車前草總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗腹瀉活性的研究

李璐，邢曉旭，朱慶賀，王俊，李梓健，趙飛宇，趙鵬宇，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

腹瀉是一種由多種非感染或感染類因素引起的胃腸道疾病，其特征為頻繁水樣便和腹痛，甚至死亡[1]。腹瀉也是全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的嚴(yán)重問題之一，據(jù)報(bào)道，每年死于腹瀉的仔豬比例超過50%，已經(jīng)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。目前，對(duì)于腹瀉的治療并沒有特效藥進(jìn)行治療，臨床多以抗生素并加以補(bǔ)液治療，然而，隨著細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)問題不斷出現(xiàn)，對(duì)治療腹瀉的效果并不顯著，加上“減抗替抗”等相關(guān)政策的實(shí)施，尋找新型、安全、高效的天然抗腹瀉藥物對(duì)預(yù)防、控制動(dòng)物腹瀉的發(fā)生以及降低畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

車前草（Plantago asiatica L），為車前科（Plantaginaceae）車前屬（Plantago）植物，種子和整株草都可以作為藥物對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行治療，是一種中國(guó)傳統(tǒng)中草藥，該植物在亞洲大部分地區(qū)都有分布[3-4]。車前草（車前屬）在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛使用，其中一些也被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所接受。車前草富含多種活性成分，這些成分有助于發(fā)揮特定的治療作用[5]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)車前草是一種有效的傷口愈合劑，同時(shí)也是一種抗?jié)?、抗糖尿病、抗腹瀉、抗炎、抗傷害、抗菌和抗病毒藥物[6]。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，關(guān)于車前草中總黃酮提取相關(guān)研究的報(bào)道相對(duì)較少，相關(guān)人員對(duì)技術(shù)變更的了解較少，因此，優(yōu)化車前草總黃酮提取工藝，為有效提取、純化車前草黃酮類成分，合理利用車前草，提高其藥用價(jià)值具有較大意義。

研究采用響應(yīng)面法對(duì)車前草中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型和小鼠腸道蠕動(dòng)模型探究車前草黃酮類化合物對(duì)腹瀉的影響，為車前草總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)及用于治療仔豬腹瀉藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠共30 只，雌雄各半，體重18～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

車前草購自中國(guó)黑龍江省哈爾濱市中草藥市場(chǎng)；蘆丁對(duì)照品購自上海源葉公司；蓖麻油購自天津福晨化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

表1 儀器設(shè)備Table 1 The detail information of instruments

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 車前草總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

按照朱良會(huì)，張意笠等[7-8]利用NaNO2-Al（NO3）3比色法繪制車前草總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體操作如下：分別精確吸取每毫升含0.1 mg 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，將溶液分別加入已準(zhǔn)備好的試管中；分別將濃度為30%的乙醇溶液加入到各個(gè)試管中，使溶液體積固定在5 mL；再向試管中加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液；輕搖溶液使其混合均勻，置于室溫下靜置6 min；向其中加入0.3 mL 的Al（NO3）3溶液，再次混合均勻后靜置6 min；最后向其中加入4 mL 濃度為1 mol·L-1的NaOH 溶液及0.4 mL 的蒸餾水，再次混合均勻后，于室溫下靜置15 min。分別置于510 nm 的波長(zhǎng)下并測(cè)定其吸光度，根據(jù)分光光度計(jì)輸出結(jié)果繪制出吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 車前草總黃酮提取

選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度作為變量，控制其他三個(gè)變量相同，只改變其中一個(gè)變量，分別對(duì)車前草中提取的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)算。測(cè)算方法是：首先收集提取出的溶液，將其置于3 000 rpm·min-1的離心機(jī)中離心5 min；取出上清液并過濾，將過濾后溶液用一定濃度的提取溶劑將其定容到25 mL；根據(jù)分光光度計(jì)輸出結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3 車前草總黃酮提取率測(cè)定

取出5 mL 的黃酮提取液，按照1.3.1 中的方法對(duì)提取液中的總黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)總黃酮提取率（mg·g-1）=總黃酮質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/車前草質(zhì)量公式對(duì)提取率進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 單因素分析

