某地區(qū)藥食同源食物真菌污染情況的調(diào)查研究

◎ 陳佳佳，丁 樂，張嫚玲

（長沙醫(yī)學院，湖南 長沙 410219）

中藥材的使用和我國醫(yī)學和特色醫(yī)藥的發(fā)展推廣密不可分。藥食同源食物是中藥材資源中應用最廣泛的一類，但其應用卻受限于藥食同源食物的性質(zhì)。藥食同源食物中含有水，容易被真菌或真菌毒素污染，尤其是生粉入藥和發(fā)酵類制劑的污染時有發(fā)生。湖南自古被稱作“卑濕之地”，多雨潮濕，形成了嗜辣的風俗，但食用過多的辣椒容易上火。百合、蓮子、薄荷是商超中較為常見的藥食同源食物，具備養(yǎng)陰潤肺、安心養(yǎng)神、補脾健胃、清熱降火、促進睡眠和利咽止痛等功效，是居民較為喜好的食物。由于光照、溫度、氣候等諸多因素的影響，藥食同源食物通常會受到真菌的污染，產(chǎn)生真菌毒素，引起腎毒性、肝毒性等毒性反應[1-3]。藥食同源食物的開發(fā)是一個漫長復雜的過程，如果不能妥善處理各個環(huán)節(jié)，就可能會對藥食同源食物造成污染，影響藥食同源食物的質(zhì)量[4]。目前，我國對于藥食同源食物真菌污染的限量未提出明確規(guī)定，調(diào)查藥食同源食物真菌的污染情況，以便強化藥食同源食物的質(zhì)量管理?？紤]到藥食同源性食物真菌污染的普遍性及嚴峻性，需了解不同藥食同源食物真菌污染的具體特征，這對整體強化該類污染防控具有重要指導作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本文研究的藥食同源性食物主要包括百合、薄荷、蓮子3類，均采購于湖南省線下藥店。2022年6—12月，隨機抽取湖南省14個市州中的3個市州（市內(nèi)區(qū)域），每個城市隨機選擇1家零售藥店購置藥食同源食物18份，藥食同源性食物均使用無菌袋獨立包裝，均處于保質(zhì)期內(nèi)，且原始包裝（真空包裝）無破損。采購完成，當即送檢，實驗室取出各藥食同源性食物進行后續(xù)操作。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

稱取藥食同源食物百合、薄荷、蓮子各1 g，粉碎后置于10 mL無菌水中，搖勻，置于4 ℃培養(yǎng)箱中過夜，稀釋樣品懸液到10-1、10-2、10-3和10-4，在培養(yǎng)基涂布10-3、10-4兩個梯度，而后將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱內(nèi)，27 ℃培養(yǎng)7～14 d。培養(yǎng)真菌菌落，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、干燥性等特征，選擇形態(tài)差異較大的真菌，及時轉移到相應的培養(yǎng)基上，劃線、分離、純化。為了獲得純菌落，進行3次分離和純化步驟。將分離的菌株暫存于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，儲存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌落觀察

在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基平板上接種純化菌株，27 ℃培養(yǎng)7～14 d，觀察并記錄菌落大小、顏色、質(zhì)地和分泌物等特征。在載玻片上滴一滴水，刮取少量菌絲和孢子，蓋上蓋玻片。10×40倍光學顯微鏡觀察菌絲的大小和形狀、孢子的顏色和形狀，進行初步鑒定。

1.2.3 菌株鑒定

將50 μL微生物裂解液加入1.5 mL離心管中，將離心管內(nèi)的菌絲進行適度熱處理，處理溫度控制在80 ℃，離心5 min，取上清液。根據(jù)GenBank中菌株AJ005676.1Penicillum expansum和GU565108.1Penicillum janthinellumITS區(qū)域，基于Primer-Blast（NCBI）完成Wen1F/Wen1R引物設計，Nucleotide Blast證實這2種引物可以有效匹配青霉屬數(shù)類真菌株，能成功鑒定很多真菌。針對菌株KC146411.1Aspergillus FlavusITS區(qū)域，設計了引物Wen2F/Wen2R，比對結果顯示可以用于曲霉屬物種的鑒定。PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物上樣提取量為5 μL，恒壓120 V，瓊脂糖凝膠1%，電泳緩沖液1×TAE，電泳時間15 min，拍照設備采用凝膠成像系統(tǒng)。PCR擴增產(chǎn)物測序獲得相關數(shù)據(jù)，登陸NCBI/BLAST檢索測序結果，找出與獲得片段同源性最高的真菌菌株序列。

