基于礦質(zhì)元素指紋的蕎麥產(chǎn)地溯源研究

張玉芬 齊景凱 王桂玲 趙寶平 周磊

（1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，028043，內(nèi)蒙古通遼；2 扎蘭屯市綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，162650，內(nèi)蒙古扎蘭屯；3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，010019，內(nèi)蒙古呼和浩特；4 內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，028043，內(nèi)蒙古通遼）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench.）是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）一年生植物，又名凈腸草、烏麥或三角麥[1-2]。蕎麥營養(yǎng)全面，含有豐富的維生素、氨基酸、膳食纖維和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含生物類黃酮、糖醇和D-手性肌醇等高活性藥用成分，具有消炎、降脂、降糖、降膽固醇、抗氧化、抗衰老和清除自由基的功能[3-4]，是良好的藥食同源作物。不同產(chǎn)地蕎麥微量元素和活性成分不同，有研究[5]表明，內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗蕎麥中鈣含量是內(nèi)蒙古包頭市固陽縣蕎麥中鈣含量的2.12 倍，而包頭市固陽縣蕎麥中銫含量是庫倫旗的4.35 倍。目前對蕎麥的研究多集中在通過對有機(jī)活性成分如蛋白質(zhì)、氨基酸、總黃酮、蘆丁等的測定[6-7]來判定產(chǎn)地來源，但生物有機(jī)活性成分受儲藏時(shí)間的影響較大，而生物礦質(zhì)元素不能自身合成，必須從外界環(huán)境中獲得，且一旦獲得就不受儲藏條件等外界因素的影響，因而礦質(zhì)元素建立的指紋圖譜更能真實(shí)、穩(wěn)定反映農(nóng)產(chǎn)品的地理信息。礦質(zhì)元素指紋分析在中藥材中應(yīng)用廣泛[8-10]。馮利芳等[5]對內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)蕎麥中27 種礦物質(zhì)元素進(jìn)行了測定和特征分析；Zhang 等[11]對內(nèi)蒙古、山西和陜西3 個(gè)產(chǎn)區(qū)蕎麥中礦質(zhì)元素、氨基酸和維生素進(jìn)行了多元溯源分析。逐步判別分析被成功應(yīng)用于所建立的中藥材礦質(zhì)元素指紋圖譜判斷產(chǎn)地來源的最佳判別變量，留一法交叉驗(yàn)證的正確判別率也很高[12-14]。

因此，本研究采用微波消解原子吸收法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS 法）同時(shí)測定了吉林、內(nèi)蒙古東部、內(nèi)蒙古西部、陜西、甘肅、四川、貴州和云南8 個(gè)地區(qū)所產(chǎn)蕎麥中的常量元素鈉（Na）、鎂（Mg）、鉀（K）、鈣（Ca），微量元素：釩（V）、鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鈷（Co）、鎳（Ni）、銅Cu）、鋅（Zn）、硒（Se）、鍶（Sr）、銣（Rb）、銫（Cs）、鋇（Ba）和有害元素砷（As）、鎘（Cd）和鉛（Pb）的含量，并采用相關(guān)性分析、顯著性分析和主成分分析篩選出影響蕎麥產(chǎn)地的主要礦質(zhì)元素；經(jīng)聚類分析和判別分析對不同產(chǎn)地蕎麥進(jìn)行分類；經(jīng)交叉檢驗(yàn)和回代檢驗(yàn)進(jìn)行蕎麥產(chǎn)地的驗(yàn)證，為蕎麥產(chǎn)地鑒別提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為60 份蕎麥樣品，其中通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的10 份產(chǎn)自內(nèi)蒙古通遼市（東部）（編號1～10），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的10 份產(chǎn)自內(nèi)蒙古西部（編號11～20），吉林白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的8 份產(chǎn)自吉林?。ň幪?1～28），云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的16 份中，6 份產(chǎn)自貴州?。ň幪?9～34）、5 份產(chǎn)自云南?。ň幪?5～39）、5 份產(chǎn)自四川?。ň幪?0～44），其余16 份產(chǎn)自陜西?。ň幪?5～52）和甘肅省（編號53～60），各8 份。因?yàn)閮?nèi)蒙古東、西部地理緯度跨度較大，所以將產(chǎn)自內(nèi)蒙古的蕎麥分為東部和西部進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究。

