核糖核苷酸還原酶M2在小腦髓母細(xì)胞瘤中的功能及機(jī)制

張 琪，吳 菁，張晨璐，

（1．復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200032；2．復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 201508）

髓母細(xì)胞瘤是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒童顱內(nèi)胚胎源性腫瘤的63%[1]。外科、放療和化療的綜合運(yùn)用已經(jīng)使得髓母細(xì)胞瘤患者的生存率有了很大的提高，然而仍有25%～30%的患者死于該病。治療會(huì)給患者帶來不同程度的長期后遺癥，約70%接受治療的患者存在聽力喪失、認(rèn)知障礙等[2]。核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）是DNA合成和DNA修復(fù)的關(guān)鍵酶，存在于所有真核生物和一些原核生物中，由M1亞基（RRM1）和M2亞基（RRM2）組成[3]。準(zhǔn)確的DNA 復(fù)制和修復(fù)對于所有多細(xì)胞生物的正常發(fā)育、生長和無瘤生存至關(guān)重要。RRM2 作為核糖核苷酸還原酶的限速酶，其過度表達(dá)與多種癌癥的預(yù)后不良相關(guān)[4-5]。在RRM2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，RRM2的過度表達(dá)可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生，可與DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷協(xié)同促進(jìn)肺腫物向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變[6]。然而RRM2在小腦髓母細(xì)胞瘤中的作用及機(jī)制研究尚不清楚。本研究旨在探討RRM2 在小腦髓母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，為髓母細(xì)胞瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RRM2 抗體、GAPDH 抗 體購自Santa Cruz 公司。CCK-8試劑盒購自同仁公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。細(xì)胞周期試劑盒和凋亡試劑盒購自北京索萊寶公司。DMEM、MEM、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司。RRM2過表達(dá)及敲低慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因。

1.2 小腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和腫瘤組織臨床樣本芯片

細(xì)胞系Daoy 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，D283細(xì)胞系購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫，以上2 種細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究所使用的小腦髓母細(xì)胞瘤和癌旁組織臨床樣本芯片購自陜西愛維拉生物科技有限公司，貨號(hào)為DC-Bra01022。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 通過GEO 數(shù)據(jù)庫分析髓母細(xì)胞瘤患者RRM2表達(dá)水平和生存的關(guān)系對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE85217）中612 例髓母細(xì)胞瘤患者的生存和基因表達(dá)信息進(jìn)行分析，繼續(xù)通過對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE86574、GSE74195、GSE35493）中髓母細(xì)胞瘤和正常小腦組織RRM2 的表達(dá)水平進(jìn)行分析，然后對RRM2 在髓母細(xì)胞瘤不同分子分型中表達(dá)水平進(jìn)行比較。進(jìn)一步通過免疫組化染色在組織樣本芯片上驗(yàn)證。

1.3.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)將組織芯片脫蠟、水化等處理后，使用PBS洗滌3次，每次5 min。置入檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，高溫加熱7 min，緩沖液中浸泡5 min，再次使用PBS 洗滌。加入RRM2 一抗（sc-398294，小鼠）抗體按1∶500稀釋，4 ℃過夜。PBS清洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次后，進(jìn)行DAB 顯色及蘇木素復(fù)染。乙醇、二甲苯脫水后，使用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染Daoy 細(xì)胞（含1%青、鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）及D283細(xì)胞（含1%青、鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基）分別于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行傳代。將處于對數(shù)生長期的Daoy或D283細(xì)胞接種至6孔板，分為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，即對照組（空載體慢病毒）和RRM2 過表達(dá)組；敲低實(shí)驗(yàn)，即shRNA 對照組（含無義鏈的慢病毒）和RRM2 敲低組。培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)，分別加入慢病毒，6 h 后更換培養(yǎng)基。48 h后細(xì)胞表達(dá)熒光，利用嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，建立穩(wěn)定感染細(xì)胞株Daoy 和D283 并進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。慢病毒過表達(dá)載體為pGC-FU-3FLAGCBh-gcGFP-IRES-puromycin，敲低載體為pFU-GW-016。敲低RRM2 的慢病毒靶向序列為cgGAGGAGAG AGTAAGAGAAA。

