玉米-大芻草滲入系群體的劍葉遺傳基礎(chǔ)解析

高沐甜 邱冠杰 朱通通 李瑞蓮,2,3 鄧敏,2,3 羅紅兵,2,3 黃成,2,3

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，410128，湖南長沙；2 作物生理與分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，410128，湖南長沙；3 湖南省玉米工程技術(shù)研究中心，410128，湖南長沙）

玉米劍葉是玉米雌穗苞葉頂端的進(jìn)一步延伸，是玉米長期進(jìn)化過程中退化的一種器官，是鑒別玉米品種和種質(zhì)來源的重要性狀之一[1]。不同種質(zhì)來源玉米的劍葉長度差異較大，大部分溫帶甜玉米具有較長的劍葉，而大部分熱帶玉米則沒有劍葉或劍葉較短[2]。劍葉作為玉米雌穗的重要組成部分，對玉米雌穗的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成都具有重要作用。Cantrell 等[3]在3 個(gè)環(huán)境下利用6 個(gè)具有長劍葉的不同馬齒型玉米材料探究了劍葉與產(chǎn)量之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)材料中有4 個(gè)在完全去除劍葉的條件下顯著降低了玉米產(chǎn)量，平均降幅為2.6%。Sawada 等[4]進(jìn)一步利用水培和大田試驗(yàn)探究了劍葉和莖生葉在光合速率和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的特征，發(fā)現(xiàn)劍葉與莖生葉具有大致相當(dāng)?shù)墓夂纤俾?，但劍葉的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)效率（96%～97%）顯著高于莖生葉（87%～92%），這可能得益于劍葉比莖生葉更接近籽粒。因此，解析玉米劍葉的遺傳基礎(chǔ)、鑒定控制玉米劍葉的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）和挖掘相關(guān)候選基因?qū)ε嘤齽θ~性狀適中的優(yōu)良玉米新品種具有重要意義。

玉米劍葉受氣候和土壤等環(huán)境因素影響，在光照、溫度、濕度、水分、肥料和生長空間等環(huán)境因素適宜的條件下易出現(xiàn)[2]。同時(shí)，玉米劍葉也受遺傳因素控制。Cantrell 等[5]利用2 個(gè)長劍葉玉米自交系（A639 和A509）和2 個(gè)無劍葉自交系（W153R和A634）構(gòu)建的4 個(gè)F2群體對玉米劍葉面積的廣義遺傳力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，玉米劍葉面積的廣義遺傳力變化范圍為30%～76%，表明玉米劍葉面積受遺傳因素控制。盡管研究人員圍繞玉米劍葉從栽培、生理和遺傳等方面開展了相關(guān)研究并取得了一定的成果，但利用現(xiàn)代玉米（Zea maysssp.mays）自交系與玉米野生祖先種大芻草（Zea maysssp.parviglumis）構(gòu)建的滲入系群體解析玉米劍葉遺傳基礎(chǔ)的研究尚未見報(bào)道。

大量考古學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，玉米是大約1萬年前由分布于墨西哥西南部的大芻草（Zea maysssp.parviglumis）馴化而來[6-8]。在長期選擇馴化過程中，現(xiàn)代栽培玉米與大芻草呈現(xiàn)出巨大的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異[9-11]，具體表現(xiàn)為大芻草多分蘗、多穗、叢生、莖稈細(xì)、易落粒、籽粒單行互生且外圍包裹有堅(jiān)硬的果殼，而現(xiàn)代栽培玉米則分蘗很少或沒有分蘗、莖稈粗壯、不易落粒、籽粒多行且完全裸露。此外，現(xiàn)代栽培玉米的遺傳多樣性也嚴(yán)重降低。Wright 等[12]利用14 個(gè)代表性的玉米（Zea maysssp.mays）自交系和16 個(gè)大芻草（Zea maysssp.parviglumis）自交系材料，對774 個(gè)基因片段的SNP多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代栽培玉米僅保留了大芻草中約57%的遺傳多樣性。玉米劍葉也被認(rèn)為是一種返祖現(xiàn)象。因此，利用現(xiàn)代玉米自交系與玉米野生祖先種大芻草構(gòu)建的滲入系群體解析玉米劍葉的遺傳基礎(chǔ)，不僅可以增強(qiáng)對玉米馴化過程的理解，也為玉米劍葉性狀的遺傳改良提供了基因資源。

