圍產(chǎn)期相關(guān)激素對奶牛中性粒細(xì)胞功能調(diào)控及其與免疫抑制的相關(guān)性分析

賀顯晶，郭東華，連帥，武瑞，王建發(fā)

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.佳木斯大學(xué)）

中性粒細(xì)胞（Poly-morphonuclear Neutrophils，PMNs）是機體抵抗病原體侵入的重要防線，在奶牛乳腺、子宮、肺臟等組織天然免疫反應(yīng)過程中具有重要防御作用。乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎是奶牛最常見的由病原菌感染導(dǎo)致的炎癥疾病。發(fā)生感染時，細(xì)菌表面的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）可以作為配體被靶組織上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs），如Toll 樣受體（Toll like receptors，TLRs）等所識別，上調(diào)核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的DNA 結(jié)合活性，提高炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥部位的聚集、黏附和移行[1-4]。一般情況下，中性粒細(xì)胞進(jìn)入乳腺腺泡腔、子宮腔或肺泡腔后，可通過吞噬作用、呼吸爆發(fā)和形成胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular traps，NETs）來殺滅病原菌，并轉(zhuǎn)歸凋亡，保障奶牛健康[5]?？梢姡行粤＜?xì)胞在奶牛乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎等炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有不可替代的關(guān)鍵作用。

圍產(chǎn)期奶牛要經(jīng)歷妊娠、分娩和泌乳等生理過程，激素分泌模式和營養(yǎng)代謝模式均發(fā)生劇烈變化，可導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛先天性和獲得性免疫功能顯著降低[6]。其中，中性粒細(xì)胞天然免疫功能低下是導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛乳房炎、子宮炎等疾病高發(fā)的重要原因[7]。在奶牛中性粒細(xì)胞天然免疫功能低下致病因素方面，圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)代謝模式的改變?nèi)绺咧Y、低鈣血癥、高酮血癥等對中性粒細(xì)胞功能表型的影響關(guān)注度較高。由于圍產(chǎn)期奶牛生殖激素（雌二醇等）、應(yīng)激激素（皮質(zhì)醇等）、泌乳激素（催乳素等）、代謝激素（胰高血糖素等）等變化明顯，這些激素是否對中性粒細(xì)胞功能表型有調(diào)控作用及相關(guān)作用途徑尚未完全明確。因此，深入揭示圍產(chǎn)期相關(guān)激素在中性粒細(xì)胞活化、趨化黏附、跨膜遷移、呼吸爆發(fā)、吞噬殺菌和胞外誘捕網(wǎng)形成等不同功能中發(fā)揮重要的作用，將為全面認(rèn)識圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制的形成機制、有效保障圍產(chǎn)期奶牛健康提供研究基礎(chǔ)和決策參考，對保障畜牧養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要的科學(xué)價值和應(yīng)用前景。

