液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中3種磺胺類藥物殘留的不確定度評定

◎ 梁健華，羅苑銘

（陽江市檢測檢驗中心，廣東 陽江 529500）

磺胺類藥物屬于化學合成抗菌劑，由于其價格低廉、抗菌效果好、使用方便[1]，一直被廣泛用于治療雞傳染性鼻炎、白冠病、球蟲病、禽傷寒[2]，以降低畜禽的發(fā)病率，提高出欄率和商品率。磺胺類藥物很容易通過動物身體吸收并蓄積在組織中，在畜禽類食品中造成殘留。研究表明[3]，磺胺類藥物容易損害人體的尿路系統(tǒng)，造成過敏反應，引起抗藥性等?！妒称钒踩珖覙藴?食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[4]規(guī)定所有食品動物的肌肉（包括雞肉）中的磺胺類藥物殘留應≤100 μg·kg-1，而近年來我國對禽肉磺胺類檢測的頻次也越來越多，對磺胺類藥物殘留的監(jiān)管也越來越嚴格，這對檢驗檢測實驗室的能力也提出了更高的要求。

了解檢測過程中測量不確定度的來源以及適當?shù)貙z測結(jié)果的不確定度進行評定，可以有針對性地對檢測過程的重要影響因素進行控制，從而提高檢測結(jié)果的準確度[5-6]。本研究基于農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008[7]以及CNAS—GL006：2019 化學分析中不確定度的評估指南[8]，采用LC-MS/MS法測定雞肉中磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SP）和磺胺甲氧噠嗪（SMP）等3種磺胺類藥物殘留的含量，并對檢測結(jié)果的不確定度進行評定，分析了影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，對提高結(jié)果的準確性具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞肉采購于超市。

23種磺胺類藥物混合標準溶液（100 μg·mL-1，包含SD、SP和SMP）和磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3（100 μg·mL-1）內(nèi)標溶液，均購置于天津阿爾塔；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純。

LCMS-8045液質(zhì)聯(lián)用儀；JJ1000電子天平；100～1 000 μL可調(diào)移液器。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確吸取100 μg·mL-1的磺胺類藥物混合標準溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成濃度為1.0 μg·mL-1的標準儲備液。逐步將100 μg·mL-1的內(nèi)標溶液用甲醇稀釋配制為0.1 μg·mL-1的內(nèi)標工作液。使用移液器分別準確吸取0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.00 mL標準儲備液（1.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，并各加入0.1 mL內(nèi)標工作液，用甲醇定容，分別配制成0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標準曲線工作溶液。

1.2.2 試驗前處理

參照農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008進行雞肉樣品前處理過程。取空白搗碎的雞肉樣品，添加10.0 μg·kg-1磺胺標準物質(zhì)，作為不確定度評定的試驗樣品。稱取5.00 g雞肉樣品于離心管中，加入0.1 mL濃度為0.1 μg·mL-1的內(nèi)標工作液，渦旋混合30 s。往混合液中加入10 g Na2SO4，混合后，加入20 mL酸化乙腈（甲酸∶乙腈=1∶99，V∶V），旋渦1 min，超聲20 min。提取液于4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液于梨形瓶中。加入20 mL酸化乙腈溶解殘渣，重復上述操作，合并2次提取液，在40 ℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加入1.00 mL甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V）溶解殘留物，再加入2.0 mL正己烷，混合30 s，轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r·min-1離心5 min，取下層清液過0.22 μm微孔濾膜，供LC–MS/MS測定。

1.2.3 LC–MS/MS條件

（1）液相色譜條件。ACE Excel 2 SuperC18色譜柱（2 μm，100 mm×2.1 mm）；流動相：0.1%甲酸（含2.0 mmol·L-1乙酸銨）（A）-乙腈（B）。液相色譜梯度洗脫程序：0～0.01 min，3%B；0.01～7.00 min，50%B；7.0～7.1 min，3%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離ESI（+）；掃描模式：多反應監(jiān)測模式。

1.2.4 數(shù)學模型

雞肉中SD、SP和SMP的含量計算公式為

式中：X為雞肉中各磺胺類藥物殘留含量，μg·kg-1；C1為樣液中各磺胺類藥物殘留濃度，ng·mL-1；C0為空白樣液中各磺胺類藥物殘留濃度，ng·mL-1；V為最終定容體積，mL；m為雞肉的稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源的識別和分析

