結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p的表達及其臨床意義

楊程晴，崔永輝，鄭紫恒

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 商丘 476100）

結(jié)腸癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，具有較高發(fā)病率和死亡率[1]，對人類的健康構(gòu)成重大威脅，全球每年新發(fā)的結(jié)腸癌病例超過100萬，大約有70萬人因該病死亡[2]。在中國，結(jié)腸癌患者總體5年生存率低于40%[3]。結(jié)腸癌早期具有隱匿性，通常被發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，而且容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，雖然結(jié)腸鏡檢查的廣泛使用改善了早期部分患者預(yù)后，但并不能顯著降低結(jié)腸癌的總體死亡率[4]。主要原因是對結(jié)腸癌的發(fā)病機制還未被完全了解。結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展離不開致癌基因失活和原癌基因激活，是一個多因素、多線條和多基因的過程[5]。微核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，長度約為21～25 nt，通過填充目標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTRs）來抑制或降解目標(biāo)基因[6]。許多miRNAs已被證實在癌癥組織或細胞中表達異常。這些失調(diào)的miRNA 在消化道惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥性中起著重要作用[7-8]。其中miR-653-5p被發(fā)現(xiàn)在一些惡性腫瘤包括乳腺癌[9]、胃癌[10]和鼻咽癌[11]中具有重要作用，但miR-653-5p在結(jié)腸癌中的表達和作用尚不清楚。因此，本研究檢測了結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p 的表達水平，分析其與結(jié)腸癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，評估其表達水平在結(jié)腸癌患者生存預(yù)后中的臨床價值，擬為結(jié)腸癌的診療提供新的生物參考靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象一般資料

選取2019 年1 月—2020 年1 月商丘市第一人民醫(yī)院門診和住院共76名結(jié)腸癌患者作為實驗組，年齡范圍為20～80歲，平均（58.43±11.59）歲，其中男性和女性患者各38 例。另選擇同時期到該院的正常體檢者76名作為對照組，對照組人群年齡和性別與實驗組相匹配。此研究通過商丘市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核（批準文號20200017），所有參與者均知情同意，并簽署同意書。

實驗組患者納入標(biāo)準：①符合《結(jié)腸癌標(biāo)準治療指南（試行）》的標(biāo)準，并有結(jié)腸癌的病理診斷；②未接受過任何放、化療或靶向治療；③均擬行手術(shù)治療；④有較為完整的臨床資料和隨訪信息。排除標(biāo)準：①同時合并其他惡性腫瘤疾?。虎诟文I功能受損，患有嚴重的精神疾病和慢性病；③缺乏臨床病理數(shù)據(jù)或治療中斷。

1.2 主要試劑

DP501 型血清miRNA 提取分離試劑盒、AG11743 miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、B532461型miRNA 熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測試劑盒，均購自于美國Thermo Fisher 科技公司。miRNA-653-5p 特異性引物由美國Beckman 有限公司合成，miR-653-5p 上游引物為5'-GTGTT GAAACAATCTCTACTG-3'，下游為5'-GAACATGTC TGCGTATCTC-3'；U6 上游引物為5'-CTCGCTTCGG CAGCACA-3'，下游為5'-ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC-3'。QuantStudio5 型qPCR 儀購自美國Roche公司。

1.3 樣本的采集及血清中miRNA提取

采集研究對象5 mL 外周靜脈血于含有EDTA無RNA 酶的采血管中，混合后在4 ℃條件下以3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液并在-80 ℃條件下保存。采用miRNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書步驟從血清中提取總miRNA，置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 qPCR擴增

把反轉(zhuǎn)錄酶2 μL、10×酶混合物5 μL、5×緩沖液4 μL、cDNA 模板2 μL、混合引物2 μL 和miRNA 6 μL，用無酶水（RNase-Free ddH2O）配制成反轉(zhuǎn)錄體系25 μL，于37 ℃作用60 min，95 ℃反應(yīng)5 min，將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，置于-20 ℃保存。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃初始變性10 min，隨后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸50 s。采用SYBR染料法測定miR-653-5p的CT值，以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計算各組樣本血清中miR-653-5p 的相對表達水平，實驗重復(fù)3次，并取平均值進行統(tǒng)計。

1.5 隨 訪

通過電話或定期門診的形式，從術(shù)后第1 天對結(jié)腸癌患者進行長達36個月的隨訪，記錄疾病的持續(xù)情況及患者的生存時間，并計算實驗組結(jié)腸癌患者的生存率，76 例結(jié)腸癌患者中26 例隨訪期內(nèi)幸存，50 例死亡。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 27.0 軟件進行統(tǒng)計分析和Rstudio 軟件制圖。定量資料以±s表示；定性資料采用百分率表示。分別采用t檢驗分析miR-653-5p 表達水平的差異，χ2檢驗分析miR-653-5p 與病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，Kaplan-Meire 方法繪制患者生存曲線，Log-rank 法比較兩組患者生存率的差異，COX回歸分析影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

2 結(jié) 果

2.1 血清中miR-653-5p的表達水平

血清中miR-653-5p 相對表達水平在對照組健康人群中為0.471±1.076，在實驗組結(jié)腸癌人群中為0.622±1.319，實驗組結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p的表達水平較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖1。

圖1 結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p的相對表達水平

2.2 miR-653-5p表達水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

根據(jù)實驗組患者miR-653-5p 表達水平的平均值（0.471）將結(jié)腸癌患者分為高、低表達組。結(jié)果高、低表達組分別有40 和36 人。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，miR-653-5p 表達水平與腫瘤分化程度、不同臨床T 分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移、有無脈管癌栓存在明顯相關(guān)關(guān)系（均為P＜0.01），而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無明顯相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），見表1。

