濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)解析及其與風味物質(zhì)的相關(guān)性

宋建陽，梁莉瑩，岑定運，武思雨，郭書賢，許彬，王春艷*

（1.南陽理工學院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院土木工程學院，河南 南陽 473004）

白酒釀造過程實質(zhì)上是微生物繁殖和代謝的過程。濃香型白酒其豐富、獨特的口感正是來自于釀酒微生物群的發(fā)酵作用，例如真菌菌群是產(chǎn)酒精、產(chǎn)香的主要功能菌，也具有很高的糖化酶及酯化酶活力[1-2]，這些微生物群在釀酒周期內(nèi)不斷動態(tài)變化，與整個釀酒過程中所形成的生存環(huán)境相適應(yīng)，經(jīng)過相應(yīng)的釀造工藝產(chǎn)生了白酒的獨特口味[3-4]。

目前，隨著宏基因組測序技術(shù)在傳統(tǒng)白酒發(fā)酵中的廣泛應(yīng)用，微生物群落結(jié)構(gòu)與白酒風味物質(zhì)的相關(guān)性研究成為熱點問題[5-7]。吳成等[8]研究醬香型白酒4 輪次堆積發(fā)酵過程風味物質(zhì)與微生物群落間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)酵母菌主要與醇類物質(zhì)呈正相關(guān)顯著，絲狀真菌和細菌主要與酸類和酯類物質(zhì)呈正相關(guān)顯著。劉凡等[9]研究發(fā)現(xiàn)，洋河濃香型白酒發(fā)酵過程與主要有機酸合成相關(guān)的7 個菌屬微生物；蒙德俊等[10]以醬香型白酒7 輪次發(fā)酵酒醅樣品為研究對象，分析發(fā)現(xiàn)了畢赤酵母屬和酵母菌屬與乳酸呈顯著相關(guān)。王鵬等[11]采用微生物群落與揮發(fā)性化合物輪廓關(guān)聯(lián)分析獲得功能相關(guān)的微生物群，又通過共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析獲得共現(xiàn)微生物群，最終確定了白酒發(fā)酵過程中的核心微生物群。

本研究以濃香型白酒不同發(fā)酵周期的酒醅樣品為研究對象，對其微生物群落結(jié)構(gòu)及其風味物質(zhì)進行解析，并對兩者之間的相關(guān)性進行預測，嘗試了解濃香型白酒發(fā)酵過程中的主要功能微生物群，為白酒生產(chǎn)的定向調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

酒醅樣品來自河南宋河酒業(yè)有限公司16 年窖池。分別采集發(fā)酵第0、3、6、9、15、21、27、33、48、60 天的窖池中心上、中、下3 層樣品，放入無菌采樣袋中，充分混勻后低溫運回實驗室，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

4-辛醇（色譜純）：美國Sigma 公司；NaCl（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；E.Z.N.ATM Mag-Bind 土壤DNA 提取試劑盒：美國OMEGA 公司；Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒：美國Beckman 公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒：美國Life 公司。

1.3 試驗儀器與設(shè)備

7890B-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent7697A頂空進樣系統(tǒng)、HP-INNOWAX 色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美國安捷倫科技有限公司；EC3 凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP 公司；T100 Thermal Cycler PCR 儀：美國Bio-RAD 公司；Illumina Miseq PE250 高通量測序儀：美國Illumina 公司。

1.4 方法

1.4.1 酒醅中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

采用靜態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜法（static headspace gas chromatography-mass spectrometry，SHSGC-MS）對酒醅中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析。取2.0 g 酒醅樣品加入8 mL 超純水中，4 ℃過夜，冰浴超聲30 min 后，于4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，將8 mL 已離心的酒醅提取液加入到20 mL 頂空瓶中，再加入3.0 g NaCl 和質(zhì)量濃度為125 mg/L 的內(nèi)標物4-辛醇25 μL。采用頂空進樣器處理樣品[12]。

GC 條件：HP-INNOWAX 色譜柱；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 升溫至80 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至170 ℃，以10 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min。

MS 條件：電子電離（electronic ionization，EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500[13]。