本研究利用一套由玉米自交系W22 與玉米野生祖先種大芻草雜交衍生得到的、包含866 個(gè)家系的滲入系材料，進(jìn)一步結(jié)合19 838 個(gè)SNP 分子標(biāo)記，對玉米劍葉進(jìn)行QTL 定位分析，旨在為克隆玉米劍葉相關(guān)基因和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是在美國玉米種質(zhì)資源中心（Maize Coop Stock Center）獲得的以玉米野生祖先種大芻草作為供體親本、現(xiàn)代玉米自交系W22 作為受體親本，通過1 次雜交、2 次回交和3 次自交得到的BC2S3滲入系群體。該群體包含866 個(gè)家系，且利用簡化基因組測序技術(shù)獲得了覆蓋玉米全基因組的19 838 個(gè)SNP 分子標(biāo)記。

1.2 田間種植

2019 年春季，在湖南省瀏陽市（113.6°E，28.2°N）國家農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)站種植上述玉米-大芻草滲入系群體。田間試驗(yàn)采用擴(kuò)增式不完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)種植2 行，每行15 株，株距25cm。每壟種植2 個(gè)家系，壟高15cm，壟寬70cm，溝寬30cm。根據(jù)當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)大田生產(chǎn)管理措施進(jìn)行水肥管理和病蟲草害防治。

1.3 表型調(diào)查

參照Wills 等[13]調(diào)查玉米多穗性狀的方法，每個(gè)家系材料從第2 株開始，連續(xù)調(diào)查10 個(gè)單株。如果一個(gè)家系材料10 個(gè)單株中出現(xiàn)劍葉長度大于2cm 的單株，則將該家系的表型值記為1；如果一個(gè)家系材料10 個(gè)單株中沒有出現(xiàn)劍葉長度大于2cm 的單株，則將該家系的表型值記為0；如果一個(gè)家系材料調(diào)查的單株數(shù)小于3，則將該家系的表型值記為NA（not available）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SAS 軟件（v9.1；SAS Institute，Cary，NC）計(jì)算每個(gè)家系材料表型值的最佳線性無偏估計(jì)值（best linear unbiased prediction，BLUP），計(jì)算得到的BLUP 值用于QTL 定位分析。利用R 軟件（v4.1.2）進(jìn)行表型相關(guān)性分析。

1.5 QTL 定位

利用R/qtl 的多QTL 模型進(jìn)行QTL 定位分析，具體參照Huang 等[14]的方法。首先利用scanone 命令進(jìn)行QTL 簡單區(qū)間定位分析，并采用置換檢驗(yàn)（Permutation test）10 000 次的方法確定顯著QTL的似然函數(shù)比值對數(shù)值（logarithm of odds，LOD）閾值（α=0.05）。進(jìn)一步擬合多QTL 模型，并利用refineqtl 命令優(yōu)化QTL 位置，然后利用addqtl 命令檢測是否存在其他可以顯著改善模型的QTL。如果檢測到新的QTL，則重新擬合多QTL 模型，重復(fù)此過程，直至檢測不到新的可以顯著改善模型的QTL。最后利用fitqtl 命令計(jì)算所有QTL 解釋的總表型變異和單個(gè)QTL 的表型貢獻(xiàn)率。QTL 置信區(qū)間定義為QTL 的LOD 峰值下降1.5 對應(yīng)的區(qū)間。依據(jù)McCouch 等[15]提出的方法進(jìn)行QTL 命名。

1.6 基因組織表達(dá)特異性分析

玉米苞葉RNA-seq 測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)下載于美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），數(shù)據(jù)編號分別為SRR15988094、SRR15988095 和SRR15988097。首先利用fastp 軟件對下載的RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，然后利用Salmon 軟件將質(zhì)量控制后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比對到玉米B73 參考基因組（RefGen_V4）。唯一比對到參考基因組的數(shù)據(jù)用于計(jì)算TPM（Transcripts Per Million）值。其他9 個(gè)組織（根、莖、成熟葉、未成熟葉、莖尖分生組織、花絲、種子、幼嫩的雌穗、幼嫩的雄穗）的FPKM（Fragments Per Kilobase Million）表達(dá)數(shù)據(jù)下載于MaizeGDB（http://www.maizegdb.org）數(shù)據(jù)庫。利用R 軟件將FPKM 值轉(zhuǎn)換為TPM 值，轉(zhuǎn)換公式如下，TPMi=(FPKMi/∑jFPKMi)×106。

