灌服酒炙車前子活性組分的胎衣不下奶牛血清代謝產(chǎn)物L(fēng)C-MS/MS 法分析

魯文賡，周繼偉，田春雨，司琳清，袁思琦，謝何昕，申貴男

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.吉林省榆樹市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

奶牛胎衣不下（Retained placenta，RP）又稱胎衣滯留，是指奶牛在產(chǎn)后12 h 以內(nèi)未能將胎衣正常完全排出的一種奶牛繁殖障礙性疾病，根據(jù)報(bào)道，奶牛胎衣不下可引起子宮積膿和子宮內(nèi)膜炎等繁殖障礙性疾病[1]，嚴(yán)重者可引起奶牛敗血癥，還可造成奶牛產(chǎn)犢間隔延長、產(chǎn)奶量減少以及子宮復(fù)舊延遲等[2-3]。此外，奶牛哺乳期因胎衣不下產(chǎn)奶量降低約753 kg·頭-1，每年每頭造成的產(chǎn)奶損失、治療損失以及人工費(fèi)用約$ 386[4]，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大的影響。目前，大多數(shù)養(yǎng)殖業(yè)依然采用傳統(tǒng)方法來治療胎衣不下，例如肌注催產(chǎn)素、子宮灌注抗生素、手術(shù)剝離胎衣以及灌服中草藥制劑等辦法[5-7]，雖具有一定的療效，但同時(shí)也會造成抗生素殘留和/或激素殘留等弊端，給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全帶來重大的隱患，因此研發(fā)高效、安全、便捷、廉價(jià)的治療奶牛胎衣不下的中草藥針劑必不可少。

《元亨療馬集·牛經(jīng)》中最早記載了酒炙車前子治療奶牛胎衣不下的處方，并且近些年許多研究者驗(yàn)證了其療效，發(fā)現(xiàn)其治療效果能夠高達(dá)60%[8-9]，故為了明確該藥的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，在前期研究過程中，實(shí)驗(yàn)室建立酒炙車前子中有效物質(zhì)的分離體系，確定了活性組分Ⅲ和Ⅵ是治療奶牛胎衣不下的有效物質(zhì)，并闡明了活性組分Ⅲ和Ⅵ的有效成分[10-11]，但治療奶牛胎衣不下時(shí)酒炙車前子活性組分的體內(nèi)有效成分尚不清楚。由于LC-MS/MS 技術(shù)表現(xiàn)出了靈敏度高，選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，在臨床檢測時(shí)無論是應(yīng)用到放射性免疫檢測還是應(yīng)用化學(xué)檢測時(shí)，都是其他方法遙不可及的，尤其是在串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用中，可以使化合物結(jié)構(gòu)信息變得更加明顯[12]，例如曹潔等[13]用LC-MS/MS 法檢測人血液中的利多卡因及其代謝物。鑒于此，實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS 技術(shù)對酒炙車前子治療奶牛胎衣不下活性組分Ⅲ和Ⅵ的化學(xué)成分進(jìn)行體內(nèi)代謝分析及鑒定，進(jìn)而闡明其治療奶牛胎衣不下的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于黑龍江省北安市某牧場進(jìn)行，每天飼喂全混合日糧（TMR），分別為早上5：00、下午1：00 以及晚上9：00，共3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)飼喂，期間奶?？梢宰杂娠嬎⑦M(jìn)食和運(yùn)動(dòng)。之后從中挑選沒有分娩異常，以及重大的產(chǎn)前產(chǎn)后疾病，年齡在2～5 歲、胎次為1～3胎、體況評分（BCS）在2.5～3.5 之間、妊娠期為275～285 d 的胎衣不下的奶牛共15 頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為活性組分Ⅲ組（5 頭，每頭0.297 g）、活性組分Ⅵ組（5頭，每頭0.118 g）和陰性對照組（5 頭，每頭生理鹽水500 mL）。