通過質(zhì)譜解吸以及與NIST 05 a.L 標準譜庫比對，進行定性分析，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.4.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

采用DNA 提取試劑盒對酒醅樣品進行微生物基因組DNA 提取，具體步驟參見試劑盒說明，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提樣本DNA 進行完整性檢測。

以基因組DNA 為模板，采用B341F 和B785R 引物[14]對酒醅樣品中細菌16S rDNA 的V3～V4 區(qū)進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，采用ITS1FI2 和ITS2 引物[15]對酒醅樣品中真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列進行PCR 擴增。PCR 擴增體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，DNA 模板10 ng，正反向引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.05 U，用雙蒸水補充至50 μL。

細菌PCR 擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共5 個循環(huán)；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min[14]。

真菌PCR 擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5 個循環(huán)；然后94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min[15]。

PCR 產(chǎn)物切膠純化后進行精準定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq 高通量測序。

1.4.3 高通量數(shù)據(jù)處理

采用Cutadapt（v1.9.1）、Prinseq（v0.20.4）及Flash（1.2.3）軟件對高通量測序序列進行質(zhì)控，包括序列拼接、去掉含有N 的序列、去除引物和接頭、去除質(zhì)量值＜20 的堿基及長度＜200 bp 的序列及去除嵌合體。

經(jīng)過質(zhì)控的序列在97%相似性水平下進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析。利用Silva 數(shù)據(jù)庫，采用Mothur（1.30.1）軟件在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成，同時計算各個樣品的覆蓋率以及微生物α 多樣性指數(shù)，包括辛普森（Simpson）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、ACE 和Chao1指數(shù)。

1.4.4 酒醅揮發(fā)性風味物質(zhì)與微生物相關(guān)性分析

本研究選取酒醅樣品微生物高通量測序結(jié)果中相對豐度排序在前20 的細菌屬和前20 的真菌屬信息與風味物質(zhì)進行相關(guān)性分析。首先使用RStudio 中的psych 包計算微生物與代謝物之間的spearman 相關(guān)系數(shù)（r），以r＞0.5 且p＜0.05 為閾值找出可視化對象，然后選用Cytoscape 3.6.1 對微生物和代謝物之間的相互作用關(guān)系進行可視化，表征微生物對風味物質(zhì)的貢獻[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風味成分的測定結(jié)果

利用GC-MS 方法對濃香型白酒酒醅進行主要揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，酒醅中主要風味成分為酯、醇、酚、烷、酸、烯類等化合物，其中酯類136種、醇類39 種、酸類34 種、酚類12 種、烯烴類8 種、烷類20 種、醛類6 種、酮類9 種、醚類4 種。

白酒發(fā)酵過程酒醅樣品中主要酯含量變化見圖1。

圖1 白酒發(fā)酵過程酒醅樣品中主要酯含量變化Fig.1 Change of main ester content in fermented grains during Baijiu fermentation

如圖1 所示，本次采集的酒醅樣品中，檢測到豐度較高（平均濃度＞0.1 μg/g）的酯類物質(zhì)有10 種，分別是己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、庚酸乙酯、乙酸己酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯。其中豐度最高的為己酸乙酯，在整個發(fā)酵周期內(nèi)，己酸乙酯平均檢測值到22.45 μg/g，是濃香型白酒的主體香成分，對濃香型白酒風格的形成有重要作用[16-17]，其次為辛酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯以及己酸己酯。從發(fā)酵開始，隨著乙醇和多種有機酸的產(chǎn)生，酯類合成開始，發(fā)酵至第15 天，酯類總含量達到最高值，發(fā)酵末趨于穩(wěn)定。

白酒發(fā)酵過程酒醅樣品中主要酸含量變化見圖2。

圖2 白酒發(fā)酵過程酒醅樣品中主要酸含量變化Fig.2 Change of main acid content in fermented grains during Baijiu fermentation

如圖2 所示，酒醅樣品中檢測到的有機酸主要以己酸、乙酸、丁酸、正戊酸和辛酸為主，其總和占總有機酸含量的92.4%，是酯類合成的主要前體物質(zhì)。其中己酸豐度最高，在整個發(fā)酵周期內(nèi)，每克酒醅樣品中平均檢測到3.72 μg 己酸。