將校正后的TPM 值進(jìn)一步換算為以10 為底的對數(shù)值，并用TBtools[16]軟件的HeatMap 功能繪制基因的表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲入系群體劍葉表型分析

調(diào)查滲入系群體劍葉表型，發(fā)現(xiàn)部分家系材料在雌穗苞葉頂端長有較長的劍葉（大于20cm），而大部分家系材料則完全沒有劍葉（圖1a）。進(jìn)一步對雌穗苞葉生長劍葉的位置進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)有些家系材料并不是最上端的苞葉長有最長的劍葉，而第2～4 片苞葉也可能長有最長的劍葉（圖1a）。對滲入系群體866 個(gè)家系材料進(jìn)行表型比例分析（圖1b）發(fā)現(xiàn)，68%的家系材料不長劍葉，僅有29%長有劍葉，另外3%沒有可用的表型值。

圖1 滲入系群體劍葉表型分析Fig.1 Phenotypic analysis of the flag leaf in the introgression line population

2.2 劍葉與其他性狀相關(guān)性分析

劍葉作為玉米雌穗的重要組成部分，可能影響玉米籽粒產(chǎn)量和植株發(fā)育。利用R 軟件分析劍葉與粒長、粒寬、粒厚、百粒重、株高[17]、穗位高[17]、莖長[18]、莖粗[18]、種子出苗率[19]、葉綠素含量[20]等性狀的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，劍葉與粒寬（r=-0.11）、粒厚（r=-0.01）和百粒重（r=-0.16）等產(chǎn)量性狀呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與株高（r=0.08）、穗位高（r=0.09）、莖長（r=0.11）和葉綠素含量（r=0.11）等性狀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），但與粒長（r=0.02）、莖粗（r=0.01）和種子出苗率（r=0.006）等性狀呈不顯著正相關(guān)（P＞0.05）（圖2）。

圖2 劍葉與其他性狀相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between flag leaf and other traits

2.3 QTL 定位分析

利用R/qtl 的多QTL 模型對玉米-大芻草滲入系群體劍葉性狀進(jìn)行QTL 定位分析。首先采用置換檢驗(yàn)10 000 次的方法確定檢測顯著QTL 的LOD閾值為4.28，結(jié)果共檢測到9 個(gè)控制玉米劍葉的QTL（圖3），分別位于第1、2、3、4、5、7 和8號染色體，其中第1 和第5 號染色體均含有2 個(gè)QTL，表明玉米劍葉屬于由多基因控制的數(shù)量性狀。

圖3 滲入系群體劍葉QTL 圖譜Fig.3 QTL mapping for flag leaf in the introgression line population

由表1 可知，共檢測到9 個(gè)控制玉米劍葉的QTL，分別命名為qFL1-1、qFL1-2、qFL2-1、qFL3-1、qFL4-1、qFL5-1、qFL5-2、qFL7-1和qFL8-1，各QTL 置信區(qū)間兩側(cè)的分子標(biāo)記分別為m00191 與m01743、m04426 與m05704、m08696 與m12985、m16430 與m16819、m21495 與m22749、m25472與m25799、m29042 與m29724、m39972 與m40321、m42951 與m44940。9 個(gè)QTL 共解釋30.94%的表型變異。單個(gè)QTL 的表型貢獻(xiàn)率變幅為1.76%～11.51%，加性效應(yīng)的變幅為-0.03～0.12，LOD 峰值的變幅為4.49～27.49。檢測到的9 個(gè)QTL 中僅有qFL3-1的表型貢獻(xiàn)率（11.51%）大于10%，其余8個(gè)QTL 的表型貢獻(xiàn)率均小于5%，表明該套群體中玉米劍葉性狀由1 個(gè)主效QTL 加多個(gè)微效QTL 控制。進(jìn)一步分析QTL 加性效應(yīng)方向，發(fā)現(xiàn)9 個(gè)QTL中的7 個(gè)QTL 均來自玉米等位基因降低劍葉表型值，表明劍葉在玉米長期馴化和改良過程中可能受到定向選擇，這也與大部分現(xiàn)代栽培玉米不具有劍葉一致。

