TNF-α和FOXA2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義

黃夢盼，王學(xué)紅，蘆永福，

（1．青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016；2．青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810012）

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是一種涉及遺傳、環(huán)境和不良生活方式相互作用的多因素疾病。結(jié)直腸癌早期接受治療的患者其5 年生存率可高達90%，晚期患者5 年生存率僅為12%，且預(yù)后仍然較差[1]。因此，篩查早期結(jié)直腸癌是降低其發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵策略之一。結(jié)直腸腺瘤-癌序列一直被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的主要發(fā)生途徑，腺瘤從上皮增生發(fā)展而來，最初包含低級別異型增生，然后發(fā)展為高級別異型增生，隨后發(fā)展為浸潤性癌，這一過程可能需要10～15年[2]，從腺瘤到癌的長時間發(fā)展為CRC篩查提供了依據(jù)。慢性炎癥通常是腫瘤發(fā)展所必需的[3]，炎癥環(huán)境促進細(xì)胞增殖，削弱血管屏障，促進免疫細(xì)胞侵襲和遷移。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是一種同源三聚體蛋白，由活化的巨噬細(xì)胞及其他多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的TNF-α蛋白均可通過自分泌方式調(diào)節(jié)，從而加速腫瘤的進展。Obeed 等[4]發(fā)現(xiàn)TNF-α mRNA 在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的相對表達水平顯著高于鄰近正常組織，此外，與早期CRC 患者相比，晚期CRC 患者組織中TNF-α mRNA 的表達顯著升高。叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2）是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，包含兩個轉(zhuǎn)錄激活域和一個叉頭域，以DNA結(jié)合“翼狀螺旋結(jié)構(gòu)域”為特征。目前，關(guān)于TNF-α、FOXA2蛋白二者聯(lián)合在結(jié)直腸癌變過程中表達及作用的研究較少。本研究將聯(lián)合檢測TNF-α、FOXA2蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達，分析這兩個蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及癌變中各自揮發(fā)的作用及相互關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、臨床診斷和治療提供新思路及初步理論支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2021年12月—2022年6月由青海大學(xué)附屬醫(yī)院首次確診為結(jié)直腸癌，并在該院行手術(shù)治療且病例資料完整的患者39 例，其中男性23 例，女性16 例，取CRC 組織及配對癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上，經(jīng)病理證實為非腫瘤的組織）。病理類型均為結(jié)直腸腺癌，男性23 例，女性16 例，低分化腺癌16例，中-高分化腺癌23例；浸潤深度未侵及漿膜層13例，漿膜層及以外26 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例；臨床分期I～II 期17 例，III～IV 期22例；臨床分期標(biāo)準(zhǔn)參照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會制定的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)（第8 版）。選取同期結(jié)直腸腺瘤患者42 例，其中男性23 例，女性19 例；每位患者均采用腸鏡切除結(jié)直腸腺瘤組織，經(jīng)病理證實后用活檢鉗取2 塊組織用于本研究。其中腺瘤直徑＜1 cm 的28例，腺瘤直徑≥1 cm 的14 例；管狀腺瘤23 例，絨毛狀腺瘤19例；無蒂腺瘤25例，有蒂腺瘤17例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究的病例納入標(biāo)準(zhǔn)為：①所有研究對象均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸腺瘤或結(jié)直腸癌患者；②檢測前均為原發(fā)性腫瘤，均未接受化療、放療及免疫等治療；③患者愿意進入該項研究，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)為：①既往有其他系統(tǒng)腫瘤手術(shù)史者；②合并家族遺傳性息肉病、炎癥性腸病、血液系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病病史者；③嚴(yán)重感染，重要器官功能障礙，1 個月內(nèi)服用激素類、免疫抑制劑、非甾體抗炎藥者；④有結(jié)腸鏡檢查禁忌證者。