1.2 主要試劑與器材

車前子，規(guī)格為500 g·袋-1，產(chǎn)自江西省吉安市，購買于仁人試劑經(jīng)銷部（哈爾濱），2-氯苯丙氨酸，甲酸，無水乙醇、石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯購自泉瑞試劑（遼寧）有限公司，甲醇、乙腈、超純水購自默克集團(tuán)（德國）有限公司。RE52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自榮亞生化儀器廠（上海），LyoQuest-55 型冷凍干燥機(jī)購自泰事達(dá)（西班牙）科技公司，Acquity 超高效液相色譜儀沃世特科技（上海）有限公司，Q Exactive 質(zhì)譜儀Thermo Fisher Scientific（美國）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

前期實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了藥效篩選實(shí)驗(yàn)，確定了酒炙車前子治療奶牛胎衣不下的是活性組分Ⅲ、Ⅵ。并參照實(shí)驗(yàn)室前期分離體系[10]，在二氯甲烷∶甲醇（30∶1）洗脫劑中獲得其活性組分Ⅲ、Ⅵ的浸膏。然后將獲得的浸膏與生理鹽水按照比例1∶500 口服直接灌胃，隨后在灌服藥物后0，6，12 h 經(jīng)尾靜脈采集血液，并以3 600×g 離心，收集血清。

1.3.2 UPLC 梯度洗脫

采用ACQUITY UPLC HSS T3 型號的色譜柱，其直徑×高為2.1×100 mm，粒徑為1.8 μm，一次進(jìn)樣10 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度調(diào)至4 ℃，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)以水+0.05%甲酸（A），乙腈（B）為流動(dòng)相條件進(jìn)行洗脫，具體的梯度洗脫程序?yàn)锳：0～12 min 時(shí)95%～5%；12～13.6 min 時(shí)5%～95%；13.6～16 min 一直為95%。B：0～12 min 時(shí)5%～95%；12～13.6 min 時(shí)95%～5%；6～16 min 一直為5%。每次進(jìn)樣的量為10 μL，柱溫調(diào)至為40 ℃，流速調(diào)至0.3 mL·min-1。

1.3.3 質(zhì)譜檢測

采用ESI 電噴霧離子源，同時(shí)在正、負(fù)離子模式下檢測，以70～1 050 為質(zhì)量的掃描范圍，分辨率為17 500；以45 arb 為鞘氣流速；以1 arb 為尾氣的流速；以300 ℃為加熱器溫度；以350 ℃為毛細(xì)管溫度；正模式下電噴霧電壓為3.0 KV，S-Lens RF Level，30%，負(fù)模式下電噴霧電壓為3.2 KV，S-Lens RF Level，60%。以15 arb 為輔助氣流速。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Compound Discoverer 軟件（Thermo 公司）提取并且預(yù)處理LC/MS 檢測到的數(shù)據(jù)，然后利用Xcalibur 分析軟件進(jìn)行分析處理并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫Metlin、HMDB、KEGG 及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行碎片及精確相對分子質(zhì)量匹配，篩選相對分子質(zhì)量實(shí)測值與理論值偏差絕對值小于5×10-6的化合物，即為酒炙車前子治療奶牛胎衣不下活性組分的體內(nèi)可能有效成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性組分Ⅲ的體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定

采用LC-MS/M 技術(shù)定性分析酒炙車前子治療奶牛胎衣不下活性組分Ⅲ，ESI（+）和ESI（-）質(zhì)譜離子流圖（TIC）如圖1 所示，其為活性組分Ⅲ體內(nèi)代謝產(chǎn)物圖。通過LC-MS/MS 技術(shù)檢測得到活性組分Ⅲ的各種成份的相對分子質(zhì)量以及保留時(shí)間等各種質(zhì)譜信息，并利用Metlin、HMDB、KEGG，Pubchem 等數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)對離子流圖進(jìn)行比對，以質(zhì)量偏差值小于絕對值5×10-6為原則，進(jìn)行碎片離子匹配，其化學(xué)成分最終根據(jù)特征碎片分析確定。實(shí)驗(yàn)共在正離子模式下共分析出了11 個(gè)化合物，主要有有機(jī)雜環(huán)類3 個(gè)，脂類2 個(gè)，萜類，胺類，吡嗪類，吡喃酮，黃酮，其他類化合物各1 個(gè)（表1）。負(fù)模式下共分析出了13 個(gè)化合物，主要包括有機(jī)雜環(huán)類5 個(gè)，脂類和其他類化合物各2 個(gè)，核苷類，羧酸類，酚醌類，糖醇類各1 個(gè)（表2）。