表1 結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p 的表達水平和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 miR-653-5p對于結(jié)腸癌的診斷價值

受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC）分析結(jié)果顯示，根據(jù)miR-653-5p在結(jié)腸癌患者血清中的相對表達水平預(yù)測結(jié)腸癌曲線下面積（AUC）為0.823（95%CI：0.753～0.880，P＜0.01），最佳閾值為0.498，診斷的敏感性為80.26%，診斷的特異性為82.89%，如圖2。

圖2 血清miR-653-5p對于診斷結(jié)腸癌的ROC曲線

2.4 miR-653與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的相關(guān)性

隨訪36個月，結(jié)腸癌患者3年總體生存率為34%（26/76），在miR-653-5p 高表達組的40 例患者中，15例死亡，25 例幸存，3 年生存率為62.5%；在miR-653-5p 低表達組的36 例患者中，35 例死亡，1 例幸存，3 年生存率為2.8%。采用Kaplan-Meire 生存曲線及Log-rank法進行比較分析，結(jié)果顯示，miR-653-5p低表達組3 年生存率明顯低于高表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=61.531，P＜0.01），見圖3。多因素COX回歸分析顯示，臨床T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、miR-653-5p表達均是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），如表3。

表3 多因素COX回歸分析結(jié)腸癌患者生存預(yù)后

圖3 miR-653-5p高、低表達結(jié)腸癌患者的預(yù)后生存曲線

3 討 論

miRNAs 在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可通過定向調(diào)節(jié)下游靶基因而控制機體許多重要的生命活動，有促癌或抑癌功能[12]。血清miRNAs 比目前臨床上腫瘤標(biāo)志物更具穩(wěn)定性和特異性，可成為非侵入性腫瘤標(biāo)志物，也可作為人群篩查和個體監(jiān)測的指標(biāo)[13]。異常表達的miRNAs 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，預(yù)防或糾正異常的miRNAs 并恢復(fù)其正常功能，可以為結(jié)腸癌的治療提供一種新的選擇[14]。

miR-653-5p 在miRNA 功能的實驗研究中受到越來越多的關(guān)注，在多種癌癥中發(fā)揮重要作用[15]。miR-653-5p 在前列腺癌組織和細胞系中表達明顯上調(diào)，在前列腺癌中發(fā)揮促癌作用，抑制其功能可顯著降低細胞增殖和侵襲性[16]。在甲狀腺癌細胞系中，miR-653-5p抑制其增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡，circNRIP1 通過作用于miR-653-5p/PBX3a 通路抑制甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展[17]。miR-653-5p在非小細胞肺癌的擴增和過表達中也發(fā)揮重要作用[18]。miR-653-5p在胃癌組織、血清和細胞系中表達水平均顯著上調(diào)，在體內(nèi)外均可促進胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]，在胃癌進展中起重要作用。

本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)腸癌患者及健康對照人群血清中miR-653-5p 的表達水平，結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p 相對表達量顯著低于健康人群，并且健康人群相對表達水平比部分結(jié)直腸癌患者高出一倍多，說明miR-653-5p 在結(jié)腸癌患者血清中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，表明miR-653-5p可能在結(jié)腸癌的發(fā)病、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。根據(jù)患者miR-653-5p 表達的平均值將結(jié)腸癌分為低表達組和高表達組，然后進一步分析了miR-653-5p 與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在臨床分期T3～T4、低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓中低表達組所占比例明顯高于高表達組，表明miR-653-5p低表達狀態(tài)與臨床T分期晚、腫瘤低分化、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切有關(guān)，其在抑制結(jié)腸腫瘤細胞生長、侵襲性和增殖方面起著重要作用，miR-653-5p在生物過程中起著類似抑癌物的作用，參與調(diào)控多個基因的表達。

在臨床診斷中ROC 曲線被廣泛應(yīng)用于評價指標(biāo)，通常曲線下面積＞0.9表示診斷價值高，0.7～0.9表示診斷價值較好，0.5～0.7表示診斷價值較低[20]。本研究中ROC 曲線分析顯示miR-653-5p 在血清中的相對表達量預(yù)測結(jié)腸癌AUC 為0.823，診斷的敏感性為80.26%，診斷的特異性為82.89%，具有較好的臨床診斷價值。目前臨床上糞便隱血及血清CEA檢測常用于結(jié)腸癌的早期判斷，但其靈敏度及特異度不高[21]，結(jié)腸鏡的檢出率雖高，但具有侵入性[22]，血清miR-653-5p有潛力成為結(jié)腸癌患者早期診斷及廣泛篩查的新型生物標(biāo)志物。

另外，本研究結(jié)果顯示，miR-653-5p高表達組患者的術(shù)后3年生存率為62.5%，低表達組患者術(shù)后3年生存率為2.8%，高表達組患者術(shù)后生存明顯優(yōu)于低表達組患者，miR-653-5p低表達的患者術(shù)后生存時間較短，預(yù)后差。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床T 分期晚的病例往往腫瘤惡性程度更高，侵襲性和轉(zhuǎn)移性更強，因此，手術(shù)后的長期生存率較低[23]，同時多因素COX分析結(jié)果顯示，臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和miR-653-5p 表達均是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的危險因素，miR-653-5p參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，其表達水平影響著患者的生存時間。

總之，結(jié)腸癌患者血清中miR-653-5p 表達水平明顯低于正常人群，與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、惡性程度、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)，具有較高的臨床應(yīng)用價值。miR-653-5p有潛力成為結(jié)腸癌監(jiān)測、靶向治療、預(yù)后判斷的新型生物標(biāo)志物。