農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

◎ 祝 愿，李 俊，賴 飛，熊勝利，龐宏宇，蘇美丞，王 震，劉 凱，張 瑞，蔡 滔

（1.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州省綠色食品發(fā)展中心，貴州 貴陽 550001）

隨著食品、環(huán)境、公共安全等領(lǐng)域快速測(cè)試要求的發(fā)展，現(xiàn)有的儀器測(cè)試過程和技術(shù)已無法滿足現(xiàn)場(chǎng)判定的及時(shí)性和易操作的要求?？焖贆z測(cè)技術(shù)是近年來普遍推廣與使用的檢測(cè)技術(shù)，指在短時(shí)間內(nèi)利用物理、化學(xué)、生物等檢測(cè)技術(shù)完成待檢樣品目標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定，判斷是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值[1]?？焖贆z測(cè)技術(shù)前處理操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備的條件要求不高，可以現(xiàn)場(chǎng)或在線進(jìn)行快速檢測(cè)。目前隨著檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展和食品安全問題的日益突出，快速檢測(cè)技術(shù)以其快捷、靈敏度高、成本低的分析優(yōu)勢(shì)成為檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向[2]。

1 快速檢測(cè)方法

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）是根據(jù)待測(cè)物與固定相吸附能力不同，分離目標(biāo)物質(zhì)的一種薄層色譜分離方法。因農(nóng)藥理化性質(zhì)不同，對(duì)同一吸附劑（固定相）吸附力強(qiáng)度不同，洗脫劑（流動(dòng)相）帶動(dòng)農(nóng)藥在固定相中發(fā)生連續(xù)吸附、解吸作用，最終使不同農(nóng)藥分離形成一系列斑點(diǎn)[3]。吸附劑對(duì)農(nóng)藥吸附存在差異，形成不同遷移距離的譜帶，通過目標(biāo)物質(zhì)與對(duì)照物色譜圖比移值（Rf）的對(duì)比，以達(dá)到鑒別農(nóng)藥性質(zhì)或測(cè)定其含量的目的。

1.2 酶聯(lián)免疫技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，EIAS）分析方法屬于免疫分析法的一種，能高靈敏度地定量分析農(nóng)藥殘留。以抗體固相化和抗原的酶標(biāo)記，放大目標(biāo)分析物的特異度和靈敏度，按照原理，試驗(yàn)步驟分為抗原或抗體的捕獲（固定）、抗原-抗體結(jié)合、酶促反應(yīng)。待檢樣品與固相載體表面之間以抗原-抗體形式結(jié)合，經(jīng)洗滌劑洗脫下未能結(jié)合的物質(zhì)，再加入具備免疫和酶雙重活性的酶標(biāo)記抗原（抗體），在固相上形成抗體-抗原-抗體結(jié)合物，酶反應(yīng)底物加入后，底物被催化為有色產(chǎn)物，根據(jù)顯色深淺對(duì)待檢物質(zhì)進(jìn)行定性或半定量[4]。

1.3 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)（Immune Colloidal Gold Technique，GICT）是以金顆粒受靜電作用形成穩(wěn)定膠體狀的膠體金為示蹤標(biāo)記物，經(jīng)膠體金與目標(biāo)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合，抑制抗體與硝酸纖維膜上半抗原-蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合，通過硝酸纖維膜檢測(cè)線（T線）顏色深淺變化，對(duì)樣品目標(biāo)物進(jìn)行定性判斷[5]。膠體金經(jīng)還原（還原劑：白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸）后的氯金酸聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金[6]。

1.4 酶抑制率法

酶抑制率法是目前國(guó)內(nèi)農(nóng)殘快速檢測(cè)中現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。通過檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制膽堿酯酶活性的酶抑制率來測(cè)定農(nóng)藥殘留，農(nóng)藥含量與酶抑制率呈正相關(guān)[7]。膽堿酯酶與底物發(fā)生催化、水解的過程，反應(yīng)底物由紅色水解為藍(lán)色，酶活受有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制后，變色過程發(fā)生變化，經(jīng)分光光度計(jì)或速測(cè)卡片測(cè)定吸光度變化率，對(duì)樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行半定量[8]。酶抑制法因底物、酶、顯色劑有一定的特異性，并受樣品基質(zhì)的干擾易出現(xiàn)假陽性或假陰性誤判[2]。