表1 正離子模式下活性組分Ⅲ的代謝產(chǎn)物Table 1 Metabolites of active component Ⅲin positive ion mode

表2 負(fù)離子模式下活性組分Ⅲ的代謝產(chǎn)物Table 2 Metabolites of active component Ⅲin anion mode

圖1 活性組分Ⅲ體內(nèi)代謝產(chǎn)物的正模式（A）負(fù)模式（B）TIC 圖Fig.1 Positive pattern（A）negative pattern（B）TIC diagram of metabolites of active component Ⅲin vivo

2.2 活性組分Ⅲ根據(jù)質(zhì)譜裂解特征分析

正離子模式下以曲酸為例，曲酸的相對分子質(zhì)量實(shí)測值是142.026 0，在保留時(shí)間（t保留）為0.321 min時(shí)，顯示了m/z 143［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式應(yīng)該為C6H6O4，依次脫去OH，C2H2O 后形成特征碎片m/z 125［M+H-OH］+，m/z 83［M+H-OH-C2H2O］+，推斷裂解途徑見圖2，根據(jù)曲酸碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[14]，與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)一步推測該化合物可能為曲酸。吡嗪酸相對分子質(zhì)量實(shí)測值為124.026 6，保留時(shí)間（t保留）為0.321 min 時(shí)，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 125［M+H］+，根據(jù)化學(xué)元素組成的不同，該化合物分子式應(yīng)該為C5H5N3O，脫去CNO 后形成特征碎片m/z 81［M+H-CNO］+，推斷裂解途徑見圖3，根據(jù)吡嗪酸碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15]，以及與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后，推測該化合物可能為吡嗪酸。

圖2 正離子模式下曲酸的裂解途徑Fig.2 Decomposition pathway of kojic acid in positive ion mode

圖3 正離子模式下吡嗪酸的裂解途徑Fig.3 Cleavage pathway of pyrazinic acid in positive ion mode

負(fù)離子模式下以白花丹素為例，白花丹素相對分子質(zhì)量實(shí)測值為188.048 3，色譜保留時(shí)間（t保留）為0.826 min，以m/z 187［M-H］-為準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式應(yīng)該為C11H8O3，脫去CH5，C2O2后，形成特征碎片m/z 171［M-H-CH5］-以及m/z 115［M-H-CH5-C2O2］-，裂解途徑見圖4，根據(jù)白花丹素碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16]，與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)一步推測該化合物可能為白花丹素。此外，測得2，4-二氯苯酚相對分子質(zhì)量為161.963 8，保留時(shí)間（t保留）為8.271 min 時(shí)，顯示了m/z 160［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式應(yīng)該為C11H8O3，H2Cl 被脫掉后，形成了特征碎片m/z 125［M-H-H2Cl］-，裂解途徑見圖5，根據(jù)圖2，4-二氯苯酚碎片離子峰信息以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[17]，以及與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后，推測該化合物可能為2，4-二氯苯酚。

圖4 負(fù)離子模式下白花丹素裂解途徑Fig.4 Degradation pathway of chrysanthine in anion mode

圖5 負(fù)離子模式下2，4 二氯苯酚裂解途徑Fig.5 Pyrolysis pathway of 2，4 dichlorophenol in anion mode

