChNCs 具有的大量羥基基團，使魚糜內(nèi)部的與水分子通過氫鍵結(jié)合，減少魚糜組織內(nèi)部的水分子遷移，游離水分子的減少不利于冰晶的形成與生長，從而提高魚糜制品的保水性，抑制冰晶對魚糜組織的損傷[8，17]。

3 結(jié)論

通過甲殼素納米晶體（ChNCs）對帶魚魚糜在凍藏期間的抗凍試驗，結(jié)果表明，ChNCs 能夠延緩凍藏期間魚糜的鹽溶性蛋白的含量、巰基含量的下降趨勢和增強魚糜的流變學(xué)性能，保護了帶魚魚糜中的肌原纖維蛋白的完整性；同時，ChNCs 還能增強魚糜凝膠的凝膠強度、持水性、白度等理化特性并延緩這些指標(biāo)在凍藏期間的快速下降趨勢，抑制在凍藏期間冰晶生長和凝膠弱化作用。與常規(guī)商業(yè)抗凍劑（1.5%蔗糖+1.5%山梨糖醇）相比，3%ChNCs 的抗凍效果并不弱于商業(yè)抗凍劑。此外，作為新型膳食纖維的ChNCs，能夠降低魚糜制品的甜度；相比于商業(yè)抗凍劑，ChNCs 能夠成為健康有效的抗凍劑的潛在替代品，為食品工業(yè)的高性能抗凍劑研究提供思路。