本研究已通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，審批編號SL-2019058。

1.3 試劑和儀器

一抗TNF-α 多克隆抗體購自Abbkine 公司，F(xiàn)OXA2抗體購自博士德公司，二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Servicebio公司。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，按1∶200 稀釋配制TNF-α、FOXA2抗體。按說明書操作，所取組織標(biāo)本均放入固定液中固定，經(jīng)石蠟包埋后切片，脫蠟后經(jīng)過梯度乙醇進行水化。將切片浸于修復(fù)液中加熱進行抗原修復(fù)，等待液體溫度冷卻至室溫后，放于PBS 緩沖液中浸泡，隨后取出，用干凈紗布擦拭去除多余液體，在切片組織上加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑。水洗后分別滴入一抗（TNF-α、FOXA2 抗體）孵育過夜，再滴加二抗，經(jīng)DAB 顯色，分化液分化后返藍(lán)，脫水透明，待切片晾干后封片，顯微鏡下讀片判讀。

1.5 免疫組化染色結(jié)果判讀

TNF-α、FOXA2蛋白免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，主要位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)果由2 名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲判讀，采用半定量綜合計分方法：高倍鏡下隨機選取4 個視野，根據(jù)染色陽性強度及陽性面積劃分等級。陽性強度：基本無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性面積：≤10%為0 分，＞10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%為3 分。染色總分為強度評分與陽性面積評分之積，≤3分視為陰性，≥4分視為陽性。

1.6 統(tǒng)計分析

本實驗選擇SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。計數(shù)資料統(tǒng)計描述采用率來表示，分析TNF-α和FOXA2蛋白表達與結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系采用卡方檢驗或校正卡方檢驗；TNF-α和FOXA2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達水平相關(guān)性研究采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TNF-α蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達

TNF-α蛋白在結(jié)直腸3 種不同組織中的免疫組化染色觀察結(jié)果見圖1，陽性表達率統(tǒng)計分析見表1。TNF-α蛋白在癌旁正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤及CRC 組織中的陽性表達率分別為23.08%、50.00%和76.92%，癌旁正常結(jié)直腸黏膜組織中TNF-α蛋白表達最低，結(jié)直腸腺瘤和CRC組織與之相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或0.01），且結(jié)直腸癌組織中TNF-α蛋白陽性表達率顯著高于結(jié)直腸腺瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 TNF-α蛋白在3種不同結(jié)直腸組織中陽性表達率的比較

圖1 TNF-α蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達

2.2 TNF-α蛋白表達與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.2.1 TNF-α蛋白表達與結(jié)直腸腺瘤組臨床病理指標(biāo)的關(guān)系免疫組化分析結(jié)果見表2，不同腺瘤直徑大小及組織學(xué)類型患者TNF-α蛋白表達陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腺瘤數(shù)目、腺瘤形狀患者TNF-α蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 TNF-α蛋白表達與結(jié)直腸腺瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.2.2 TNF-α蛋白表達與結(jié)直腸癌組臨床病理指標(biāo)的關(guān)系免疫組化分析結(jié)果見表3，TNF-α蛋白表達在不同分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期的結(jié)直腸癌組織間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNF-α表達在不同年齡、性別、腫瘤直徑、部位及有無脈管神經(jīng)侵犯的結(jié)直腸癌組織間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 TNF-α蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 FOXA2蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達

FOXA2 蛋白在結(jié)直腸3 種不同組織中的免疫組化染色觀察結(jié)果見圖2，陽性表達率統(tǒng)計分析見表4。FOXA2 蛋白在癌旁正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤及CRC 組織中的陽性表達率分別為23.08%、52.38%和79.49%；癌旁正常結(jié)直腸黏膜組織中FOXA2蛋白表達最低，結(jié)直腸腺瘤和CRC組織與之相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且結(jié)直腸癌組織中FOXA2 蛋白陽性表達率顯著高于結(jié)直腸腺瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 FOXA2蛋白在3種不同結(jié)直腸組織中的陽性表達率比較

圖2 FOXA2蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達

2.4 FOXA2蛋白表達與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4.1 FOXA2 蛋白表達與結(jié)直腸腺瘤組臨床病理指標(biāo)的關(guān)系免疫組化分析結(jié)果見表5，不同腺瘤直徑大小及形狀類型患者FOXA2 蛋白表達陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腺瘤數(shù)目、組織學(xué)類型患者FOXA2蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4.2 FOXA2 蛋白表達與結(jié)直腸癌組臨床病理指標(biāo)的關(guān)系免疫組化分析結(jié)果見表6，F(xiàn)OXA2 蛋白表達不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的結(jié)直腸癌組織間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；FOXA2 蛋白表達在不同年齡、性別、腫瘤直徑、部位、浸潤深度及有無脈管神經(jīng)侵犯的結(jié)直腸癌組織間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 FOXA2蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.5 結(jié)直腸癌組織中TNF-α和FOXA2表達相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析表明，TNF-α和FOXA2在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)（rs=0.475，P＜0.05），見表7。