2.3 活性組分Ⅵ體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定

采用LC-MS/M 技術(shù)定性分析酒炙車前子治療奶牛胎衣不下活性組分Ⅵ，ESI（+）和ESI（-）的質(zhì)譜離子流圖（TIC）如圖6 所示，其為活性組分Ⅵ體內(nèi)代謝產(chǎn)物圖。通過LC-MS/MS 技術(shù)檢測得到活性組分Ⅵ的各種成份的相對分子質(zhì)量以及保留時(shí)間等各種質(zhì)譜信息，并利用Metlin、HMDB、KEGG，Pubchem 等數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)對離子流圖進(jìn)行比對，以質(zhì)量偏差值小于絕對值5×10-6為原則，進(jìn)行碎片離子匹配，最終根據(jù)特征碎片確定其化學(xué)成分。正模式下共分析出了14 個(gè)化合物，主要有有機(jī)雜環(huán)類4個(gè)，其他類化合物2 個(gè)，胺類，烷類，萜類，脂類，吲哚類，酰胺類，酚類，磷酸各1 個(gè)（表3）。負(fù)模式下共分析出了12 個(gè)化合物主要包括核苷類和其他類化合物各3 個(gè)，有機(jī)雜環(huán)類2 個(gè)，脂類，萜類，黃酮，羧酸類各1 個(gè)（表4）。

表3 正離子模式下活性組分Ⅵ的代謝產(chǎn)物Table 3 Metabolites of active component Ⅵin positive ion mode

表4 負(fù)離子模式下活性組分Ⅵ的代謝產(chǎn)物Table 4 Metabolites of active component Ⅵin anion mode

圖6 活性組分Ⅵ體內(nèi)代謝產(chǎn)物正模式（A）負(fù)模式（B）TIC 圖Fig.6 Positive（A）negative（B）TIC pattern of metabolites in active component Ⅵ

2.4 活性組分Ⅵ根據(jù)質(zhì)譜裂解特征分析

正離子模式下以丹皮酚為例，相對分子質(zhì)量實(shí)測值為166.062 6，在保留時(shí)間（t保留）為3.476 min時(shí)，出現(xiàn)m/z 167［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式應(yīng)該為C9H10O3，脫去OH 后形成了特征碎片m/z 149［M+H-OH］+，裂解途徑見圖7，根據(jù)丹皮酚碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[18]，與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)一步推測該化合物可能為丹皮酚。測得五氧二十碳四烯酸（5-KETE）相對分子質(zhì)量為318.217 8，在保留時(shí)間（t保留）為10.322 min 時(shí)，出現(xiàn)m/z 319［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式應(yīng)該為C20H30O3，之后C4H7O2，C5H10，C5H6被去除，形成了特征碎片m/z 231［M+HC4H7O2］+，m/z 161［M+H-C4H7O2-C5H10］+，m/z 95［M+HC4H7O2-C5H10-C5H6］+，裂解途徑見圖8，根據(jù)5-KETE碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[19]，與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)一步推測該化合物可能為5-KETE。

圖7 正離子模式下丹皮酚裂解途徑Fig.7 Paeonol pyrolysis pathway in positive ion mode

圖8 正離子模式下5-KETE 裂解途徑Fig.8 5-KETE cleavage pathway in positive ion mode

負(fù)離子模式下以甘草苷為例，甘草苷相對分子質(zhì)量實(shí)測值為418.126 3，保留時(shí)間（t保留）為5.029 min時(shí)，出現(xiàn)m/z 417［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，由于化學(xué)元素的組成各不相同，故分析該化合物的分子式為C21H22O9，脫去C4H11O5，C10H7O 后形成m/z 279［M-HC4H11O5］-，m/z 135［M-H-C4H11O5-C10H7O］-等碎片離子峰，裂解途徑見圖9，根據(jù)甘草苷碎片離子峰信息并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[20]，以及與HMDB 等數(shù)據(jù)庫比對后，推測該化合物可能為甘草苷。