試劑包括硝酸（優(yōu)級純，65%）和過氧化氫（優(yōu)級純，30%），均購自南京化學(xué)試劑有限公司，標(biāo)準(zhǔn)溶液為10mg/LNa、Mg、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Cd、Cs、Ba、Pb 元素的混合溶液（批號N9300233，PerkinElmer），調(diào)諧液為1μg/L 的Ce、Co、Li、Mg、In、U 混合元素（N814501，PerkinElmer），高純氬氣（純度99.999%，通遼市朗月化工有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器

配備四級桿質(zhì)量過濾器的350Q 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（PerkinElmer）；配有聚四氟乙烯罐的ETHOS UP 型微波輔助萃取系統(tǒng)（Milestone）Milli-Q?型水凈化系統(tǒng)（Millipore）；FA1004N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器公司）；FX101-3 干燥箱（上海一恒公司）；質(zhì)控樣GBW(E)100380（玉米粉中Pb、Cd、As 成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）購自于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.3 測定指標(biāo)與方法

參照GB 5009.91-2017[15]第一法測定蕎麥中常量元素K 和Na；參照GB 5009.92-2016[16]第一法測定蕎麥常量元素Ca；參照GB 5009.241-2017[17]第一法測定蕎麥中常量元素Mg；參照GB 5009.268-2016[18]中第一法測定蕎麥中微量元素V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Cs、Ba、As、Pb、Cd。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行正態(tài)分布分析、相關(guān)性分析、主成分分析、判別分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)曲線和線性范圍

由表1 可知，所有元素的相關(guān)系數(shù)（r）≥0.9991，線性關(guān)系良好；所有被測元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD 值）均未超過3.58%；各元素的回收率在95.37%～104.03%；LOD 為0.02～1.25ng/L，LOQ在0.06～3.75ng/L。

表1 20 種元素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、定量限和檢測限Table 1 Regression equation,correlation coefficient,the average recovery rates,RSD,LOD and LOQ of 20 elements

2.2 蕎麥中礦質(zhì)元素含量特征

表2 表明，不同產(chǎn)地蕎麥中Mg、K、Ca、Fe、Mn、Zn、Ni、Rb、Sr 元素的含量呈正態(tài)分布，其余元素含量不符合正態(tài)分布。蕎麥中常量元素的含量順序是K＞Mg＞Na＞Ca，微量元素含量表現(xiàn)為Mn＞Fe＞Rb＞Zn＞Cu＞Ni＞Sr＞Ba＞Cr＞Co＞Cs＞V＞Se，重金屬元素含量表現(xiàn)為As＞Pb＞Cd。從表2 中可知，Co、V、Pb、Cd 和As 的變異系數(shù)均超過了100%，說明不同產(chǎn)地蕎麥中礦質(zhì)元素含量有較大的差異。

表2 蕎麥中礦質(zhì)元素含量Table 2 Contents of mineral elements in buckwheat

由表3 可知，蕎麥中的Na 與K、Zn、Se、Rb呈極顯著正相關(guān)，與Ni 呈顯著正相關(guān)；Mg 與Cd呈顯著正相關(guān)；Fe 與Mn、Pb 呈極顯著正相關(guān)，與Co 呈顯著相關(guān)，與Cr、V、Rb 呈顯著負(fù)相關(guān)；Mn與Co 呈顯著正相關(guān)，與Rb 呈顯著負(fù)相關(guān)；Cu 與Cd、As 呈顯著正相關(guān)；Zn 與As 呈顯著正相關(guān)，與Se 呈顯著負(fù)相關(guān)；N 與Rb、Cs 呈極顯著正相關(guān)，與Cd 呈顯著負(fù)相關(guān)；Cr 與V、Sr 呈顯著正相關(guān)；Co 與Pb 呈極顯著正相關(guān)，與As 呈顯著正相關(guān)；V 與Sr、Ba 呈極顯著正相關(guān)；Sr 與Ba 呈顯著正相關(guān)；Pb 與As 呈顯著正相關(guān)；Cd 與As 呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說明蕎麥中礦質(zhì)元素之間存在協(xié)同吸收或拮抗抑制作用。

表3 蕎麥不同元素的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of different elements in buckwheat