分別取出料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的溶液，在濃度為70%的乙醇溶液、溫度為80 ℃的環(huán)境下2 h，測(cè)量其黃酮含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度分別設(shè)定在70、75、80、85、90 ℃，同樣在70%的乙醇溶液環(huán)境下2 h 進(jìn)行提取，測(cè)定其黃酮含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度設(shè)定在80 ℃，分別提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，測(cè)定黃酮的含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度設(shè)定在80 ℃，在乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的條件下提取時(shí)間2 h，測(cè)定其酮含量。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化

研究選擇硝酸鋁顯色法作為檢測(cè)方法對(duì)溶液中的黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)公式計(jì)算提取率。研究在Box-Behnken 分析的基礎(chǔ)上，設(shè)定提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度這四個(gè)變量，分別作為自變量，將總黃酮提取率的變化值作為因變量，通過Design-Expert 8.0.5 對(duì)其最優(yōu)提取條件進(jìn)行測(cè)算，結(jié)果見下表2 中。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Response surface test factors and levels

1.2.6 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉模型試驗(yàn)

按照南蘋瑤[29]利用蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)小鼠禁食18 h，根據(jù)隨機(jī)性原則將30 只小鼠分為5 組，每組6 只，第一組灌服0.2 mL 的蒸餾水，作空白對(duì)照；第二組灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他組灌服藥物1 h 之后灌服）；第三、四、五組分別按低劑量組（100 mg·kg-10.2 mL）、中劑量組（200 mg·kg-10.2 mL）、高劑量組（300 mg·kg-10.2 mL）灌服車前草總黃酮提取物0.2 mL，作為藥物組，灌服1 h 后，各組均灌服0.2 mL 蓖麻油。觀察并記錄連續(xù)6 h 內(nèi)小鼠的初次腹瀉時(shí)間、總排便次數(shù)、計(jì)算排便抑制率。

1.2.7 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腸蠕動(dòng)模型試驗(yàn)

同樣按照1.2.6 上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行禁食、隨機(jī)分配、藥物灌服，第一組灌服0.2 mL 的蒸餾水，作空白對(duì)照；第二組灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他組灌服藥物1 h 之后灌服）；第三、四、五組分別按低劑量組（100 mg·kg-10.2 mL）、中劑量組（200 mg·kg-10.2 mL）、高劑量組（300 mg·kg-10.2 mL）灌服車前草總黃酮提取物0.2 mL，作為藥物組；1 h 后，各組小鼠均灌服0.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)碳粉溶液；30 min 后，將小鼠安樂死，從小鼠體內(nèi)取出小腸，將小腸均勻展開形成直線，對(duì)小腸的總長(zhǎng)度、碳粉溶液在小腸內(nèi)的推進(jìn)距離進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析結(jié)果

通過單因素分析法驗(yàn)證了不同條件下黃酮的提取效率變化情況，結(jié)果顯示，不同因素對(duì)黃酮提取率的影響見下圖1（A～D）中所示，從圖中可以看出，在其他因素不變的條件下，料液比增加，黃酮取得率先增加，在料液比為1∶15 時(shí)最高，隨著液料比改變，其黃酮提取率趨勢(shì)無變化，詳見圖1-A。在其他因素不變的條件下，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，總黃酮提取率最高，85 ℃有下降趨勢(shì)，見圖1-B。在其他因素不變的條件下，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮取得率在一定時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)上升，在2 h 時(shí)達(dá)到峰值，見圖1-C。在其他因素不變的條件下，乙醇濃度的增加使黃酮的提取率顯著上升，在濃度為70%時(shí)最高，見圖1-D。

圖1 單因素考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）對(duì)黃酮提取效果的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ethanol concentration（D）on PTF extraction investigated by single factor method