2 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

我國(guó)食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)在近十年發(fā)展較為迅速，已逐漸成為基層監(jiān)管機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)開展檢測(cè)的主要技術(shù)手段。現(xiàn)行有效的各類發(fā)布形式的農(nóng)殘快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（表1）共41項(xiàng)，其中國(guó)標(biāo)1項(xiàng)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)5項(xiàng)，地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)，團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)33項(xiàng)。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中以單一農(nóng)藥殘留分析和免疫膠體金法檢測(cè)方法主，項(xiàng)目涵蓋克百威、多菌靈、吡蟲啉、毒死蜱和腐霉利等50個(gè)農(nóng)藥參數(shù)，涉及檢測(cè)對(duì)象有蔬菜、水果、大米、茶葉、植物類中藥材及其飲片。

表1 農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)匯總表

快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)涵蓋50項(xiàng)農(nóng)藥參數(shù)，覆蓋了14項(xiàng)國(guó)家禁限用農(nóng)藥（克百威、毒死蜱、水胺硫磷、甲拌磷、三唑磷、對(duì)硫磷、氧樂果、百草枯、甲胺磷、樂果、氰戊菊酯、涕滅威和乙酰甲胺磷），其中克百威等23項(xiàng)農(nóng)藥有1項(xiàng)以上的快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在一程度上快速檢測(cè)產(chǎn)品與其標(biāo)準(zhǔn)的配合使用，能有效提升基層檢驗(yàn)檢測(cè)效能，成為切實(shí)維護(hù)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的第一道防線。

3 速測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)

現(xiàn)有速測(cè)產(chǎn)品種類多、質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致速測(cè)結(jié)果可溯源性差，因此需按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳《關(guān)于2022年度常規(guī)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)結(jié)果的通報(bào)》（農(nóng)辦質(zhì)〔2022〕14號(hào)），對(duì)速測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)。必須關(guān)注其靈敏性、適用性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性等技術(shù)指標(biāo)，并統(tǒng)籌考慮操作程序的煩瑣度、操作便捷度和結(jié)果識(shí)讀方式科學(xué)性等因素。方法驗(yàn)證評(píng)價(jià)的主要技術(shù)參數(shù)包含靈敏度與穩(wěn)定性、陰性和陽性臨界值等[2]。目前，對(duì)檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)驗(yàn)證研究逐漸成為熱點(diǎn)，已經(jīng)公布的快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（規(guī)范）見表2，共有5項(xiàng)，1項(xiàng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部評(píng)價(jià)方案，1項(xiàng)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局的食品快速檢測(cè)使用規(guī)范，其余3項(xiàng)為深圳、江西、湖北出臺(tái)的地方標(biāo)準(zhǔn)。

5項(xiàng)評(píng)價(jià)方案均對(duì)定性和定量快速檢測(cè)產(chǎn)品提出了一系列技術(shù)指標(biāo)。其中定性快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)方案技術(shù)一般包括檢出限（臨界值）、靈敏度、特異性、假陰性率/假陽性率、檢測(cè)時(shí)間。定量快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)方案技術(shù)一般包括檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、線性和范圍、檢測(cè)時(shí)間，評(píng)價(jià)試驗(yàn)采用盲樣測(cè)試，所得結(jié)果與相應(yīng)指標(biāo)要求比對(duì)判定。

3.1 盲樣測(cè)試

盲樣測(cè)試包括有證食品（農(nóng)產(chǎn)品）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、參考物質(zhì)和自行制備盲樣，其中自行制備盲樣的均勻性和穩(wěn)定性應(yīng)滿足《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》（CNAS—GL003：2018）[9]，或其他同等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（規(guī)范）。盲樣的組成分為陽性樣品（加標(biāo)樣品）、陰性樣品，其數(shù)量應(yīng)滿足在同一條件下，不同批次的快檢產(chǎn)品和同一批次的快檢產(chǎn)品，檢測(cè)結(jié)果符合參比方法檢測(cè)的顯著性檢驗(yàn)要求。陽性樣品用于考察產(chǎn)品的假陰性率、假陽性率，以有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值的物質(zhì)為添加物質(zhì)，添加水平應(yīng)等同或低于檢出限（臨界值）的需求，其中檢出限的0.5倍水平用于考察產(chǎn)品的假陽性率，1倍水平用于考察產(chǎn)品假陰性率[10]。陰性樣品用于考察產(chǎn)品的假陽性率。