1 奶牛體內(nèi)中性粒細(xì)胞生物功能及其調(diào)控因素研究進(jìn)展

當(dāng)病原微生物入侵奶牛機體靶組織時，中性粒細(xì)胞向感染部位遷移，其募集過程主要分為活化、滾動、黏附、變形和移出等步驟（表1）[1-4]。中性粒細(xì)胞進(jìn)入奶牛乳腺腺泡腔/子宮腔/肺泡腔后，可通過吞噬作用、呼吸爆發(fā)和形成胞外誘捕網(wǎng)來殺滅病原菌[2-4]。中性粒細(xì)胞跨血管內(nèi)皮細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞/子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞/肺泡上皮細(xì)胞遷移功能、胞外誘捕網(wǎng)形成功能、對病原菌的吞噬活性和呼吸爆發(fā)功能決定了奶牛乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎等奶牛炎癥性疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸。中性粒細(xì)胞活化、趨化黏附和跨膜遷移功能調(diào)控因素相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用氯膦酸脂質(zhì)體（一種巨噬細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物）耗竭小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，再向其乳腺中灌注脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）不能引起中性粒細(xì)胞向乳腺腺泡遷移；向敲除TNF-α 或IL-1β 受體基因的小鼠乳腺內(nèi)灌注LPS 也不能引起中性粒細(xì)胞向乳腺腺泡遷移；但向血液中或乳腺組織內(nèi)預(yù)先負(fù)載外源野生型小鼠巨噬細(xì)胞，LPS 可重新誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向乳腺腺泡遷移[8]?？梢?，巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子在調(diào)控中性粒細(xì)胞定向遷移過程中發(fā)揮了重要的活化作用。中性粒細(xì)胞趨化過程主要受趨化分子8（CXCL8）、補體C5a、白三烯B4（Leukotriene B4，LTB4）、血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）等調(diào)控[2]。L-選擇素又稱CD62L，其表達(dá)升高或脫落可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮中的滾動；β2-整合素又稱CD11b/CD18，可與細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）結(jié)合，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的緊密黏附過程；血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule -1，PECAM-1）主要表達(dá)于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面，可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的移出[9]。向隱性乳房炎患病牛乳腺內(nèi)灌注重組牛粒細(xì)胞集落刺激因子，可降低中性粒細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)水平，進(jìn)而降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)[9]。同時，激光輻照大鼠乳腺后可改變毛細(xì)血管血液流變學(xué)特征，減少中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而降低乳腺腺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量[10]。所以，中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮/上皮遷移過程也受上述黏附分子調(diào)控。

中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)、吞噬殺菌和NETs 形成調(diào)控因素相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)動物遭受細(xì)菌感染后，中性粒細(xì)胞表面的Fc 受體和C3b 可以識別并結(jié)合包裹在細(xì)菌表面的抗體或補體，使細(xì)菌黏附在中性粒細(xì)胞上，之后中性粒細(xì)胞伸出偽足包裹細(xì)菌并形成吞噬體，吞噬體進(jìn)入中性粒細(xì)胞內(nèi)部后與初級溶酶體融合，形成吞噬溶酶體[4]。進(jìn)入吞噬溶酶體的細(xì)菌主要被具有活性的氧化代謝產(chǎn)物殺傷（呼吸爆發(fā)），在此過程中髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基。氧自由基、次氯酸鹽可通過氧化細(xì)菌菌體蛋白、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁來殺滅細(xì)菌[11]。NETs 由DNA 纖維網(wǎng)、組蛋白和顆粒蛋白構(gòu)成，其形成需要依賴于肽?；彼崦搧啺访?（Peptidylarginine deiminases 4，PAD4），PAD4 一旦活化，細(xì)胞內(nèi)組蛋白即可轉(zhuǎn)變成瓜氨酸化組蛋白，使染色質(zhì)解螺旋形成疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[11]。此外，應(yīng)用NADPH 氧化酶抑制劑二聯(lián)苯碘及NADPH 缺陷小鼠開展研究證實活性氧在NETs 形成中具有重要作用[3，11]。可見，影響中性粒細(xì)胞吞噬作用、呼吸爆發(fā)和NETs 形成的關(guān)鍵因素分別是Fc 受體和補體C3b 表達(dá)水平、MPO 活性和PAD4 活性。

中性粒細(xì)胞凋亡在炎癥反應(yīng)消退過程中起到重要作用，PMN 凋亡對奶牛乳腺健康十分重要，延緩中性粒細(xì)胞凋亡對乳腺感染的早期有利，而中性粒細(xì)胞凋亡的加速又有助于病原體的清除，同時，活化的PMN 及產(chǎn)物對奶牛乳腺組織產(chǎn)生損傷。正常生理條件下，奶牛中性粒細(xì)胞具有相對較短的半衰期和自發(fā)承受細(xì)胞凋亡的能力，同時奶牛中性粒細(xì)胞凋亡受泌乳階段的影響，泌乳早期較泌乳中期奶牛中性粒細(xì)胞有更高的細(xì)胞凋亡[12]。奶牛乳腺感染后，病原微生物產(chǎn)物及促炎性細(xì)胞因子對中性粒細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)或延緩作用，如IL-1β，IL-6，IL-8 等細(xì)胞因子對炎癥具有正調(diào)節(jié)作用，能延長中性粒細(xì)胞生存期[13-14]。如TNF-α 等能誘導(dǎo)牛中性粒細(xì)胞凋亡。LPS、白細(xì)胞毒素及溶血素等細(xì)菌產(chǎn)物在一定程度上能抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。

