脂肪變性供肝冷缺血損傷的研究進(jìn)展

楊漢文 王強(qiáng) 成柯 蔡銘心 趙于軍

美國(guó)專家Starzl 教授于20世紀(jì)60年代實(shí)施了第1 例人體原位肝移植，為人類器官移植掀開(kāi)了嶄新的一頁(yè)[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展，移植手術(shù)的需求日益增多，但因器官的供應(yīng)不足而受限。為了緩解這種情況，許多移植中心被迫擴(kuò)大器官選擇標(biāo)準(zhǔn)。鑒于非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）供者比例日益增多，如何提高脂肪變性供肝的使用率至關(guān)重要[2]。脂肪變性根據(jù)脂肪泡的大小分為大泡性脂肪變性和小泡性脂肪變性，大多數(shù)情況下大泡性脂肪變性和小泡性脂肪變性同時(shí)存在于不同程度脂肪變性的肝臟中[3]。脂肪變性根據(jù)脂肪浸潤(rùn)嚴(yán)重程度分為輕度（＜30%）、中度（30%～60%）和重度（＞60%）。在臨床上，小泡性脂肪變性、輕中度的大泡性脂肪變性供肝可應(yīng)用于肝移植[4-5]。臨床器官移植前需要將供者器官進(jìn)行冷保存，此過(guò)程經(jīng)歷的低溫、缺血以及缺氧造成的細(xì)胞凋亡、酸中毒等病理?yè)p傷稱為冷缺血損傷[6-7]。冷缺血損傷增加了肝移植術(shù)后器官功能不全的發(fā)生率，因此了解脂肪變性供肝冷缺血下的損傷機(jī)制和干預(yù)措施尤為重要。據(jù)筆者查閱文獻(xiàn)，已有的脂肪變性供肝相關(guān)研究大多為熱缺血-再灌注損傷和肝移植術(shù)后的研究，但尚無(wú)冷保存階段的文獻(xiàn)闡述，本文對(duì)脂肪變性供肝冷缺血損傷的相關(guān)研究做一綜述。

1 脂肪變性供肝冷缺血下的功能評(píng)估

Young 等[8]使用MRI 評(píng)估供肝的質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)，即評(píng)估供肝脂肪變性程度，這是首次用MRI評(píng)估離體供肝的研究，但結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于機(jī)器溫度的校準(zhǔn)。Hamamoto 等[9]發(fā)現(xiàn)器官保存期間灌注液的游離脂肪酸和乳酸脫氫酶能夠反映供肝質(zhì)量，當(dāng)游離脂肪酸達(dá)到45 μg 時(shí)，提示肝臟損傷不可逆。Cardini 等[10]發(fā)現(xiàn)，相比蘇木素-伊紅染色法，聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)共焦顯微鏡更能反映脂肪變性供肝冷保存早期的功能狀態(tài)，能準(zhǔn)確檢測(cè)不同冷缺血時(shí)間下的肝細(xì)胞活性，但其局限性是對(duì)炎癥細(xì)胞的敏感性不高。

微透析技術(shù)是一種將灌洗和透析技術(shù)結(jié)合，能夠連續(xù)微量取樣的技術(shù)，可監(jiān)視細(xì)胞代謝及組織受損的情況[11-12]。隨著冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪變性供肝大鼠透析液葡萄糖水平降低，脂肪變性供肝的缺血缺氧損傷程度逐漸加重，因此推測(cè)微透析技術(shù)對(duì)肝移植術(shù)前脂肪變性供肝功能評(píng)估具有重要意義，值得深入探討[13]。