2.3 不同產(chǎn)地蕎麥中礦質(zhì)元素含量差異比較

Duncan's 多重分析結(jié)果（表4）表明，除元素V 和Cs 以外，其余元素在不同產(chǎn)地均存在顯著性差異。內(nèi)蒙古東部蕎麥中Na、Se 和Rb 含量最高；貴州蕎麥中Fe、Cu 和Zn 含量最高；吉林蕎麥中Co 最高；內(nèi)蒙古西部蕎麥中Mg 含量最高；寧夏蕎麥中Mn 含量最高；陜西蕎麥中Sr 和Ba 含量最高；甘肅蕎麥中Ca、Mn 和Ni 含量最高；云南蕎麥中K 含量最高。不同產(chǎn)地蕎麥均有其特有的礦質(zhì)元素指紋信息。不同產(chǎn)地蕎麥中重金屬含量均有不同程度的超標(biāo)，產(chǎn)自貴州、甘肅和四川的蕎麥中Pb 含量均已超過我國國家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于谷物中Pb 限量的規(guī)定（Pb≤0.2mg/kg）[19]；產(chǎn)自貴州、吉林、內(nèi)蒙古西部區(qū)、陜西和四川的蕎麥中Cd 含量均已超過我國國家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于谷物中Cd 限量的規(guī)定（Cd≤0.1mg/kg）[19]；產(chǎn)自貴州、陜西和四川的蕎麥中As 含量均已超過我國國家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于谷物中As 限量的規(guī)定（As≤0.5mg/kg）[19]；產(chǎn)自貴州和四川的蕎麥中Pb、Cd 和As 均超標(biāo)。

表4 不同產(chǎn)地蕎麥中礦質(zhì)元素含量差異分析Table 4 Difference analysis of mineral elements in buckwheat from different producing areasmg/kg

2.4 礦質(zhì)元素指紋對蕎麥產(chǎn)地的鑒別分析

2.4.1 主成分分析（PCA） 主成分分析是一種多變量統(tǒng)計(jì)方法，是最常用的降維方法之一，通過正交變換將一組可能存在相關(guān)性的變量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量，轉(zhuǎn)換后的變量被稱為主成分；其目的是在“信息”損失較小的前提下，將高維的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換到低維，從而減小計(jì)算量[20]。Duncan's 多重分析結(jié)果（表4）表明，不同產(chǎn)地蕎麥中V 和Cs 元素差異不顯著，剔除無顯著性差異（關(guān)聯(lián)性差）的V 和Cs 元素，將不同產(chǎn)地18 種礦質(zhì)元素進(jìn)行主成分分析（表5），可知影響8 個(gè)不同產(chǎn)地蕎麥中18 種元素的主成分有6 個(gè)，6 個(gè)主成分的特征值均大于2.00，累積方差貢獻(xiàn)率為77.67%，可代表大多數(shù)樣品。根據(jù)載荷占比可知，第1 主成分中Fe、Cu、Zn、Cd、Pb、As 占比較大，與顯著性分析中貴州蕎麥信息相符；第2 主成分中Na、Se、Rb 與顯著性分析中通遼蕎麥信息相符；第3 主成分中V、Sr、Ba 與顯著性分析中陜西蕎麥信息相符；第4 主成分中K、Ca 和Ni占比較大，與顯著性分析中云南和甘肅蕎麥信息相符；Mn 和Cr 在第5 主成分中載荷較大，與顯著性分析中甘肅和四川蕎麥信息相符；Co 在第6主成分中載荷較大，與顯著性分析中吉林蕎麥信息相符。因此，不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律。為便于直觀分析，提取前2 個(gè)主成分得分繪制散點(diǎn)圖（圖1），其中第1 主成分占26.27%，第2 主成分占15.80%。

圖1 不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素含量的主成分分析Fig.1 PCA of mineral element content of buckwheat from different producing areas

表5 蕎麥中礦質(zhì)元素含量的主成分分析Table 5 Principal component analysis of mineral elements in buckwheat