表1 劍葉QTL 定位結(jié)果Table 1 QTL mapping results for flag leaf

2.4 qFL3-1 位點(diǎn)候選基因挖掘

由QTL 表型效應(yīng)分析可知，在所有檢測到的9個(gè)QTL 中，qFL3-1具有最大的表型貢獻(xiàn)率，可以解釋11.51%的表型變異（表1）。qFL3-1置信區(qū)間的物理距離為3.14Mb，遺傳距離為0.97cM（圖4a）。進(jìn)一步根據(jù)玉米B73 參考基因組（RefGen_V4）數(shù)據(jù)庫（http://www.maizegdb.org），在玉米第3 號染色體qFL3-1的置信區(qū)間內(nèi)共檢索到31 個(gè)注釋基因（圖4b）。利用玉米在線數(shù)據(jù)庫分析31個(gè)基因在玉米苞葉、根、莖、成熟葉、未成熟葉、莖尖分生組織、花絲、種子、幼嫩雌穗和幼嫩雄穗等10 個(gè)不同組織器官中表達(dá)特異性，發(fā)現(xiàn)31 個(gè)基因中僅有5 個(gè)基因特異性在玉米苞葉中高表達(dá)，而在其他組織器官均表達(dá)量較低，分別是Zm00001d042099、Zm00001d042104、Zm00001d042117、Zm00001d042134和Zm00001d042135（圖4c）。

圖4 qFL3-1 位點(diǎn)候選基因分析Fig.4 Candidate gene analysis of qFL3-1

基于玉米B73 參考基因組（RefGen_V4）注釋信息，對篩選出的5 個(gè)基因進(jìn)行基因功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)Zm00001d042099和Zm00001d042104均編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，Zm00001d042117編碼一個(gè)吡咯啉-5-羧酸還原酶，而Zm00001d042134和Zm00001d042135均編碼氨基酸通透酶（表2）。雖然谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、吡咯啉-5-羧酸還原酶和氨基酸通透酶在植物生長發(fā)育、次生代謝和逆境脅迫響應(yīng)過程中起著重要的作用，但相關(guān)基因的生物學(xué)功能仍有待繼續(xù)利用基因工程方法進(jìn)行證實(shí)和研究。

表2 qFL3-1 候選基因Table 2 Candidate genes of qFL3-1

3 討論

玉米劍葉是大部分溫帶甜玉米雌穗的典型特征，具有較長劍葉的鮮食玉米一般更受廣大消費(fèi)者的青睞，因而具有更大的市場潛力，但目前關(guān)于玉米劍葉的遺傳基礎(chǔ)仍然未知。本研究利用由玉米自交系W22 與玉米野生祖先種大芻草構(gòu)建的包含866 個(gè)家系的滲入系群體，結(jié)合均勻覆蓋玉米全基因組的19 838 個(gè)SNP 分子標(biāo)記，采用R/qtl 的多QTL 模型對玉米劍葉進(jìn)行QTL 定位分析，為克隆玉米劍葉相關(guān)基因和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考依據(jù)。

Cantrell 等[3]在3 個(gè)不同環(huán)境下完全去除4 個(gè)不同玉米材料的劍葉，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)玉米材料產(chǎn)量的平均降幅為2.6%，表明玉米劍葉對維持玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要作用。本研究對玉米劍葉與粒長、粒寬、粒厚、百粒重、株高、穗位高、莖長、莖粗、種子出苗率、葉綠素含量等性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，劍葉與粒寬、粒厚和百粒重等產(chǎn)量性狀呈顯著負(fù)相關(guān)，而與株高、穗位高、莖長和葉綠素含量等性狀呈顯著正相關(guān)，但與粒長、莖粗和種子出苗率等性狀呈不顯著正相關(guān)，結(jié)果表明玉米劍葉與玉米產(chǎn)量性狀呈負(fù)相關(guān)，這與Cantrell 等[3]研究結(jié)果相反，可能主要有以下兩方面的原因，首先玉米產(chǎn)量是復(fù)雜的數(shù)量性狀，由單位面積有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和百粒重等3 個(gè)因素構(gòu)成，本研究只分析了劍葉與百粒重等籽粒性狀的相關(guān)性，沒有分析劍葉與單位面積有效穗數(shù)和穗粒數(shù)的相關(guān)性，可能是造成結(jié)果不同的主要原因；其次是Cantrell 等[3]的研究利用了6 個(gè)不同的玉米材料，但僅有其中的4 個(gè)玉米材料在完全去除劍葉的條件下顯著降低了玉米產(chǎn)量，而其他2 個(gè)玉米材料則對產(chǎn)量無顯著影響，表明不同遺傳背景的玉米材料對分析玉米劍葉與產(chǎn)量的相關(guān)性影響較大，這可能是造成結(jié)果不同的另一個(gè)重要原因。