2 圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞天然免疫功能低下發(fā)生因素研究進(jìn)展

關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞天然免疫功能的研究較多，但研究結(jié)論不盡一致。有研究指出，圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞天然免疫功能變化主要表現(xiàn)為MPO活性、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、趨化活性、跨膜遷移和吞噬功能減弱[2，15]。但也有研究報道，圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞趨化活性未見明顯改變，吞噬功能增強[16]。此外，多項關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞氧自由基（Reactive oxygen species，ROS） 產(chǎn)生、PRRs 表達(dá)、促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的研究報道也存在結(jié)論不一致的現(xiàn)象[2]。因此，有必要全面系統(tǒng)的檢測圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞功能表型及其生物標(biāo)志分子變化情況，完整描述圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞功能特征變化。

營養(yǎng)代謝模式和激素分泌模式變化是導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞天然免疫功能低下的重要因素[2，12]。圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)代謝模式變化主要包括高酮血癥、高脂血癥、低鈣血癥和低血糖癥[2，17-19]。圍產(chǎn)期奶牛，特別是產(chǎn)后奶牛由于泌乳量增加，而干物質(zhì)攝入量受生殖激素影響卻不能同步提高，導(dǎo)致機體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。處于能量負(fù)平衡狀態(tài)的圍產(chǎn)期奶牛，為緩解能量負(fù)平衡，其體內(nèi)脂肪組織動員增加。Zerbe 等[20]在研究圍產(chǎn)期奶牛肝臟三酰甘油的含量與PMN 的免疫功能之間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)提高產(chǎn)后第1 周和第2 周肝臟三酰甘油的含量與來自血液和子宮的PMN 功能降低有關(guān)。通過調(diào)查圍產(chǎn)期奶牛外周血中性粒細(xì)胞功能、能量狀態(tài)和子宮健康之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：圍產(chǎn)期奶牛子宮健康與血液中性粒細(xì)胞功能和能量平衡直接相關(guān)，中性粒細(xì)胞功能受損和能量負(fù)平衡的發(fā)生多見于奶牛分娩或子宮炎癥性疾病前[21]。奶牛血液中β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHBA）濃度升高可減弱中性粒細(xì)胞趨化、呼吸爆發(fā)、吞噬和NETs 形成功能[2，22]；但也有研究指出，改變血液中BHBA 濃度后，奶牛中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能未受影響[2]。血液中非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid，NEFA）濃度升高奶牛中性粒細(xì)胞MPO活性降低，中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的呼吸爆發(fā)功能下降，趨化功能和吞噬功能呈增強的趨勢[16]。體外研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的NEFA 能提高中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，超生理高濃度的NEFA 可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞壞死，但對中性粒細(xì)胞凋亡水平和吞噬功能無影響[2]。高濃度的NEFAs 和BHBA 能上調(diào)中性粒細(xì)胞TLR2 和TLR4，激活NF-κB 信號通路，促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的合成和釋放，引起奶牛中性粒細(xì)胞炎性損傷，從而導(dǎo)致酮病奶牛免疫功能低下[23]。

