色譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品真菌毒素的檢測(cè)方法研究

◎ 汪秀秀

（河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

真菌毒素屬于一種特定的真菌，在一定條件下產(chǎn)生的一種小分子次生代謝物質(zhì)，廣泛存在于不同的食品中。在我國(guó)，已經(jīng)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)確認(rèn)的有400 多種真菌毒素，常見的毒素有黃曲霉毒素( AFs)、單端孢霉烯族化合物毒素(TCTs)、伏馬毒素( FBs)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮等。其危害性較大，可能引起人類以及動(dòng)物的急性或者慢性中毒現(xiàn)象，長(zhǎng)期攝入可能引起基因的突變以及畸形現(xiàn)象，甚至誘發(fā)腫瘤等嚴(yán)重疾病。因此，世界衛(wèi)生組織將真菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)控項(xiàng)目范圍內(nèi)。對(duì)于食品中真菌毒素含量的檢測(cè)方法，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。其中酶聯(lián)免疫法具有較高的靈敏程度，但是其重復(fù)性和專屬性相對(duì)較差，很容易出現(xiàn)假陽性的特點(diǎn)。液相色譜法的處理步驟較為煩瑣，且檢出的限定量都相對(duì)較高。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較為準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點(diǎn)，靈敏程度也相對(duì)較高。由于其步驟較為煩瑣且耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，因此，也屬于當(dāng)前檢測(cè)工作主要改進(jìn)的方向[1]。

1 真菌毒素的檢測(cè)

當(dāng)前，在真菌毒素的檢測(cè)過程中，主要采用的處理方式是通過固相分散技術(shù)提取的方式來實(shí)現(xiàn)，MAX固相萃取小柱凈化技術(shù)。以此來對(duì)大米、面粉、玉米、豆制品、糕點(diǎn)、食用油、肉制品和水果等常見食品中的多種真菌毒素進(jìn)行科學(xué)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)前處理步驟的有效簡(jiǎn)化，降低檢測(cè)成本，提升檢測(cè)效率。

2 色譜檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)方法應(yīng)用

2.1 檢測(cè)樣品、設(shè)備

本研究將小麥和玉米代謝所產(chǎn)生的真菌毒素作為檢測(cè)的主要對(duì)象，檢測(cè)樣品主要為小麥和玉米，從市場(chǎng)當(dāng)中獲取。檢測(cè)物質(zhì)有黃曲霉毒素、T-2 毒素、OTA、DON 等標(biāo)準(zhǔn)液，乙醇、乙腈等輔助液體。

檢測(cè)設(shè)備：安捷倫1260 高效液相色譜儀。

2.2 檢測(cè)方式

在實(shí)際檢測(cè)中，需根據(jù)糧食的真菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來完成對(duì)檢測(cè)樣品AFS、OTA、ZEN、DON、T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)液的配置，確保標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度符合檢測(cè)的實(shí)際要求。甲醇和水按照50 ∶50 的比例進(jìn)行配置，將各種標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成為檢測(cè)所需溶液。稱取粉末狀態(tài)的5.0 g 小麥和玉米樣品，將其均勻放置在5 個(gè)體積相等、環(huán)境相同的容器中，在不同的小麥樣品中添加AFS、OTA、ZEN、DON 及T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)液，制得檢測(cè)所需的樣品。利用安捷倫1260 高效液相色譜儀對(duì)不同小麥樣品中所含的真菌毒素波長(zhǎng)進(jìn)行有效檢測(cè)，其中安捷倫1260 高效液相色譜儀5 種毒素分別對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm、460 nm、460 nm、無及無，其對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)分別為364 nm、332 nm、276 nm、220 nm 及 201 nm。對(duì)于小麥樣品而言，在真菌毒素的實(shí)際檢測(cè)過程中進(jìn)行色譜柱的選擇需要滿足幾個(gè)方面的條件，分別為流動(dòng)相A 為甲醇-乙腈溶液，流動(dòng)相B 為0.1%的乙酸溶液。將配置完成的小麥和玉米樣品放入離心管內(nèi)，在其中加入20 mL 80%的乙腈溶液，保持30 min 的振蕩旋轉(zhuǎn)操作之后，再將其溶液放置常溫環(huán)境中，進(jìn)行10 min 的離心處理且保持4 000 r·min-1的離心轉(zhuǎn)速，通過此種方式來對(duì)實(shí)際檢測(cè)的樣品進(jìn)行提取[2]。

2.3 結(jié)果分析

在提取溶劑的優(yōu)化方面，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比了甲醇、乙腈、丙酮、1% 乙酸-乙腈、1%乙酸-甲醇，對(duì)以上幾種提取溶液的提取效果分析，最終發(fā)現(xiàn)利用1%的乙酸 -乙腈進(jìn)行提取操作，目標(biāo)化合物的回收率都滿足要求，回收率高于78.1%且干擾較少。因此，可以乙腈作為提取液來進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)研究。