2.2 酒醅微生物α 多樣性分析

采用Illumina Miseq 測序平臺得到白酒酒醅樣品細菌有效序列數(shù)42 937～58 935，97%相似水平下的OTU數(shù)目為981～2 390；真菌有效序列數(shù)為49 546～76 613，OTU 數(shù)目為457～759。酒醅樣品微生物α 多樣性結(jié)果見表1。

表1 酒醅樣品中細菌和真菌α 多樣性指數(shù)Table 1 The α diversity of bacteria and fungi in fermented grains

豐富度指數(shù)Chao1 和ACE 越大，表明群落物種豐富度越高；多樣性指數(shù)Shannon 越大或Simpson 越小，表明群落物種的多樣性越高。由表1 中細菌α 多樣性指數(shù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期（3～6 d），酒醅樣品中Simpson 指數(shù)出現(xiàn)最小值，Shannon 指數(shù)、ACE 和Chao1 指數(shù)均出現(xiàn)最大值，說明在發(fā)酵初期酒醅中微生物菌群的豐富度和多樣性最高，推測可能是由于在發(fā)酵初期底物充足，來自酒曲、窖池中的多種微生物活躍，呈現(xiàn)了較為豐富的多樣性。隨后多樣性指數(shù)及豐富度指數(shù)均呈現(xiàn)不同程度下降，隨著發(fā)酵的進行，分解原料產(chǎn)生的有機酸、乙醇等物質(zhì)過多，使一部分微生物不能適應(yīng)酸度過高的發(fā)酵環(huán)境，生長受到抑制，到達發(fā)酵后期，微生物的多樣性及豐富度均達到最低。真菌α 多樣性指數(shù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，酒醅樣品在發(fā)酵第3 天，物種豐富度最高，在發(fā)酵第33 天，物種多樣性呈現(xiàn)最大值。細菌的豐富度和多樣性高于真菌，本研究結(jié)果與其他報道基本一致[9，18]。

2.3 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

基于門水平酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖3。

圖3 基于門水平酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on phylum level

如圖3 所示，基于細菌OTU 注釋分析，酒醅樣品中共得到16 個門，優(yōu)勢菌門（任一樣品相對豐度≥1%）7 個，非優(yōu)勢菌門和未注釋（unclassified）門的OTU 歸為其它。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有厚壁菌門（Firmicutes）、菌擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）。整個發(fā)酵過程中厚壁菌門是豐度最高的優(yōu)勢門，其相對豐度為27.54%～93.65%。菌擬桿菌門、變形菌門和綠彎菌門在發(fā)酵前期豐度較高，隨著發(fā)酵的進行相對豐度呈波動式降低，至發(fā)酵第60 天相對豐度均低于1%。

基于門水平酒醅中真菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖4。

圖4 基于門水平酒醅中真菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on phylum level

如圖4 所示，基于真菌OTU 注釋分析，酒醅樣品共得到8 個真菌門，優(yōu)勢菌門3 個，其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。整個發(fā)酵過程中子囊菌門是豐度最高的優(yōu)勢門，其相對豐度在入料樣品（0 d）中達到91.09%，最后緩慢降低，發(fā)酵結(jié)束穩(wěn)定在48.41%。高含量的Ascomycota 對驅(qū)動酒醅活性微生物群落變化起重要作用[18]。

基于屬水平酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖5。

圖5 基于屬水平酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on genus level

如圖5 所示，細菌屬水平上，酒醅樣品共檢測到169 種，優(yōu)勢菌屬（任一樣品相對豐度≥1%）有29 種。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有乳桿菌屬（Lactobacillus）、蚤蠅屬（Levilinea）、普雷沃菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、牦牛瘤胃菌（Proteiniclasticum）和Macellibacteroides。未分類菌（unclassified）和未注釋到屬的未知菌在發(fā)酵過程中所占比例較高（16.82%～84.61%），表明白酒發(fā)酵過程中微生物種屬復雜。