根據(jù)試驗方法和數(shù)學模型，磺胺類藥物殘留檢測過程中主要受到提取、曲線校準、回收率和儀器檢測等4個方面的影響，如圖1所示。①提取過程，主要包括樣品稱量、提取除雜方法和樣液定容等測量不確定度分量，而提取除雜方法的測量不確定度分量納入回收率和重復性中。②曲線校準，其不確定度主要包括標準物質(zhì)、標準工作溶液配制和標準工作曲線擬合等不確定度分量。③回收率，可使用回收率的重復性標準偏差表示其不確定度。④儀器檢測，樣品檢測的測量不確定度主要由重復性和儀器的響應組成，而重復性包括了儀器的響應，因此只需要評定測量的重復性。由此可見，磺胺類殘留物檢測中引入的不確定度包括樣品稱量urel(m)、樣液定容urel(V)、標準工作溶液配制urel(cc)、標準工作曲線擬合urel(C)、回收率urel(R)和樣品重復性測試urel(re)。

圖1 測量不確定度因果關(guān)系圖

2.2 不確定度分量的量化

2.2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

樣品稱量引入的不確定度主要表現(xiàn)為天平的校準和重復性。

（1）天平的校準引入的不確定度u(m1)。天平檢定證書給出的天平示值誤差的擴展不確定度為U=0.03 g，k=2。每個樣品均使用了2次天平進行稱量，而稱量過程是獨立的，則由天平校準引入的不確定度為

（2）天平重復性引入的不確定度u(m2)。天平檢定證書給出的天平重復性誤差為0.01 g，對于每個樣品，均使用了2次天平稱量，按與2.2.1（1）相同的方法計算，則由天平重復性引入的不確定度為u(m2)=0.007 1 g。

2.2.2 樣液定容引入的相對標準不確定度urel(V)

定容采用1 000 μL移液器吸取甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V），引入的測量不確定度主要由移液器校準給出的測量不確定度、示值的允許誤差限和定容溫度的影響組成。

（1）移液器校準引入的不確定度u(V1)。移液器校準證書給出的擴展不確定度為U=0.007 μL，k=2，則由校準引入的標準不確定度為

（2）移液器示值誤差引入的不確定度u(V2)。移液器示值允許誤差為1.0 μL，按矩形分布，則其標準不確定度為

（3）使用移液器由溫度變化引入的不確定度u(V3)。移液器校準時的溫度為20 ℃，實驗時的溫度約為26 ℃，已知水的膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，則移液器產(chǎn)生的體積變化為10×6×0.000 21=0.012 6 μL，按矩形分布，則由溫度變化引入的標準不確定度為

則使用移液器定容引入的相對標準不確定度urel(V)為

2.2.3 標準工作溶液配制引入的不確定度urel(cc)

（1）標準物質(zhì)引入的不確定度urel(S)。由標準物質(zhì)證書得到SD、SP和SMP的質(zhì)量濃度分別為100.0 μg·mL-1、100.1 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1，相對擴展不確定度Urel均為0.05（k=2），則其相對標準不確定度為

（2）標準儲備液配制引入的不確定度urel(ca)。配制1.0 μg·mL-1標準儲備液使用了1 000 μL移液器和10 mL容量瓶，容量瓶定容和移液器吸液引入的測量不確定度均表現(xiàn)為校準給出的測量不確定度、示值的允許誤差限和定容溫度的影響，計算過程同2.2.2。

①使用量瓶引入的不確定度urel(c)。容量瓶校準證書給出的擴展不確定度為U=0.006 mL，k=2，則由校準引入的標準不確定度為根據(jù)JJG 196—2006[9]，容量為10 mL的A級單標線容量瓶的最大示值允許誤差為0.020 mL，按矩形分布，則由示值允許誤差引入的標準不確定度為校準容量瓶時的溫度為20 ℃，而檢測時的溫度約為26 ℃，已知甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 18/℃，則容量瓶產(chǎn)生的體積變化為10×6×0.001 18=0.070 8 mL，按矩形分布，則由溫度變化引入的標準不確定度為使用容量瓶引入的相對標準不確定度為

②使用移液器引入的不確定度urel(a)。根據(jù)2.2.2（1）和（2），1 000 μL移液器由校準、示值允許誤差引入的標準不確定度分別為0.003 5 μL和0.58 μL。吸取甲醇由溫度變化引入的標準不確定度為1 000×6×0.001 18/則使用移液器引入的相對標準不確定度為

則標準儲備液配制引入的相對標準不確定度urel(ca)為

（3）標準曲線工作溶液配制產(chǎn)生的不確定度urel(pz)。配制標準曲線工作溶液過程使用了4次1 000 μL移液器和4次10 mL容量瓶，因此使用容量瓶和移液器構(gòu)成了配制標準曲線工作溶液不確定來源的主要因素。①使用容量瓶引入的不確定度urel(c4)。使用容量瓶引入的不確定度的計算同2.2.3（2）①，由于使用4個容量為10 mL的容量瓶是相互獨立的，所以其合成相對標準不確定度為②使用移液器引入的不確定度urel(bz)。標準曲線工作溶液配制過程使用了4次可調(diào)移液器，其引入的測量不確定度計算過程同2.2.3（2）②，結(jié)果見表1。