圍產(chǎn)期奶牛高脂血癥和高酮血癥頻發(fā)，高脂血癥和高酮血癥均可以引起圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛炎癥性疾病高發(fā)。酮病奶牛的高酮血癥能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs 的形成，其中BHBA 通過GPR109A-mTOR 信號通路誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞自噬，繼而調(diào)節(jié)NETs 產(chǎn)生，且BHBA 誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞NETs 不依賴于ROS。同時，高濃度的BHBA 通過PKC-MLC2 信號傳導(dǎo)的激活抑制中性粒細(xì)胞遷移[22]。鈣離子在免疫細(xì)胞分化、生長、激活中具有重要作用，被稱為“啟動免疫系統(tǒng)的開關(guān)”[24]，低鈣血癥患牛中性粒細(xì)胞比例降低，其趨化、遷移、黏附吞噬功能和呼吸爆發(fā)等功能降低[15，25]，線粒體損傷，進(jìn)而引起ROS 含量下降，進(jìn)一步加劇奶牛中性粒細(xì)胞損傷[26]。低鈣血癥患病牛中性粒細(xì)胞表面ORAⅠ1降低，引起中性粒細(xì)胞不能攝取鈣離子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞功能受損，血漿中PTH 和1，25（OH）2D3可以通過影響ORAⅠ1 表達(dá)參與調(diào)控中性粒細(xì)胞活性[27，28]。單純的血糖降低對奶牛中性粒細(xì)胞功能影響較小，但泌乳早期奶牛補充葡萄糖可以緩慢提高中性粒細(xì)胞吞噬功能和溶菌酶表達(dá)水平，而對其趨化功能、腫瘤壞死因子-α 表達(dá)水平和細(xì)胞結(jié)構(gòu)無顯著影響[19，29]。由此可見，圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)代謝模式變化對中性粒細(xì)胞功能表型的影響及作用機制研究已成為國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點問題。

3 圍產(chǎn)期相關(guān)激素對奶牛中性粒細(xì)胞生物功能調(diào)控研究進(jìn)展

圍產(chǎn)期是奶牛生產(chǎn)周期中的一個特殊又重要的生理時期，據(jù)報道乳熱、真胃變位、脂肪肝綜合征和酮病等代謝紊亂性疾病，乳腺炎和乳房水腫等乳腺感染性疾病和難產(chǎn)、胎盤不下和子宮感染等生殖障礙性疾病在高產(chǎn)奶牛中發(fā)病率分別為7.8%～16.8%，2.8%～12.6%和6.7%～19.2%。因此，圍產(chǎn)期奶牛因免疫抑制而引起的亞急性炎癥疾病已經(jīng)給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，深入開展其致病機理的研究具有重要的現(xiàn)實意義。圍產(chǎn)期奶牛的各種生理活動引起多種激素濃度變化。在妊娠大部分時期，激素分泌水平處于平穩(wěn)狀態(tài)，直到妊娠后期，激素分泌水平發(fā)生劇烈的變化以期應(yīng)對分娩及泌乳等重要生理活動，激素分泌模式的劇烈變化對圍產(chǎn)期奶牛生殖活動和代謝過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。圍產(chǎn)期的奶牛激素分泌模式變化主要包括生殖激素分泌水平改變（雌二醇在分娩后迅速升高、孕酮迅速降低）、應(yīng)激激素分泌水平改變（皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素在分娩時迅速升高）、泌乳激素分泌水平改變（催乳素、生長激素在泌乳初期迅速升高，甲狀腺素在分娩前下降分娩后升高）和代謝激素分泌水平改變（胰高血糖素、胰島素在分娩前迅速降低）[2，15，17，29-30]。雌二醇和孕酮是奶牛發(fā)育和生殖階段最主要的生殖激素，對奶牛妊娠和維持妊娠具有重要作用。早期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺的免疫功能受生殖激素調(diào)控，雌二醇和孕酮對非特異免疫具有調(diào)節(jié)作用[31]。Abid[32]發(fā)現(xiàn)雌二醇處理去卵巢雌性小鼠后，小鼠血液中性粒細(xì)胞的氧化爆發(fā)功能增強，且接種銅綠假單胞菌后小鼠死亡率降低。同時，經(jīng)雌二醇處理感染化膿桿菌的卵巢切除奶牛無子宮炎的發(fā)生，而經(jīng)黃體酮處理后奶牛仍然有不同程度的炎癥[33]。體外研究顯示，雌二醇對中性粒細(xì)胞跨上皮遷移能力具有抑制作用，對中性粒細(xì)胞NETs形成具有促進(jìn)作用，推測其可能途徑是雌二醇與奶牛血液中中性粒細(xì)胞的ER 受體結(jié)合引起[34-35]。孕酮對中性粒細(xì)胞的跨上皮遷移能力具有促進(jìn)作用，對奶牛中性粒細(xì)胞形成NETs 無影響；而催乳素對中性粒細(xì)胞趨化功能具有抑制作用，催乳素和胰島素體外對PMN 遷移功能無調(diào)控作用[36]。同時圍產(chǎn)期奶牛疾病易感性與奶牛免疫抑制有關(guān)，奶牛產(chǎn)后中性粒細(xì)胞功能降低是導(dǎo)致免疫抑制的誘發(fā)因素，圍產(chǎn)期激素如雌二醇等的劇烈變化可能是導(dǎo)致奶牛圍產(chǎn)期疾病易發(fā)的原因[37]。因此，正確認(rèn)識圍產(chǎn)期激素分泌波動變化和奶牛中性粒細(xì)胞功能的關(guān)系對防控奶牛炎癥性疾病具有重要意義。