表7 結(jié)直腸癌組織中TNF-α與FOXA2蛋白表達水平的相關(guān)性

3 討 論

近年來，隨著生活方式的改變、人口老齡化的加速和飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，中國CRC約占全球所有新增病例的30%[5]。雖然結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢，但我們觀察到結(jié)直腸癌死亡率略有下降[6]。這種減少可能至少涉及兩個方面：首先，CRC篩查項目在早期階段發(fā)現(xiàn)癌癥已經(jīng)在人群中證明了其有效性；二是結(jié)直腸癌患者的臨床治療和管理水平大幅提高。因此，通過預(yù)防性切除結(jié)直腸癌的癌前病變可使結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率顯著降低。

TNF-α由19 種蛋白質(zhì)組成，具有多種生物學(xué)功能，為細(xì)胞激活、分化、增殖、凋亡提供信號，還能調(diào)節(jié)多個組織和器官的免疫和炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明，TNF-α蛋白在結(jié)直腸腺瘤組及結(jié)直腸癌組的陽性率均顯著高于癌旁正常結(jié)直腸黏膜組，且CRC組的陽性率高于結(jié)直腸腺瘤組。于秀冰等[7]檢測120例CRC及癌旁組織中的TNF-α蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC組織中TNF-α陽性表達率為71.67%，癌旁組織中TNF-α蛋白陽性表達率僅為26.67%，兩者具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果與其基本一致，隨著病情的進展，TNF-α蛋白水平呈現(xiàn)進行性升高的趨勢，提示其表達高低與結(jié)直腸癌變過程相互關(guān)聯(lián)。本實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α蛋白陽性表達率與結(jié)直腸腺瘤病理組織分型相關(guān)，絨毛狀腺瘤TNF-α蛋白陽性率顯著高于管狀腺瘤。研究表明[8]，絨毛結(jié)構(gòu)成分占比越高，腺瘤惡性轉(zhuǎn)化率越高，絨毛狀腺瘤的癌變率較管狀腺瘤明顯升高[9]。TNF-α蛋白在直徑＜1 cm 腺瘤中的陽性表達率顯著低于直徑≥1 cm的腺瘤，Lieberman等[10]發(fā)現(xiàn)，腺瘤的大小與發(fā)生浸潤性癌的風(fēng)險程度成正比，隨著腺瘤大小的增加，≥1 cm 的腺瘤癌變率高達30.6%，而小腺瘤（6～9 mm）患者處于中等風(fēng)險，癌變率為6.6%，提示隨著腺瘤癌變風(fēng)險增加，TNF-α蛋白在結(jié)直腸腺瘤中的表達增高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α蛋白表達陽性率較高，腫瘤的分化程度越差，浸潤深度越深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，TNM分期越晚，這對判斷CRC預(yù)后具有重要意義。本研究與龍華婧等[11]研究結(jié)果基本一致，其研究還表明TNF-α蛋白在CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的表達較未轉(zhuǎn)移患者明顯升高，TNF-α蛋白表達情況對判斷是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有重要意義。Stanilov等[12]發(fā)現(xiàn)TNF-α蛋白在CRC 患者血清中表達明顯升高，并且TNF-α蛋白表達水平與腫瘤臨床分期、分化程度呈正相關(guān)，生存分析提示血清TNF-α水平高的CRC患者的生存率明顯低于TNF-α蛋白水平低的患者。TNF-α蛋白表達水平升高可能是一個獨立的預(yù)后指標(biāo)，可用于隨訪結(jié)直腸癌患者。