表1 使用移液器產(chǎn)生的測量不確定度分量表

則標準曲線工作溶液配制引入的相對標準不確定度urel(pz)為

則標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度urel(cc)為

2.2.4 標準工作曲線擬合引入的不確定度urel(C)

取5個濃度水平點系列標準使用溶液各測定1次，以標準溶液濃度與內(nèi)標濃度的比值對標準溶液色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比值作線性擬合得到回歸方程y=b0+b1C，測定結(jié)果見表2。由表2可知，SD、SP和SMP的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)r2分別為y=0.067 2+0.043 9CSD（r2=0.999 2），y=0.125 9+0.041 4CSP（r2=0.995 5）和y=0.235 7+0.111 4CSMP（r2=0.998 2）。

表2 3種磺胺類藥物殘留標準工作曲線測定結(jié)果表

本實驗對提取液進行了6次測定，由線性回歸方程求得各次測定值，計算3種磺胺類藥物殘留的平均質(zhì)量濃度C，其中SD、SP和SMP的平均質(zhì)量濃度C分別為49.02 ng·mL-1、48.93 ng·mL-1和48.71 ng·mL-1，根據(jù)CNAS—GL006：2019，其相對標準不確定度urel(C)為

式中：SR為標準溶液峰面積比值的標準偏差，C為各磺胺類藥物殘留的平均質(zhì)量濃度，ng·mL-1；b1為線性回歸方程的斜率；P為樣品測定液重復測定的次數(shù)，P=6；n為標準工作溶液測定的次數(shù)，n=5；為標準系列工作溶液的平均質(zhì)量濃度，Ci為標準工作溶液的質(zhì)量濃度，ng·mL-1。

經(jīng)計算得到，SD、SP和SMP的檢測過程中由標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C)分別為0.017、0.040和0.026。

2.2.5 回收率引入的不確定度urel(R)

在空白雞肉樣品中加入10 μg·kg-1的磺胺混合標準溶液，在再現(xiàn)性的條件下，測定6次，并計算回收率，回收率的測量不確定度urel(R)采用其重復性標準偏差表示，結(jié)果如表3所示。

表3 回收率測定結(jié)果表

2.2.6 樣品重復性測試引入的不確定度urel(re)

采用空白雞肉樣品加入10 ng·kg-1的磺胺類藥物混合標準溶液，在重復性的條件下，測定6次，得到6次測定結(jié)果，并采用測定結(jié)果的標準偏差表示重復性的測量不確定度，樣品重復性測試引入的相對標準不確定度urel(re)的結(jié)果如表4所示。

表4 重復測定的結(jié)果表

2.3 相對標準不確定度的合成及擴展

2.3.1 合成相對標準不確定度urel(X)

對樣品稱量、樣液定容、標準工作溶液配制、標準工作曲線擬合、回收率和重復性等各相對不確定度分量進行分析，合成相對標準不確定度為

經(jīng)計算得SD、SP和SMP檢測過程中的合成相對標準不確定度urel(X)分別為0.071 5、0.080 1和0.075 0。

2.3.2 相對擴展不確定度Urel

取置信概率95%，k=2，得到LC–MS/MS法測定雞肉中SD、SP和SMP的相對擴展不確定度Urel分別為0.143、0.160和0.150。

2.3.3 擴展不確定度U

根據(jù)表4，當雞肉中SD、SP和SMP的殘留量分別為9.78 μg·kg-1、9.67 μg·kg-1和9.54 μg·kg-1，按照公式U=Urel×X，則SD、SP和SMP檢測過程中擴展不確定度分別為1.40 μg·kg-1、1.55 μg·kg-1和1.43 μg·kg-1。

2.3.4 結(jié)果表示

通過LC–MS/MS法測定雞肉中SD、SP和SMP殘留量的測定結(jié)果分別為（9.78±1.40） μg·kg-1、（9.67±1.55） μg·kg-1和（9.54±1.43） μg·kg-1。

3 結(jié)論

本研究采用LC–MS/MS法測定雞肉中SD、SP和SMP含量，并對試驗過程中樣品稱量、樣液定容、標準工作溶液配制、標準工作曲線擬合、回收率和重復性等因素產(chǎn)生的不確定度進行分析評定。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，標準工作溶液配制和標準工作曲線擬合是影響實驗結(jié)果準確性的主要因素。為了提高檢測結(jié)果的準確性，在試驗過程中應使用校準后的容量瓶和移液器，并適當增加標準工作曲線的濃度點及測定次數(shù)。