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍ふ易顑?yōu)條件下的黃酮提取率，通過單因素分析的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，為了更好地測(cè)定黃酮類化合物的含量，采用紫外分光光度法測(cè)定了黃酮類化合物的含量。以蘆丁為參考物質(zhì)，在510 nm 處測(cè)定不同已知濃度的蘆丁的吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2值為0.999 5，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用條件。將提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度作為變化因素，對(duì)其中單一因素的影響情況進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，然后通過Design-Expert 8.0.5 對(duì)其最優(yōu)提取條件進(jìn)行測(cè)算，利用ANOVA 進(jìn)行響應(yīng)面回歸，結(jié)果如下表3 所示。模型的均方誤差為0.015 6＜0.05，表明模型回歸顯著，實(shí)驗(yàn)方法可靠。結(jié)果如圖2所示，通過RSM 得到了最佳的提取條件，當(dāng)乙醇濃度為70.36%，提取溫度為85.6 ℃，提取時(shí)間為1.29 h，液材比為1∶15.99 時(shí)，得到車前草總黃酮的提取率。得到了二次多元擬合回歸模型方程：提取率=11.28+0.62 A+0.68 B+0.41 C+0.75 D-0.15 AB-0.56 AC-0.43 AD-0.33 BC+0.11 BD+0.2 CD-0.57 A2-0.8 B2-1.28 C2-0.87 D2，在最佳提取條件下，總黃酮類化合物的提取速率為12.41 mg·g-1，從該提取過程中提取的總黃酮類化合物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（A 為乙醇濃度，B為提取溫度，C 是為提取時(shí)間，D 為料液比。）

圖2 響應(yīng)面結(jié)果Fig.2 Response surface result

表3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Response surface methodology experimental design

2.3 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉模型試驗(yàn)結(jié)果

通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗(yàn)證該藥物對(duì)小鼠腹瀉次數(shù)的影響，結(jié)果如圖3-A 所示，給藥組的小鼠腹瀉次數(shù)比腹瀉對(duì)照組要極顯著降低（P＜0.01）。通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗(yàn)證該藥物對(duì)小鼠腹瀉初次時(shí)間的影響，如圖3-B 所示，給藥組的首次腹瀉開始時(shí)間要比腹瀉對(duì)照組晚。這表明總黃酮能夠有效抑制小鼠腹瀉。

圖3 小鼠腹瀉次數(shù)（A）、小鼠初次腹瀉時(shí)間（B）Fig.3 Diarrhea times of mice（A），time of first diarrhea of mice（B）

2.4 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腸蠕動(dòng)模型試驗(yàn)結(jié)果

通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗(yàn)證該藥物對(duì)小鼠腸蠕動(dòng)的影響，結(jié)果如圖4 所示，與健康對(duì)照組比較，腹瀉對(duì)照組碳墨法推進(jìn)率顯著后移（P＜0.05），顯示碳墨已經(jīng)推進(jìn)至模型組小鼠小腸末端，表明實(shí)驗(yàn)采用蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉造模成功。車前草總黃酮給藥組與腹瀉對(duì)照組比較，腹瀉模型組碳墨法推進(jìn)率顯著降低（P＜0.05）。

圖4 碳粉推進(jìn)比Fig.4 Carbon powder propulsion ratio

3 討論

腹瀉是一種在動(dòng)物群體中常見且高發(fā)的疾病，腹瀉可以使動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)不良，導(dǎo)致維生素缺乏，引起動(dòng)物貧血，降低動(dòng)物抵抗力以及造成動(dòng)物機(jī)體平衡紊亂，腹瀉嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致動(dòng)物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。腹瀉的最主要因素是細(xì)菌性感染，這類因素對(duì)腹瀉的預(yù)防和治療非常不利。迄今為止，各種實(shí)驗(yàn)藥物和策略已用于治療腹瀉，例如使用新霉素、消膽胺/左氧氟沙星和頭孢泊肟等抗生素[10]。雖然這些策略可以緩解腹瀉，但由于引起腹瀉的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并不能完全阻斷腹瀉，尋找針對(duì)動(dòng)物腹瀉的替代治療方法變得越來越迫切，因此特異性天然抗腹瀉藥物已成為研究者的熱點(diǎn)之一。更重要的是，天然藥物中許多活性成分的存在減少了藥物耐藥性的發(fā)生。這是由于天然藥物中不同生物活性成分的獨(dú)特特征，包括多個(gè)靶點(diǎn)和復(fù)雜的機(jī)制[11]。天然藥物已成為篩選抗急性腹瀉藥物的最佳選擇。目前，蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型已廣泛應(yīng)用于抗腹瀉藥物的臨床篩選[12]，蓖麻油釋放的蓖麻油酸刺激胃腸道黏膜，導(dǎo)致胃腸道炎癥、胃腸道分泌增加，胃腸道運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)[13-14]，此外，由于碳粉表面為多孔結(jié)構(gòu)，大量藥物會(huì)吸附在碳粉的表面，這使得碳粉具有了標(biāo)記作用，如果藥物能夠減慢腸道的蠕動(dòng)，通過給小鼠灌注碳粉并取出小鼠小腸，觀察糞便在小腸中的位置，就可以據(jù)此推斷出藥物是否能夠減慢腸道的蠕動(dòng)。在研究中，腹瀉組的碳粉推進(jìn)率要明顯減少（P＜0.05），這一結(jié)果與其他研究人員的研究結(jié)論基本一致[15-18]，說明黃酮具有減慢腸道蠕動(dòng)的作用。