在凈化條件的優(yōu)化方面，采用EN15662 的凈化方式來對(duì)不同比例下的PSA 和C18 進(jìn)行凈化操作。在實(shí)驗(yàn)的過程中，對(duì)多種真菌毒素的回收率和基質(zhì)效應(yīng)在應(yīng)用過程中產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析之后，可以確定最終的凈化目標(biāo)化合物為150 mg 的PSA，200 mg 的C18，1 200 mg 的MgSO4。

對(duì)于色譜條件的優(yōu)化，在試驗(yàn)的過程中要對(duì)多種溶液進(jìn)行分析和對(duì)比，比如甲醇-水、乙腈-水、0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈、甲醇-10 mmoL·mL-1乙酸銨溶液，將其作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫操作。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水和乙腈-水的體系當(dāng)中，出現(xiàn)了多種現(xiàn)象，比如峰型差、拖尾以及有雜峰等現(xiàn)象；0.05%的甲酸水-0.05%的甲酸甲醇是流動(dòng)相洗脫的過程當(dāng)中，分離度最好且響應(yīng)值都相對(duì)良好的物質(zhì)。因此，流動(dòng)相可以選擇0.05%的甲酸水-0.05%的甲酸甲醇物質(zhì)[3]。

最終方式的驗(yàn)證，需要經(jīng)過多種方式來進(jìn)行驗(yàn)證操作。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限進(jìn)行驗(yàn)證，要基于真菌毒素的實(shí)際情況進(jìn)行響應(yīng)強(qiáng)弱的分析，對(duì)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行配置。各個(gè)真菌毒素的面積峰值用Y來表示，質(zhì)量濃度用X來表示，將兩者利用線性回歸方程進(jìn)行操作對(duì)比，其中的基質(zhì)屬于空白樣品。經(jīng)過測(cè)試得出結(jié)論：在多種真菌毒素中，2～100 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系系數(shù)處于0.996 68～0.999 94 的范圍之間。根據(jù)多種真菌毒素在質(zhì)譜MRM 模式下的不同操作方式，可以將其配置成多種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)中，以藜麥空白樣品作為基質(zhì)，對(duì)其添加多種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)樣品的前處理方式方法進(jìn)行操作。對(duì)其進(jìn)行測(cè)定分析之后，按照3 倍的信噪比分析得出最低檢出限，也就是LOD，根據(jù)10 倍的信噪比分析得出最低的定量限。產(chǎn)生的結(jié)果如表1 所示，其中，真菌毒素的檢出限范圍為0.75 μg·kg-1～3.74 μg·kg-1，定量限的檢出范圍為2.20 μg·kg-1～11.00 μg·kg-1之間。

表1 多種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液通過 LC-MS-MS 分析所得的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限表

在回收率和精密度方面進(jìn)行分析，將藜麥空白谷物作為樣品進(jìn)行分析，在其中添加多個(gè)水平的真菌毒素緩和標(biāo)準(zhǔn)溶液，包含低、中以及高3 個(gè)水平階段，根據(jù)上述的處理步驟進(jìn)行對(duì)應(yīng)的前處理操作之后可以對(duì)其作出科學(xué)測(cè)定[4]。對(duì)每個(gè)不同階段的水平進(jìn)行測(cè)試的實(shí)驗(yàn)要達(dá)到6 次以上，分析得出真菌毒素的平均回收率處于78.1～102.3區(qū)間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差處于1.0～7.7之間。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以得出最終結(jié)論，其中，最佳流動(dòng)相包含幾個(gè)方面的內(nèi)容，對(duì)于35%的流動(dòng)相A 和65%的流動(dòng)相B 混合溶液，0～11 min 之內(nèi)可以達(dá)到混合狀態(tài)。對(duì)于55%的流動(dòng)相A 和65%的流動(dòng)相B，11～23 min 內(nèi)達(dá)到混合狀態(tài)。對(duì)于35%的流動(dòng)相A 和65%的流動(dòng)相B 來說，可以在23～38 min 之內(nèi)達(dá)到混合的狀態(tài)。因此，利用提取和凈化的方式可以最大限度提升檢測(cè)的準(zhǔn)確率[5]。

3 結(jié)語

綜上所述，利用色譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)小麥和玉米中的AFS、OTA、ZEN、DON 及 T-2 真菌毒素進(jìn)行分析，具備較高的靈敏性，在真菌毒素的檢測(cè)回收率方面也相對(duì)較高，好于其他檢測(cè)方式方法。因此，在糧食真菌毒素檢測(cè)方面要大力推廣色譜檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)的糧食安全提供更加有效的保障。