1.3.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，PBS 清洗后離心，加入蛋白裂解液，收集蛋白上清。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳后，轉(zhuǎn)膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗（RRM2 抗體、GAPDH 抗體），4 ℃孵育過夜。PBST 洗膜，再以1∶2 000 稀釋的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG），室溫孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光劑后利用成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用胰蛋白酶消化后重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在96 孔板中每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。分別在4 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)即0、24、48和72 h，加入CCK-8試劑，孵育0.5～2 h后使用酶標(biāo)儀檢測D（450）值。

1.3.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基稀釋為5×105/mL，將200 μL 細(xì)胞懸液加入24 孔板上層小室，含有10% FBS 培養(yǎng)基的500 μL 細(xì)胞懸液加入到下層小室，繼續(xù)孵育48 h。吸去培養(yǎng)基，用4%甲醛固定15 min，用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.3.7 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，使用PBS 漂洗2 次。用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并加入PI，避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并加入Annexin V-FITC 和PI，避光孵育15 min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）為了探索RRM2 在髓母細(xì)胞瘤中發(fā)揮功能的相關(guān)分子機(jī)制，我們對敲低RRM2 的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）檢測分析。RRM2 敲低組和對照組細(xì)胞系Daoy，由諾禾致源醫(yī)學(xué)公司進(jìn)行RNA提取和檢測，建庫后進(jìn)行Illumina 測序，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，使用HISAT2 v2.0.5 將預(yù)處理序列與參照基因組比對。后續(xù)使用DESeq 1.20.0軟件進(jìn)行兩組之間的差異表達(dá)分析；使用Cluster Profiler 3.4.4 軟件分析KEGG 通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。數(shù)據(jù)以±s表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組比較采用配對或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 RRM2在髓母細(xì)胞瘤中高表達(dá)

對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE85217）中612 例髓母細(xì)胞瘤患者的生存和基因表達(dá)信息進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RRM2 的髓母細(xì)胞瘤患者相較于低表達(dá)組的總生存期更短、預(yù)后更差（圖1A）。繼續(xù)通過對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE86574、GSE74195、GSE35493）中髓母細(xì)胞瘤和正常小腦組織RRM2 的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RRM2在髓母細(xì)胞瘤中較正常小腦組織高表達(dá)（P＜0.01，圖1B）。根據(jù)基因改變，髓母細(xì)胞瘤可以分為4個(gè)分子亞型，分別是WNT 型、SHH 型、第3 組（Group3）、第4組（Group4）[7]。其中WNT型預(yù)后最好，5年生存率超過95%；而第3組預(yù)后最差，5年生存率小于60%。GEO數(shù)據(jù)庫（GSE85217）分析結(jié)果顯示RRM2 在4 種不同分子亞型中表達(dá)水平不同，RRM2 在第3 組中表達(dá)量最高，在SHH型表達(dá)量最低（圖1C）。進(jìn)一步通過免疫組化染色，證實(shí)RRM2 在髓母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織（圖1D）。

圖1 RRM2在小腦髓母細(xì)胞瘤中高表達(dá)

2.2 RRM2增強(qiáng)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力

利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)RRM2 和敲低RRM2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Daoy 和D283。Western blot 檢測了不同細(xì)胞系中RRM2 蛋白的表達(dá)水平（圖2A）。體外CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)RRM2 的Daoy 和D283細(xì)胞增殖能力均明顯高于對照組，而敲低RRM2基因的Daoy和D283細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組（均為P＜0.01，圖2B）。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Daoy 中過表達(dá)RRM2 能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，敲低RRM2減弱細(xì)胞的遷移能力（圖2C和D）。

圖2 RRM2促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖和遷移

2.3 RRM2影響髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的周期和凋亡

結(jié)果顯示，在Daoy 和D283 細(xì)胞中過表達(dá)RRM2可增加S 期細(xì)胞比例、減少G0/G1 期細(xì)胞比例；敲低RRM2 則減少S 期細(xì)胞比例、增加G0/G1 期細(xì)胞比例（均為P＜0.01，圖3A 和B）。細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)顯示，在Daoy 和D283 細(xì)胞中，過表達(dá)RRM2 減少早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡（Annexin V+PI+）的細(xì)胞比例。而敲低RRM2 能夠顯著增加早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例（均為P＜0.01，圖3C 和D）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 RRM2對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）