2.4.2 不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素的線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA） PCA 是無監(jiān)督的，降低了維數(shù)并將信息損失降到最低，用主要的特征代替其他相關(guān)的非主要特征，但映射時(shí)沒有利用任何數(shù)據(jù)內(nèi)部的分類信息，在分類上變得更加困難；而線性判別分析（LDA）實(shí)現(xiàn)了映射時(shí)低維數(shù)上的類間分開、類內(nèi)集中[21]，常用的LDA 是Fisher 線性判別分析。因此，采用Fisher 線性判別函數(shù)對60 個(gè)蕎麥品種進(jìn)行分類分析，由圖2 可知，不同產(chǎn)地蕎麥Fisher 線性判別函數(shù)圖的分布不同，其中吉林、內(nèi)蒙古東部、內(nèi)蒙古西部和四川所產(chǎn)蕎麥的分布是獨(dú)立的，沒有與其他省區(qū)所產(chǎn)蕎麥交叉，而甘肅和陜西所產(chǎn)蕎麥有交叉，云南和貴州所產(chǎn)蕎麥有交叉。

圖2 不同產(chǎn)地蕎麥的Fisher 判別函數(shù)圖Fig.2 Fisher discriminant function of buckwheat from different producing areas

對蕎麥中存在顯著性差異的20 種礦質(zhì)元素進(jìn)行逐步判別分析（stestepwise linear discriminant analysis，SLDA），以進(jìn)一步了解礦質(zhì)元素指紋對蕎麥產(chǎn)地的判別效果，并采用交叉驗(yàn)證進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果（表6）表明，回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證正確判別率分別為98.3%和93.3%。

表6 不同產(chǎn)地蕎麥逐步判別分析驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Validation results of stepwise discriminant analysis of buckwheat from different producing areas

2.4.3 聚類分析 為進(jìn)一步直觀讀出各樣品的所屬分類，對60 個(gè)蕎麥樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。由圖3 可知，內(nèi)蒙古東部和吉林所產(chǎn)蕎麥被劃分為一類，內(nèi)蒙古西部、甘肅、陜西、四川、貴州和云南蕎麥被劃分為一類。有2 個(gè)樣品被判錯(cuò)，陜西的4號樣品被錯(cuò)判給甘肅，云南的5 號樣品被錯(cuò)判給四川，準(zhǔn)確率達(dá)96.67%。可見，礦質(zhì)元素指紋結(jié)合聚類分析可以有效地對蕎麥產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。

圖3 不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素含量的系統(tǒng)聚類分析Fig.3 Systematic cluster analysis of mineral elements in buckwheat from different producing areas

3 討論

許多研究表明蕎麥含有豐富的礦質(zhì)元素，礦質(zhì)元素對人體起著重要的作用。如Cr 促進(jìn)胰島素分泌、增強(qiáng)胰島素活性，起到防治糖尿病的功效[22]，V 促進(jìn)動物的生長發(fā)育、增強(qiáng)鐵對紅細(xì)胞的再生作用、抑制膽固醇的合成，具有腎功能調(diào)整作用、類胰島素樣作用、骨骼和牙齒鈣化作用等[23]。本研究測定了8 個(gè)地區(qū)的60 份蕎麥樣品中礦質(zhì)元素含量，含量變化趨勢表現(xiàn)為K＞Mg＞Na＞Ca＞Mn＞Fe＞Rb＞Zn＞Cu＞Ni＞Sr＞Ba＞Cr＞Co＞Cs＞V＞Se＞As＞Pb＞Cd；不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素含量差異較大，其中內(nèi)蒙古東部蕎麥中Na、Se 和Rb 含量最高，貴州蕎麥中Fe、Cu 和Zn 含量最高，吉林蕎麥中Co 含量最高，內(nèi)蒙古西部蕎麥中Mg 含量最高，寧夏蕎麥中Mn 含量最高，陜西蕎麥中Sr和Ba 含量最高，甘肅蕎麥中Ca、Mn 和Ni 含量最高，云南蕎麥中K 含量最高，表明不同產(chǎn)地蕎麥擁有特有的礦質(zhì)元素指紋信息。

蕎麥礦質(zhì)元素含量可能與土壤類型有關(guān)，本研究中吉林、內(nèi)蒙古東部、內(nèi)蒙古西部所產(chǎn)蕎麥中Mn 含量相當(dāng)，吉林和內(nèi)蒙古東部主要土壤類型是黑鈣土、草甸土和風(fēng)沙土，內(nèi)蒙古西部主要是潮土、栗鈣土和草甸土；四川、貴州和云南中Ca 和Mn的含量相當(dāng)，四川主要土壤類型是赤紅壤、紅壤和黃壤，云南主要是赤紅壤、黃壤和紅壤，貴州主要是黃壤、紅壤和石灰土。

