油莎豆對(duì)大鼠的致畸作用研究

李春鑫，于美琴，楊海龍，2，宋萬獻(xiàn)，張 戈，王會(huì)偉，

（1．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002；2．鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450005）

油莎豆是目前已知唯一在塊莖中大量積累油分的植物[1]，因其單產(chǎn)高、適應(yīng)性廣、病蟲害少、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富及綜合利用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[2]，成為新世紀(jì)我國(guó)擴(kuò)大糧油自主供給能力的理想作物。2019年科技部立項(xiàng)攻關(guān)油莎豆產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)，并進(jìn)行集成示范，2022 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部首次將油莎豆列入《“十四五”全國(guó)種植業(yè)發(fā)展規(guī)劃》。由此，油莎豆產(chǎn)業(yè)化正式進(jìn)入新的快速發(fā)展階段。

油莎豆作為一種高綜合利用價(jià)值作物，可用于榨油、制作面粉、釀酒、制作豆?jié){和豆奶以及成分提取等[3-4]，是典型的食用農(nóng)產(chǎn)品。目前，油莎豆及其制品在歐洲、非洲、北美、澳新等國(guó)家都非常流行，被稱為“來自上帝的休閑食品”[1]，到2020 年，油莎豆產(chǎn)業(yè)總值已超過20 億美元[5]。同時(shí)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)油莎豆可以有效清除人體內(nèi)的自由基[6]，對(duì)預(yù)防人體多種癌癥、高血糖、高血脂、消化道疾病等方面均具有顯著作用[7-9]，具有廣闊的藥食同源潛力，在世界范圍內(nèi)有望成為重要的健康食物來源。

我國(guó)油莎豆的種植已有近70 年的歷史[1]，但由于油莎豆原產(chǎn)地是非洲[2]，一直未正式進(jìn)入我國(guó)的新食品原料目錄，嚴(yán)重制約了我國(guó)油莎豆的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。根據(jù)我國(guó)《新食品原料安全性審查管理辦法》規(guī)定，需要對(duì)外來物種的食品安全性進(jìn)行評(píng)估，以檢測(cè)其具有的食品原料特性，是否符合新食品原料應(yīng)有的營(yíng)養(yǎng)要求，且無毒、無害，對(duì)人體健康不造成任何急性、亞急性、慢性或者其他潛在性危害。

據(jù)此，本文以黃淮產(chǎn)區(qū)主栽品種豫油莎2 號(hào)為原料開展不同濃度油莎豆對(duì)大鼠的致畸試驗(yàn)，明確油莎豆的遺傳毒理特征表現(xiàn)，探討油莎豆食用致畸作用。本文研究結(jié)果將為油莎豆食用安全的科學(xué)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持，進(jìn)一步提高對(duì)油莎豆食用性的了解，為解決油莎豆產(chǎn)品入市的法規(guī)障礙、緩解我國(guó)健康糧油自主供給能力提供助力。

1 材料與方法

1.1 受試物

油莎豆，15 kg，鮮豆（塊莖），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，受試樣品在4 ℃、干燥條件下貯藏，無需避光。取13 kg 樣品，粉碎后收集到12.7 kg粉末作為受試物。

1.2 動(dòng) 物

選用SPF 級(jí)健康性成熟SD 大鼠，雌性（未交配過）100 只，雄性50 只，均為3 月齡，由邳州市東方養(yǎng)殖有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0003，合格證編號(hào)202135129。

1.3 飼養(yǎng)條件

試驗(yàn)動(dòng)物在溫度為20～26 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%的本中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（蘇）2020-0006。輻照滅菌飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證：蘇飼證（2019）01008。

1.4 劑量分組及樣品配制

根據(jù)《GB 15193.14-2015 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 致畸試驗(yàn)》中的規(guī)定，以受試物最大配制濃度最大灌胃體積作為高劑量組，即8 g/kg組。設(shè)定2、4 g/kg分別為低、中劑量組。另設(shè)1個(gè)溶劑對(duì)照（0 g/kg）。受試樣品用純水配制，高、中、低劑量組配制濃度分別為800、400、200 mg/mL，受試物新鮮配制，每日在同一時(shí)間灌胃1 次，根據(jù)母體體質(zhì)量調(diào)整灌胃體積。灌胃體積為10 mL/kg，各組灌胃體積一致。溶劑對(duì)照組以純水代替受試物。

1.5 主要試劑與儀器

1.5.1 儀器與器材體視顯微鏡、T-1000 型電子天平、JJ-100型電子天平、0-150 mm游標(biāo)卡尺。

1.5.2 試劑茜素紅、氫氧化鉀、甘油、固定液（Bouins液），均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。配制主要試劑，茜素紅染液：取茜素紅0.1 g，氫氧化鉀10 g，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。透明液A：甘油200 mL，氫氧化鉀10 g，蒸餾水790 mL 混合。透明液B：甘油與蒸餾水等量混合。