3.2 參比方法

參比方法是指經(jīng)過系統(tǒng)研究，具備清晰嚴(yán)密的物質(zhì)特征值測(cè)量及其整體程序和所需條件的一種方法，且該方法具備與預(yù)期用途相稱的準(zhǔn)確度和及其他性能[11]。優(yōu)先選擇國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢指定檢測(cè)方法或卡方試驗(yàn)[12]對(duì)參比方法進(jìn)行一致性測(cè)試?？ǚ皆囼?yàn)計(jì)算公式為

式中：a表示被快檢產(chǎn)品檢測(cè)為陽性，但參比方法檢測(cè)為陰性的樣品數(shù)量；b表示被快檢產(chǎn)品檢測(cè)為陰性，但參比方法檢測(cè)為陽性的樣品數(shù)量。卡方χ2結(jié)果（95%置信區(qū)間下）評(píng)價(jià)：χ2＜3.81表示快檢產(chǎn)品與參比方法的陽性確證率無顯著性差異；χ2＞3.81表示快檢產(chǎn)品與參比方法的陽性確證比率正有顯著性差異。若能證實(shí)快檢產(chǎn)品比參比方法有更高的靈敏度，則陽性樣品確證率在兩者之間的顯著性差異可接受。

3.3 檢出限（臨界值）

對(duì)于已有國(guó)家規(guī)定的快速檢測(cè)方法，產(chǎn)品檢測(cè)限應(yīng)符合對(duì)應(yīng)的方法檢測(cè)限要求。對(duì)于沒有國(guó)家規(guī)定的快速檢測(cè)方法，禁用物質(zhì)或無限量要求的物質(zhì)檢測(cè)限應(yīng)與參比方法檢測(cè)限比較；存在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值的物質(zhì)，應(yīng)等同或低于限量值。

3.4 靈敏度、特異性、假陰（陽）性率

靈敏度、特異性、假陰（陽）性率要根據(jù)表3的盲樣快速檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在不同規(guī)范文件中，最低檢出限包括但不限于：等同或小于GB 2763—2021規(guī)定的食品中農(nóng)藥殘留最大限量0.5倍水平或1倍水平；待檢目標(biāo)為禁用物質(zhì)時(shí)，等同或小于參比方法中檢出限1倍的濃度水平。

表3 盲樣快速檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

（1）靈敏度（p+）為實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最低檢出限時(shí)，陽性樣品（盲樣）中檢出陽性結(jié)果的概率，p+=N11/N1×100%。

（2）特異性（p-）為實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最低檢出限時(shí)，陰性樣品（盲樣）中檢出陰性結(jié)果的概率，p-=N22/N2×100%。

（3）假陰性率（pf-）為實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最低檢出限時(shí)，陽性樣品中（盲樣）檢出陰性結(jié)果的概率，pf-=N12/N1×100%。

（4）假陽性率（pf+）為實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最低檢出限時(shí)，陰性樣品中（盲樣）檢出陽性結(jié)果的概率，pf+=N21/N2×100%。

3.5 檢測(cè)時(shí)間

原則上單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間（包括從樣品前處理到最后出結(jié)果的整個(gè)過程）應(yīng)小于30 min，或6個(gè)樣品的總檢測(cè)時(shí)間小于120 min[13]。

4 結(jié)語

在《中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》中規(guī)定，復(fù)檢不得采用快速檢測(cè)方法。在實(shí)際應(yīng)用中快速檢測(cè)方法主要在現(xiàn)場(chǎng)在線檢測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用。開發(fā)、應(yīng)用和推廣農(nóng)殘快速檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)長(zhǎng)期工作，需要從科技、行政、立法等環(huán)節(jié)協(xié)同發(fā)力，有效確保檢驗(yàn)檢測(cè)過程的程序性公正和結(jié)果性公正。