基于屬水平酒醅中真菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖6。

圖6 基于屬水平酒醅中真菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on genus level

如圖6 所示，酒醅樣品檢測到真菌屬43 種，優(yōu)勢菌屬有15 種。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有酵母菌目的未分類屬（unclassified Saccharomycetales）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、Naumovozyma、假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、青霉菌屬（Penicillium）和鐮刀霉（Fusarium），這與我國其它濃香型白酒產(chǎn)區(qū)相關(guān)研究中優(yōu)勢屬種類一致性較高[9，19]。

2.4 微生物與風味物質(zhì)的相關(guān)性分析

酒醅樣品微生物與主要風味物質(zhì)的相關(guān)性分析如圖7 所示。

圖7 酒醅樣品主要微生物與風味物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.7 Correlation network between main microbial genera and volatile compounds

如圖7 所示，相關(guān)性分析中共有238 個有效連接點，其中真菌Thermomyces、Naumovozyma 和Saccharomyces 是連接度最大的3 個真菌屬（26，20，17），細菌Lactobacillus、醋酸桿菌（Acetobacte）和梭狀芽孢桿菌XlVa（Clostridium XlVa）是連接度最大的3 個細菌屬（18，10，10）。濃香型白酒四大酯類物質(zhì)分別為己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Naumovozyma、Aspergillus、Thermomyces、Saccharomyces和Candida 與己酸乙酯（V24）具有較強相關(guān)性；擬桿菌屬（Bacteroides）和Lactobacillus 與乙酸乙酯（V5）具有較強相關(guān)性；Aspergillus 與丁酸乙酯（V4）強相關(guān)；Naumovozyma、Thermomyces、Fusarium、根毛霉屬（Rhizomucor）、孢圓酵母（Torulaspora）、Acetobacter 和梭狀芽孢桿菌IV（Clostridium IV）與乳酸乙酯（V16）具有較強相關(guān)性。Naumovozyma、Thermomyces、Saccharomyces、Candida 和Lactobacillus 與醇類物質(zhì)有關(guān)聯(lián)，Lactobacillus和Thermomyces 與酸類物質(zhì)呈正相關(guān)。

綜上，Spearman 相關(guān)性結(jié)果顯示，在濃香型白酒發(fā)酵過程中，Thermomyces、Naumovozyma、Saccharomyces、Lactobacillus、Acetobacte、Clostridium、Candida和Aspergillus 對酯、醇等主要風味物質(zhì)的產(chǎn)生具有顯著貢獻作用。Saccharomyces 和Lactobacillus 同樣是劉凡等[9]和王鵬等[11]的研究中與濃香型白酒主要風味物質(zhì)相關(guān)的核心和關(guān)鍵酒醅微生物。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高通量測序技術(shù)檢測濃香型白酒連續(xù)發(fā)酵的酒醅樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果顯示，發(fā)酵過程中共檢測到揮發(fā)性風味成分268 種，其中酯類136 種、醇類39 種、酸類34 種、酚類12 種、烯烴類8 種、烷類20 種、醛類6 種、酮類9 種、醚類4 種。己酸乙酯是豐度最高的酯類物質(zhì)，構(gòu)成了濃香型白酒的主體香成分。高通量測序結(jié)果結(jié)果表明，發(fā)酵過程中酒醅樣品細菌的豐富度和多樣性高于真菌，厚壁菌門（Firmicutes）和子囊菌門（Ascomycota）分別是豐度最高的優(yōu)勢細菌門和真菌門。平均相對豐度大于1%的優(yōu)勢細菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、蚤蠅屬（Levilinea）和普雷沃菌屬（Prevotella）等；優(yōu)勢真菌屬有酵母菌目的未分類屬（unclassified Saccharomycetales）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和曲霉屬（Aspergillus）等。主要微生物與揮發(fā)性風味物質(zhì)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)連接圖顯示，Thermomyces、Naumovozyma、酵母屬（Saccharomyces）、Lactobacillus、醋酸桿菌（Acetobacte）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、假絲酵母屬（Candida）和Aspergillus 是濃香型白酒揮發(fā)性風味物質(zhì)產(chǎn)生的主要貢獻微生物。