表1 RRM2對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）

分組對照組RRM2過表達(dá)組shRNA對照組RRM2敲低組Daoy細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例6.44±0.96 0.66±0.20 5.74±1.01 22.62±0.98晚期凋亡細(xì)胞比例3.14±0.29 0.34±0.11 2.47±0.48 7.19±1.10 D283細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例6.92±2.25 0.73±0.18 6.73±1.48 13.40±0.50晚期凋亡細(xì)胞比例3.20±0.49 0.47±0.31 3.90±1.13 11.48±1.00

圖3 RRM2增加S期細(xì)胞比例并減少細(xì)胞凋亡

2.4 RNA-seq分析結(jié)果

火山圖結(jié)果顯示敲低RRM2 后表達(dá)水平發(fā)生變化的基因，其中有3 454個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3 332個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4A）。KEGG 分析顯示RRM2 敲低后受到影響的信號(hào)通路，包括FOXO、細(xì)胞周期、核糖體生物合成等信號(hào)通路（圖4B）。后續(xù)將通過更多分子實(shí)驗(yàn)明確RRM2發(fā)揮促癌作用的下游信號(hào)通路。

圖4 Daoy細(xì)胞敲低RRM2的RNA-seq分析結(jié)果

3 討 論

髓母細(xì)胞瘤是一種主要發(fā)生在兒童的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究的推進(jìn)，促進(jìn)了人們對髓母細(xì)胞瘤生物學(xué)特點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制的理解[8]。通過基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等不同維度的研究，繪制成髓母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥的分子圖譜，也為改進(jìn)診斷和治療措施提供了新希望。盡管該腫瘤的治療情況較十余年前已有較高的提升，但仍有接近20%～30%的患者在接受綜合治療后死亡，因此也亟需新的治療策略。

RRM2是核糖核苷酸還原酶的M2亞單位，是DNA合成和修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶[9-10]。RRM2被認(rèn)為行使著癌基因的作用，在多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)升高[11-12]。在本研究中通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)RRM2 在小腦髓母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，并和小腦髓母細(xì)胞瘤的預(yù)后不良有關(guān)。進(jìn)一步通過臨床組織標(biāo)本，在蛋白水平驗(yàn)證RRM2 在小腦髓母細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于正常小腦組織。

RRM2 的致癌能力在多種類型的惡性腫瘤中已有報(bào)道。既往的研究結(jié)果顯示，在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，RRM2 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并減少細(xì)胞凋亡[13]；在鼻咽癌中，RRM2 過表達(dá)增強(qiáng)了集落形成以及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，明確了RRM2 的促癌作用，證實(shí)RRM2 能夠促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖和遷移，增加S 期細(xì)胞的比例，并能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，表明RRM2 在髓母細(xì)胞瘤的發(fā)展中起著重要作用。

以往的研究結(jié)果表明，RRM2 能夠調(diào)控AKT、WNT 等信號(hào)通路[15]。例如在腎癌中RRM2 能夠通過上調(diào)ANXA1 的表達(dá)激活A(yù)KT 通路，從而促進(jìn)腫瘤生長和舒尼替尼耐藥[16]。目前對RRM2 在小腦髓母細(xì)胞瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用的分子機(jī)制仍然缺乏綜合性了解。在本研究中，通過RNA-seq 測序和KEGG 分析提示差異基因主要富集的生物學(xué)過程，其中包括FOXO 信號(hào)通路、細(xì)胞周期等。FOXO3屬于FOXO 家族的一個(gè)亞型，是抑癌基因，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、凋亡、DNA 損傷等過程中發(fā)揮重要作用[17]。在前列腺癌中AKT能夠通過磷酸化FOXO3，使其失去轉(zhuǎn)錄活性，并從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移[18]。因此我們推測，RRM2可能通過AKT/FOXO3通路調(diào)控髓母細(xì)胞瘤的發(fā)展，但需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本研究通過數(shù)據(jù)庫、臨床樣本和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RRM2 在小腦髓母細(xì)胞瘤中發(fā)揮促癌基因的作用。通過對其上下游分子機(jī)制深入研究，RRM2有可能作為評估髓母細(xì)胞瘤惡性程度、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的潛在分子。