圖9 負(fù)模式下甘草苷裂解途徑Fig.9 Lytic pathway of liquiritin in negative mode

3 討論

在中國，車前子很早以前就有用來治療奶牛胎衣不下的歷史，因此，在以往的研究中，測定了治療奶牛胎衣不下的有效成分是酒炙車前子的活性組分Ⅲ和Ⅵ，并已測定活性組分的有效成分[21-23]，但尚不明確治療奶牛胎衣不下中酒炙車前子活性組分的體內(nèi)有效成分是哪個(gè)。因此，研究利用了LC-MS/MS 技術(shù)分析鑒定了用于治療奶牛胎衣不下的酒炙車前子活性組分Ⅲ和Ⅵ的體內(nèi)有效成分。分析灌服活性組分Ⅲ的奶牛血清，共有24 種成分在正、負(fù)離子模式下鑒定出來。根據(jù)質(zhì)譜裂解特征在正離子模式下分析確定含有曲酸，有研究表明，曲酸能降低丙二醛（MDA）含量，提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化氫酶（CAT）活性，從而提高抗氧化能力，在SAHDEV[24]的研究中發(fā)現(xiàn)吡嗪酸可以清除活性氧（ROS），使體內(nèi)的谷胱甘肽（GSH），CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）恢復(fù)到基本水平，進(jìn)一步達(dá)到奶牛胎衣脫落的目的。在負(fù)模式中根據(jù)質(zhì)譜裂解特征確定含有白花丹素，白花丹素屬于典型的酚醌類化合物，其醌環(huán)是酚羥基的主要抗氧化的基團(tuán)，可以降低組織內(nèi)ROS 水平，使SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）的活力得到明顯提升，有效的降低了氧化應(yīng)激損傷的程度[25]。其次2，4-二氯苯酚可以增加雄激素含量，在研究結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮含量明顯上升，脫氫表雄酮可以使雌二醇含量增加[26-27]，雌二醇的升高可令子宮肌對催產(chǎn)素的更加敏感，并且在雌二醇與催產(chǎn)素共同作用下，可使子宮肌開放，子宮收縮力加強(qiáng)，進(jìn)而使胎衣脫落。

與此同時(shí)，分析灌服活性組分Ⅵ的奶牛血清，共有26 種成分在正、負(fù)離子模式下鑒定出來。根據(jù)質(zhì)譜裂解特征在正離子模式下分析確定含有丹皮酚，而丹皮酚是小分子酚類化合物，可以使核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）顯著提升，并且使SOD 的活力得到增強(qiáng)，降低MDA 的含量[28]，達(dá)到治療奶牛胎衣不下的目的。5-KETE 是花生四烯酸經(jīng)過5-脂氧合酶選擇性合成的產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激或細(xì)胞死亡時(shí)，5-KETE 的大量合成，其大量合成在嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)的很明顯，并且它在中性粒細(xì)胞細(xì)胞上也有表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)[29]，從而治療奶牛胎衣不下。此外，甘草苷在負(fù)模式下根據(jù)質(zhì)譜裂解特征被分析確定，其具有鎮(zhèn)痛，抗氧化，抗炎等作用，能夠提高GSH 和CAT 的活性，使MDA的含量減少，降低了白介素8（IL-1β）、白介素6（IL-6）的表達(dá)[30]，進(jìn)一步達(dá)到使奶牛胎衣脫落的目的。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS 技術(shù)，分析了酒炙車前子治療奶牛胎衣不下的活性組分Ⅲ和Ⅵ的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，對其代謝產(chǎn)物的精確分子量及二級裂解進(jìn)行分析，并與相關(guān)數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對，共鑒定出24 種化合物與活性組分Ⅲ有關(guān)，活性組分Ⅵ有26 種化合物與其相關(guān)，其中，有機(jī)雜環(huán)類，脂類，萜類，胺類，黃酮，羧酸類為活性組分Ⅲ和Ⅵ共有成分，此外，活性組分Ⅲ還含有吡嗪類，核苷類，酚醌類，糖醇類，活性組分Ⅵ還含有烷類，吲哚類，酰胺類，酚類。實(shí)驗(yàn)闡明了酒炙車前子治療奶牛胎衣不下活性組分Ⅲ和Ⅵ的體內(nèi)可能有效成分，從而為今后研發(fā)高效、安全和廉價(jià)的防治奶牛胎衣不下的中藥針劑提供了新方向。