1.6 試驗(yàn)方法

將性成熟雌、雄大鼠按1∶1同籠，每日早晨檢查陰栓，確定是否受孕。發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日作為受孕0 天。如果5 d 內(nèi)未發(fā)現(xiàn)陰栓，更換雄鼠。檢出的孕鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組不少于16只。在受孕的第6～15 天，2、4、8 g/kg 組分別給予相應(yīng)濃度的油莎豆，溶劑對(duì)照組以純水代替受試樣品，按10 mL/kg 灌胃，每天1 次。受孕第0、6、9、12、15、20 天稱量，并調(diào)整給受試物的量。

試驗(yàn)期間每天觀察孕鼠的一般情況，于妊娠第20天采用CO2麻醉法處死孕鼠，剖腹取出子宮，稱子宮連胎質(zhì)量，記錄并檢查黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)?；钐ナ笥涗浱プ畜w質(zhì)量、體長(zhǎng)并檢查胎鼠外觀有無畸形。

將每窩1/2的活胎于Bouins液中固定2周后，進(jìn)行徒手切片作內(nèi)臟檢查；將每窩1/2 活胎去皮、去內(nèi)臟及脂肪后，放入茜素紅溶液染色，當(dāng)天搖動(dòng)2～3 次，待骨骼染成紅色時(shí)為止。將胎鼠放入透明液A 中1～2 d，換入透明液B中2～3 d。待胎鼠骨骼已染紅，而軟組織的紫紅色基本褪去，換置甘油中，觀察骨骼畸形。

1.7 觀察指標(biāo)

母體體質(zhì)量、體質(zhì)量增量（處死時(shí)母體體質(zhì)量-孕期第6天體質(zhì)量）、子宮連胎質(zhì)量、體質(zhì)量?jī)粼隽浚ㄌ幩罆r(shí)母體體質(zhì)量-子宮連胎質(zhì)量-孕期第6天體質(zhì)量）、著床數(shù)、黃體數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)及百分率、胎仔的體質(zhì)量及體長(zhǎng)、有畸形的胎仔數(shù)（包括外觀、骨骼和內(nèi)臟畸形），有畸形胎仔的窩數(shù)及百分率、單項(xiàng)畸胎率和總畸胎率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。率的比較使用卡方檢驗(yàn)，孕鼠體質(zhì)量增量用方差分析，胎鼠體長(zhǎng)、體質(zhì)量、窩平均活胎數(shù)、子宮連胎盤重用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。胎鼠的數(shù)據(jù)以窩為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 油莎豆對(duì)孕鼠一般情況和體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，溶劑對(duì)照組實(shí)際孕鼠數(shù)為18 只，2 g/kg 組實(shí)際孕鼠數(shù)為19只，4 g/kg 組實(shí)際孕鼠數(shù)為16只，8 g/kg組實(shí)際孕鼠數(shù)為17只。各組其它未孕大鼠在第20天剖檢后未發(fā)現(xiàn)明顯異常，作淘汰處理。

各劑量組孕鼠在觀察期內(nèi)精神狀態(tài)、一般活動(dòng)未發(fā)現(xiàn)異常體征，第20天處死后大體解剖肉眼均未見明顯異常。

由表1 可見，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠初始體質(zhì)量與溶劑對(duì)照組相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。即孕鼠的初始體質(zhì)量在各組間較為均衡。

表1 油莎豆對(duì)孕鼠體質(zhì)量及其增量的影響（±s，g）

表1 油莎豆對(duì)孕鼠體質(zhì)量及其增量的影響（±s，g）

組別對(duì)照組油莎豆2 g/kg 4 g/kg 8 g/kg孕鼠數(shù)/只18 19 16 17第0天270.6±18.1 267.0±20.7 266.4±30.0 270.6±39.2第6天313.3±26.8 311.2±24.5 314.1±30.7 314.2±36.3第9天328.6±28.6 326.3±23.3 326.7±31.2 326.8±36.9第12天352.8±26.8 348.1±24.7 344.9±31.9 348.8±35.1第15天376.7±32.5 369.3±28.1 370.9±32.3 368.6±37.8第20天431.6±43.5 427.9±34.0 431.1±47.7 428.4±41.7體質(zhì)量增量118.2±24.5 116.8±19.9 116.9±25.1 114.2±16.6體質(zhì)量?jī)粼鲋?4.5±12.1 41.6±16.2 40.6±16.0 35.7±8.3

經(jīng)口給予孕鼠不同劑量的油莎豆，第6 天、第9天、第12 天、第15 天、第20 天孕鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量及體質(zhì)量?jī)粼隽窟M(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均滿足方差齊的要求，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果可見，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠第6 天、第9 天、第12 天、第15 天、第20 天的體質(zhì)量、體質(zhì)量增量及體質(zhì)量?jī)粼隽颗c溶劑對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 油莎豆對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的影響