2 結果與分析

2.1 菌株平板菌落形態(tài)及顯微觀察

曲霉菌絲有隔膜，為多細胞霉菌，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形。曲霉的孢子常見黑色、橙紅色、黃色，無色的部分是菌絲。青霉菌的營養(yǎng)體為無色或淡色的菌絲體，菌絲各細胞之間有橫膈膜，分生孢子梗頂端呈特殊的對稱或不對稱的掃帚狀，在顯微鏡下觀察到大量綠色成串的青霉孢子。枝孢菌落平展或偶作突點狀，呈橄欖色、灰色、褐色或深黑褐色，融狀，絮狀或毛發(fā)狀，在顯微鏡下觀察到分生孢子鏈生，呈枝鏈分布，橢圓形，表面光滑。

2.2 3種藥物各類真菌檢出情況

藥食同源食物樣本總量為18份，真菌污染的樣本為16份，污染率為88.9%，表明真菌污染普遍。從18份藥食同源食物樣品中共分離到真菌46株，其中青霉13株，占分離總菌株數(shù)的28.3%；曲霉17株，占分離總菌株數(shù)的37.0%；枝孢菌5株，占分離總菌株數(shù)的10.9%；無法準確分類的真菌株有11株。由此可知，曲霉菌污染最常見。

3種藥食同源食物相比，薄荷受真菌污染最普遍，成功分離17株真菌；百合中分離出13株真菌；蓮子的污染率相對較低，分離出5株真菌。序列相似性99%以上將做出同種判定。就各菌屬分布來看，從多到少依次為曲霉屬17株、青霉屬13株、枝孢菌5株、無法準確分類的菌株11株。詳見表1。

表1 3種藥食同源食物各類真菌檢出情況表

3 結論與討論

藥食同源性食物真菌中毒導致的不良事件偶有發(fā)生，在種植、加工、貯存等環(huán)節(jié)，均有被污染的風險。此外，真菌毒素種類眾多，部分真菌毒素（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等）對患者身體健康有典型且顯著的損害作用，甚至致癌，因此在日常工作中需高度重視真菌污染的防范。本研究基于真菌分子鑒定法成功分離46株真菌，并完成鑒定；百合中曲霉菌屬、青霉菌屬污染相對嚴重，結果與文獻一致[5]。蓮子中主要為青霉菌，蓮子污染率較百合、薄荷低。枝孢菌屬在本研究中檢出率次于曲霉屬和青霉屬，其很少致病，但有皮膚和腳指甲感染、鼻竇炎、肺部感染的研究報告。如果不能及時處理，這些感染可能會引發(fā)肺炎。霍曉菲等[5]對中藥材及中藥飲片微生物污染情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曲霉和青霉為藥食同源食物真菌感染的優(yōu)勢菌群，其中薄荷污染率最高，該調(diào)查客觀說明了藥食同源食物主要感染的真菌類別。藥食同源食物曲霉檢出較為常見，這與藥食同源食物在種植過程中不可避免遭受的自然界黃曲霉菌和寄生曲霉的侵染有關，也與在外界高溫、高濕環(huán)境中短時間存在，導致曲霉快速生長、繁殖，進一步提升了被污染的風險有關。藥食同源食物發(fā)生霉變的主要環(huán)境因素有溫度、濕度、空氣、光線和酸堿度等，青霉菌的耐熱性很強，菌體繁殖溫度較低，在外界環(huán)境中容易大量繁殖，導致該類污染較為常見。

本研究菌株鑒定采用較為新穎的序列分析方法，該法不同于傳統(tǒng)形態(tài)學的觀察方法，能有效鑒定出不產(chǎn)孢真菌，提高藥食同源食物真菌污染菌群檢測的準確性，縮短檢測時間，提升檢測效率[6-7]。湖南省作為百合、蓮子、薄荷等藥食同源食物的種植和產(chǎn)出大省，需嚴格把控藥食同源食物的種植、采摘、生產(chǎn)和儲存等環(huán)節(jié)的產(chǎn)品質(zhì)量，長期儲存藥食同源食物必須采用適當?shù)募夹g，防潮防熱，陰涼干燥，以源頭為切入點，全面檢測各環(huán)節(jié)產(chǎn)品的真菌污染狀況，設置限量標準，盡可能防范真菌污染，確保藥食同源產(chǎn)品的質(zhì)量及使用安全。