相關(guān)性分析表明，蕎麥中礦質(zhì)元素存在協(xié)同吸收和拮抗抑制作用。不同產(chǎn)地蕎麥樣品中僅V 和Cs 的平均含量無顯著性差異，說明蕎麥中V 和Cs含量與產(chǎn)地關(guān)聯(lián)性較差，不同產(chǎn)地蕎麥中礦質(zhì)元素的主成分分析進(jìn)一步表明不同產(chǎn)地蕎麥礦質(zhì)元素分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律，

植物生長地區(qū)的經(jīng)緯度、海拔、光照和溫濕度等環(huán)境因子也是影響植物礦質(zhì)元素的主要因素。顧志榮[24]研究表明，經(jīng)度、緯度和海拔等地理位置是影響當(dāng)歸藥材中無機(jī)元素含量的主要因素，當(dāng)歸中Fe、Mn、Mg、Na、K、Cu 含量隨著海拔的升高而升高，海拔是當(dāng)歸中Zn、Ca、Pb、Cd、As、Cr、Sb、Ni 含量的限制因素；經(jīng)度是Fe、Mg、Ca、Na、K、As、Cu、Cr、Sb、Ni 含量的主要因素，是影響當(dāng)歸中Zn、Mn、Pb、Cd 含量的限制因素；緯度是影響Zn、K、Cu、Cr、Sb 含量的主要因素，是影響當(dāng)歸中Fe、Mn、Mg、Ca、Na、Pb、Cd、As、Ni 的限制因素。本研究中陜西、甘肅和四川蕎麥中Na 含量相當(dāng)，原因在于它們的地理位置比較近；甘肅、四川、云南和貴州Rb 含量相當(dāng)，也是它們的地理位置比較接近所致。潘美娜[25]研究表明，光質(zhì)不僅影響藍(lán)莓幼苗礦質(zhì)元素的積累，也影響礦質(zhì)元素在藍(lán)莓幼苗中的分配，在紅藍(lán)光質(zhì)中添加綠光能顯著促進(jìn)藍(lán)莓幼苗地上部礦質(zhì)元素P、K、Ca 和Fe 的積累，但抑制了藍(lán)莓地上部Zn 的累積，紅藍(lán)光增加了N、Na 和Zn 在藍(lán)莓葉片的分布，增加了K、Mg、Ca、P、Fe、Mn 和Cu 在根和莖的分布。

此外，Qian 等[26]研究表明，化肥對Fe、Co、Ni、Se、Rh、Eu、Pr、Tl 和Pt 元素含量有顯著影響，農(nóng)藥對Al、Co 和Ni 元素含量影響顯著。Zhao等[27]研究表明，Sr、Ba 和Na 是谷物、馬鈴薯和豆類3 種作物中地理溯源的良好指標(biāo)。Wang 等[28]研究表明，Na、Cr、Rb、Sr、Mo、Cs、Ba 和Pb 可以作為玉米產(chǎn)地鑒別的特征指標(biāo)，通過交叉驗(yàn)證獲得了92.2%的正確率。本研究采用Rb、Sr、Co、Ba 和Cr 作為蕎麥產(chǎn)地溯源的穩(wěn)定有效指標(biāo)。

4 結(jié)論

聚類分析和判別分析結(jié)合礦質(zhì)元素指紋可以實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地蕎麥的分類。利用逐步判別分析篩選出Rb、Sr、Co、Ba 和Cr 5 種元素作為鑒別不同產(chǎn)地蕎麥的有效指標(biāo)，其中吉林省Co 含量、四川省Cr 含量、內(nèi)蒙古東部Rb 含量、陜西省Sr 和Ba 含量最高。經(jīng)交叉驗(yàn)證檢驗(yàn)和回代檢驗(yàn)驗(yàn)證，蕎麥產(chǎn)地的正確判別率分別是93.3%和98.3%，表明礦質(zhì)元素指紋分析對蕎麥產(chǎn)地溯源研究是可行的。