FOXA2蛋白促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展主要與TNF-α作用有關(guān)。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IKK-α是TNF-α下游的重要激酶，在S107/S111 位點與FOXA2 相互作用并發(fā)生磷酸化，使其NUMB 蛋白表達下調(diào)，一系列過程使Notch 通路激活。Notch 信號通路在正常腸上皮的自我更新和穩(wěn)態(tài)以及結(jié)直腸癌進展中至關(guān)重要，通路中的轉(zhuǎn)錄因子的過表達與CRC進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，通過TNF-α/IKK-α/FOXA2/NUMB/NOTCH1 通 路， 將TNF-α和FOXA2聯(lián)系起來，為揭示腫瘤生長的分子基礎(chǔ)和確定癌癥治療的潛在靶點提供了一個新起點。

叉頭盒蛋白A2（FOXA2），是一種先鋒轉(zhuǎn)錄因子，是維持各種細(xì)胞和組織正常功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。多項研究通過激活不同通路證實FOXA2 蛋白與胃癌[14]、肺癌[15]、卵巢癌[16]、胰腺癌[17]等癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。彭好[18]研究發(fā)現(xiàn)FOXA2 蛋白在正常結(jié)直腸黏膜組、增生性息肉組、腺瘤性息肉組、CRC組的陽性表達 率 為13.3%（6/45）、31.1%（14/45）、62.2%（84/135）、86.7%（39/45），且兩兩之間表達水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此可以推斷FOXA2蛋白對結(jié)直腸癌及癌前病變有一定的診斷價值。本研究結(jié)果與其基本一致，發(fā)現(xiàn)FOXA2蛋白在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌中高表達，而在癌旁正常結(jié)直腸黏膜組織中呈低表達，提示FOXA2蛋白在結(jié)直腸正常黏膜→結(jié)直腸腺瘤→結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起了促進作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2蛋白表達在腺瘤的大小和形狀方面有統(tǒng)計學(xué)差異。與內(nèi)鏡下表現(xiàn)為扁平狀或廣基無蒂的病變相比，帶蒂腺瘤發(fā)生率更高，但癌變的風(fēng)險較低[19]，提示隨著腺瘤癌變風(fēng)險增加，F(xiàn)OXA2蛋白在結(jié)直腸腺瘤中的表達增高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2 蛋白陽性表達率越高，腫瘤的分化程度越差，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，TNM分期越晚。本實驗與既往多項研究報道相一致。Wang等[20]通過實時熒光定量PCR法檢測FOXA2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)FOXA2 蛋白在CRC 組織中的表達明顯高于正常結(jié)直腸組織，且高表達的FOXA2蛋白與CRC的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān)。FOXA2蛋白在CRC癌變過程中發(fā)揮著重要作用，但其機制還不十分清楚，可能與FOXA2蛋白表達促進結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）有關(guān)。EMT 是指細(xì)胞失去極性并破壞細(xì)胞間連接[21]，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢苿拥拈g充質(zhì)細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間黏附能力降低，遷移能力增強，可促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的減少和波形蛋白（vimentin）的增加可以被認(rèn)為是EMT 發(fā)生的標(biāo)志[22]。作為一種癌基因，F(xiàn)OXA2蛋白可能增強結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。Wang 等[20]通過體外和體內(nèi)實驗表明，下調(diào)FOXA2 蛋白的表達，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29細(xì)胞G1期向S期的轉(zhuǎn)變，降低體外結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。同時，腫瘤組織中E-cadherin 表達上調(diào)，vimentin 表達下調(diào)，提示EMT 被抑制。EMT 可能是FOXA2蛋白促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。

本研究分析TNF-α和FOXA2 蛋白兩者在CRC 組織之間表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示：在結(jié)直腸癌組織中TNF-α與FOXA2蛋白的表達呈正相關(guān)，說明二者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用是相互協(xié)同的。當(dāng)結(jié)直腸腺瘤患者組織中TNF-α、FOXA2蛋白表達為強陽性時，癌變的可能性大，應(yīng)引起足夠的重視，需要定期復(fù)查、密切監(jiān)控。目前對于TNF-α和FOXA2蛋白參與腺瘤發(fā)生及癌變的機制還尚不明確，本研究選取樣本量相對較少、入組患者的來源地域較單一局限，仍然需要多中心、多地區(qū)、多人群的研究及更多的實驗進一步深入探索結(jié)直腸癌變過程的發(fā)生機制。