研究中所使用的響應(yīng)面法在黃酮類化合物的提取方面具有廣泛的應(yīng)用，一方面，方法不僅能夠彌補(bǔ)正交試驗(yàn)的不足，而且有助于研究者找出最優(yōu)影響因素和最優(yōu)組合的響應(yīng)價(jià)值，降低檢測(cè)的數(shù)量，全面了解各個(gè)因素的影響水平高低[19]；另一方面，從藥用植物中提取有效成分對(duì)藥物的開發(fā)和利用有很大的影響[20]，研究人員通過優(yōu)化提取過程，實(shí)現(xiàn)了在有限條件下獲得更多提取物的目標(biāo)[21]。其中，響應(yīng)面法（RSM）已廣泛應(yīng)用于不同的工藝優(yōu)化領(lǐng)域。例如，利用RSM 優(yōu)化橄欖餅油的超臨界二氧化碳提取工藝，有效提高了食品化學(xué)的產(chǎn)量和生物活性分子的含量，同時(shí)分析了RSM 和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）對(duì)膜潤(rùn)濕的影響[22]，RSM 操作方便，同時(shí)考慮多種因素對(duì)工藝的影響。從而計(jì)算最佳提取條件，這就是藥用植物活性成分的提取。該研究中，優(yōu)化了車前草黃酮的提取過程。基于黃酮類化合物容易溶于醇，廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的提取[23]，響應(yīng)曲面法（RSM）被用來優(yōu)化影響提取速率的四個(gè)關(guān)鍵因素，包括乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比。RSM 具有高精度、高效、模型構(gòu)建準(zhǔn)確的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種專業(yè)工藝優(yōu)化，特別是天然化合物的提取[24-25]。采用Box-behnken 設(shè)計(jì)（BBD）RSM 優(yōu)化模擬車前草總黃酮的提取工藝，與RSM 的復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）相比，BBD通過更少的試驗(yàn)可以更有效地獲得最佳條件[26]。因此，BBD 設(shè)計(jì)了29 組實(shí)驗(yàn)，研究了4 個(gè)因素對(duì)車前草黃酮提取率的影響，得到了6 個(gè)二次因素模型，結(jié)果表明四個(gè)因素存在顯著相關(guān)性，當(dāng)乙醇濃度為70.36%，提取溫度為85.6 ℃，提取時(shí)間為1.29 h，料液比為1∶15.99，方法可以得到總黃酮的提取率。車前草黃酮的提取率為12.41 mg·g-1。

研究采用蓖麻油誘導(dǎo)腹瀉模型評(píng)價(jià)了黃酮類化合物的抗腹瀉作用。結(jié)果表明，車前草總黃酮可顯著減少小鼠腹瀉次數(shù)，且呈劑量依賴性。車前草總黃酮類化合物能顯著抑制腸道蠕動(dòng)，從而抑制腸道蠕動(dòng)，減少腹瀉的形成[27-28]。表明車前草總黃酮具有研究開發(fā)價(jià)值和潛力，為深入研究車前草黃酮化合物及提高車前草資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)車前草作為抗腹瀉藥物提供科學(xué)依據(jù)。