數(shù)量性狀呈連續(xù)性變異，由多基因控制并易受環(huán)境影響。數(shù)量性狀的遺傳結(jié)構(gòu)特征一般可以分為以下3 種類型[21]，由少數(shù)主效基因控制、由1 個(gè)主效基因與多個(gè)微效基因控制和由多個(gè)微效基因控制。本研究共檢測到9 個(gè)控制玉米劍葉的QTL，總共可以解釋30.94%的表型變異。單個(gè)QTL 的表型貢獻(xiàn)率變幅為1.76%～11.51%，加性效應(yīng)的變幅為-0.03～0.12。檢測到的9 個(gè)QTL 中僅有qFL3-1的表型貢獻(xiàn)率（11.51%）大于10%，其余8 個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率均小于5%，表明該群體中玉米劍葉的遺傳結(jié)構(gòu)是由1 個(gè)主效基因加多個(gè)微效基因控制。qFL3-1是本研究唯一檢測到的控制玉米劍葉的主效QTL，這有利于針對qFL3-1位點(diǎn)開發(fā)緊密連鎖的功能性分子標(biāo)記，并利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)定向改良現(xiàn)代栽培玉米的劍葉性狀。進(jìn)一步對9 個(gè)QTL 的加性效應(yīng)方向進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9 個(gè)QTL 中的7 個(gè)QTL 均來自玉米等位基因降低劍葉表型值，包括qFL3-1位點(diǎn)，表明劍葉在玉米長期馴化和改良過程中可能受到定向選擇，這也與大部分現(xiàn)代栽培玉米不具有劍葉的現(xiàn)象一致。

根據(jù)玉米B73 參考基因組（RefGen_V4）信息，在qFL3-1位點(diǎn)置信區(qū)間內(nèi)共檢索到31 個(gè)注釋基因。進(jìn)一步利用玉米在線數(shù)據(jù)庫分析31 個(gè)基因在玉米苞葉、根、莖、成熟葉、未成熟葉、莖尖分生組織、花絲、種子、幼嫩的雌穗和幼嫩的雄穗等10個(gè)不同組織器官中表達(dá)特異性，發(fā)現(xiàn)31 個(gè)基因中僅有5 個(gè)基因特異性地在玉米苞葉中高表達(dá)，分別是編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的Zm00001d042099和Zm00001d042104，編碼吡咯啉-5-羧酸還原酶的Zm00001d042117，編碼氨基酸通透酶的Zm00001d042134和Zm00001d042135。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是植物體內(nèi)普遍存在的一類多功能蛋白，在植物生長發(fā)育、次生代謝以及應(yīng)對生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[22]。吡咯啉-5-羧酸還原酶是植物體內(nèi)脯氨酸最后合成的關(guān)鍵酶[23]。研究[24-26]表明，植物體內(nèi)游離脯氨酸除了響應(yīng)生物和非生物逆境脅迫外，還可以調(diào)控植物發(fā)育、開花和繁殖等過程。氨基酸通透酶參與植物體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)并在調(diào)控植物生理過程中具有重要作用[27]。

4 結(jié)論

利用866 份玉米-大芻草滲入系材料結(jié)合19 838 個(gè)SNP 分子標(biāo)記，對玉米劍葉進(jìn)行了高精度的QTL 定位分析，共檢測到9 個(gè)控制玉米劍葉的QTL，單個(gè)QTL 的表型貢獻(xiàn)率變幅為1.76%～11.51%，表明玉米劍葉屬于典型的由多基因控制的數(shù)量性狀。玉米劍葉與株高、穗位高、莖長和葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，與百粒重、粒寬和粒厚呈顯著負(fù)相關(guān)，表明劍葉與玉米其他重要性狀之間呈現(xiàn)復(fù)雜的相互關(guān)系，共同構(gòu)成了玉米植株的表型特征。進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對最大效應(yīng)QTL（qFL3-1）進(jìn)行候選基因挖掘，篩選出Zm00001d042099、Zm00001d042104、Zm00001d042117、Zm00001d042134和Zm00001d042135這5 個(gè)候選基因。