大鼠胚胎發(fā)育指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果見表2。油莎豆2 g/kg 組，吸收胎率、活胎率與溶劑對(duì)照組比較差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但數(shù)值均在正常值范圍內(nèi)，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，不認(rèn)為具有不良生物學(xué)意義。其他各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 油莎豆對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的影響

2.3 油莎豆對(duì)胎鼠外觀畸形的影響

對(duì)照組及油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠數(shù)量分別為230、250、218和231只。分別對(duì)胎鼠外觀畸形所包含的腦膨出、露腦、腦裂、小頭小腦小眼、兔唇、下頜裂、腹裂、腹疝、臍疝、脊柱彎曲、脊柱裂、小肢、短肢、并趾、多趾、無趾、無尾、短尾、無肛門、骶尾裂的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示對(duì)照組及油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠均無外觀畸形。各劑量組各項(xiàng)外觀畸形指標(biāo)和外觀畸胎率與溶劑對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 油莎豆對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育和骨骼畸胎率的影響

統(tǒng)計(jì)各濃度組胎鼠枕骨發(fā)育不全、頭骨缺損、頸椎畸形、腰椎畸形、胸椎畸形、底椎畸形、尾椎畸形、骨盆畸形、四肢骨畸形、腕骨畸形、掌骨畸形、趾骨畸形、肋骨畸形（14 肋）的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果均為0。而在骨化遲緩所涉及的胸骨、胸椎體及腰椎體的表型結(jié)果則表現(xiàn)為與油莎豆投喂與否無關(guān)聯(lián)，其中，油莎豆2 g/kg 組胎鼠胸骨骨化遲緩與對(duì)照組比較差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但數(shù)值在正常值范圍內(nèi)，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系（表3），不認(rèn)為具有不良生物學(xué)意義。其他各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 油莎豆對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

同時(shí)，油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠單項(xiàng)骨骼畸胎率和總骨骼畸胎率與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 油莎豆對(duì)胎鼠內(nèi)臟發(fā)育的影響

通過對(duì)胎鼠的腦、眼球、脊髓、心、主動(dòng)脈弓、食道、氣管、肺、膈肌、肝、腎、膀胱、生殖器、鼻道的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)油莎豆2、4、8 g/kg 組及對(duì)照組均未見明顯內(nèi)臟畸形。

因此，油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠內(nèi)臟發(fā)育畸形與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 油莎豆對(duì)孕鼠總畸胎率的影響

綜合以上檢測(cè)結(jié)果，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠總畸胎率與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

油莎豆作為原產(chǎn)于北非-地中海沿岸的引進(jìn)型經(jīng)濟(jì)作物，既可生吃也可榨油，在非洲有數(shù)千年的食用歷史[10]，在我國(guó)的食用歷史也已超過30年，但因無正式相關(guān)評(píng)估試驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)報(bào)道，按照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)的建議，開展食用致畸性試驗(yàn)評(píng)估。致畸試驗(yàn)是食用安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要內(nèi)容之一，本實(shí)驗(yàn)采用的評(píng)估方法符合致畸試驗(yàn)程序，但具體的考察指標(biāo)相比其他受試物更加詳盡[11-12]，可以較客觀的反映油莎豆的真實(shí)致畸風(fēng)險(xiǎn)。

油莎豆在非洲國(guó)家有較長(zhǎng)的食用歷史，長(zhǎng)期食用油莎豆有助于預(yù)防心臟病和血栓形成，改善血液循環(huán)，降低患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]，同時(shí)其含有多種活性成分[15]，是一種天然抗氧化劑[16-18]。但對(duì)于包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)，油莎豆并非傳統(tǒng)食物，在規(guī)?；袌?chǎng)推廣前，亟須開展包括致畸試驗(yàn)在內(nèi)的遺傳毒理試驗(yàn)。

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)于SPF級(jí)SD大鼠于受孕的第6～15 天經(jīng)口給予油莎豆2、4、8 g/kg 的濃度處理，孕鼠在體質(zhì)量、胚胎發(fā)育、胎鼠外觀、胎鼠骨骼發(fā)育和骨骼畸胎率等幾個(gè)致畸指標(biāo)方面無明顯差異，絕大部分檢測(cè)結(jié)果均為0 或差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。胎鼠內(nèi)臟發(fā)育和畸胎率在2、4、8 g/kg 組及對(duì)照組均未見有內(nèi)臟畸形。

綜上，在本實(shí)驗(yàn)條件下，油莎豆對(duì)SD 大鼠無致畸風(fēng)險(xiǎn)，其母體毒性和胚胎發(fā)育毒性的NOAEL 均為8 g/（kg·d）。本實(shí)驗(yàn)為油莎豆食用安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要參考，推進(jìn)了油莎豆毒理學(xué)研究發(fā)展。