圍產(chǎn)期奶牛激素分泌模式通過在體實驗和體外實驗影響中性粒細(xì)胞趨化、遷移、呼吸爆發(fā)等生物學(xué)功能。在體研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇可以降低奶牛中性粒細(xì)胞趨化功能和遷移活性，但不影響其呼吸爆發(fā)功能[2]；孕酮對奶牛中性粒細(xì)胞趨化功能、遷移活性和呼吸爆發(fā)功能均無明顯影響[2]；血清皮質(zhì)醇濃度與奶牛中性粒細(xì)胞Fas 基因表達(dá)水平下降存在關(guān)聯(lián)性[37]；體外研究發(fā)現(xiàn)，胰島素不具有調(diào)控奶牛中性粒細(xì)胞生物功能的作用，但2，4-噻唑啉二酮（TZD，一種II 型糖尿病治療藥物）可以調(diào)控奶牛中性粒細(xì)胞超氧化物陰離子生成量、抑制ROS 生成，但對其吞噬功能和NETs 形成能力無明顯影響[33，38]。促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）在藥理學(xué)濃度或生理學(xué)濃度下，能夠引起從乳汁中分離出來的PMN 對金黃色葡萄球菌的吞噬活性降低[39]。除此以外，其它圍產(chǎn)期相關(guān)激素對奶牛中性粒細(xì)胞其它功能表型的影響及作用途徑尚需進(jìn)一步明確。

4 展望

圍產(chǎn)期作為奶牛疾病的高發(fā)期，高酮血癥、高脂血癥、低鈣血癥、低血糖癥等營養(yǎng)代謝模式改變直接導(dǎo)致奶牛血液中性粒細(xì)胞天然免疫功能低下，進(jìn)而引起奶牛易患奶牛乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎等炎癥性疾病，以往研究多關(guān)注于營養(yǎng)水平對中性粒細(xì)胞功能表型的影響及作用機制研究，并已取得一系列重要進(jìn)展。妊娠末期，奶牛生殖相關(guān)激素分泌模式變化明顯，哪些激素通過何種途徑影響了中性粒細(xì)胞的哪類生物功能尚未得到明確闡述。圍繞這一科學(xué)問題，明確圍產(chǎn)期相關(guān)激素對中性粒細(xì)胞不同功能表型的影響及相關(guān)調(diào)控機制，將為全面認(rèn)識圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制的形成機制、有效保障圍產(chǎn)期奶牛健康提供研究基礎(chǔ)和決策參考。