2 脂肪變性供肝冷缺血損傷的機(jī)制

2.1 不同冷缺血保存方式的比較

冷缺血保存通常包括體外靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）和體外機(jī)械灌注。機(jī)械灌注根據(jù)溫度的不同分為常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）、低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP） 和亞低溫機(jī)械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）3 類[14-15]。SCS 的主要優(yōu)點(diǎn)是方便、價(jià)格低廉，但對(duì)器官的保護(hù)作用不如HMP。HMP 在臨床較為常用，其主要優(yōu)點(diǎn)是可以評(píng)估器官功能，有改善氧合、抗氧化、改善微循環(huán)等作用，但其費(fèi)用昂貴[16-17]。Wang 等[18]發(fā)現(xiàn)，相比脂肪變性供肝SCS 組，脂肪變性供肝HMP 組的brahma 相關(guān)基因（brahma-related gene 1，Brg1）、核因子E2 相關(guān)因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1 的蛋白表達(dá)水平更高，同時(shí)凋亡程度、炎癥指標(biāo)水平更低，提示HMP 可能通過(guò)Brg1/Nrf2/HO-1 通路抑制凋亡和炎癥反應(yīng)。

2.2 冷缺血損傷的相關(guān)細(xì)胞器

為了檢測(cè)冷缺血損傷中細(xì)胞膜的完整性，Taneja等[19]將臺(tái)盼藍(lán)溶液加入灌注液中，判斷肝臟損傷情況。在30 min 時(shí)，脂肪變性供肝和正常肝臟的肝細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的臺(tái)盼藍(lán)攝入量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在24 h 時(shí)，脂肪變性供肝的肝細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)攝入量遠(yuǎn)大于正常肝細(xì)胞，而肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且損傷指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常肝臟，表明在脂肪變性供肝中肝細(xì)胞更易受到冷缺血損傷。

肝細(xì)胞冷缺血損傷通常表現(xiàn)為細(xì)胞器損傷，如線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。線粒體是一種雙層膜的細(xì)胞器，外層膜決定了線粒體的體積，包含了線粒體融合和分裂蛋白，內(nèi)層膜上有呼吸鏈等重要結(jié)構(gòu)。Tolba 等[20]發(fā)現(xiàn)，在組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液（histidine-tryptophan-ketoglurate solution，HTK 液）中加入左旋肉堿后線粒體谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）增多，腫脹程度減輕，線粒體基質(zhì)、線粒體嵴較前清晰，表明左旋肉堿對(duì)線粒體具有較好的保護(hù)作用。Chu 等[21-22]發(fā)現(xiàn)，與正常肝臟比較，脂肪變性供肝線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性改變導(dǎo)致其線粒體功能障礙，因此更易受冷缺血損傷。缺血預(yù)處理可以改善輕度脂肪變性供肝的線粒體功能，但對(duì)中、重度脂肪變性供肝無(wú)明顯效果。該學(xué)者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性于冷保存5 h 開(kāi)始減弱，且磷酸化程度遠(yuǎn)低于正常肝臟，這個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的提出對(duì)脂肪變性供肝冷保存的干預(yù)具有指導(dǎo)意義。Abudhaise 等[23]發(fā)現(xiàn)在4 h 的HMP 后肝臟線粒體呼吸鏈的結(jié)構(gòu)依然完整，且相比高質(zhì)量的肝臟，低質(zhì)量的肝臟在4 h 的HMP 灌注后線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ的活性下降幅度更大，提示復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ可作為肝功能評(píng)估的重要指標(biāo)。Minor 等[24]對(duì)肝臟腔靜脈進(jìn)行低濃度氧氣灌注后，實(shí)驗(yàn)組中線粒體自噬蛋白beclin-1 的表達(dá)增加，線粒體GLDH 釋放減少。因此，線粒體損傷是冷保存損傷的重要特征，包括線粒體形態(tài)、呼吸鏈和自噬功能等損傷。

溶酶體是真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮降解作用的細(xì)胞器。相關(guān)研究表明，肝臟脂肪變性與溶酶體的通透性有關(guān)。溶酶體蛋白酶Cathepsin 包括11 種，其中Cathepsin B是較重要的一類。凋亡可引起溶酶體分泌Cathepsin，釋放分解后進(jìn)入胞漿激活凋亡途徑，從而引發(fā)肝損傷[25-27]。Guicciardi 等[27]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Cathepsin B 敲除的脂肪變性供肝小鼠，凋亡程度指標(biāo)細(xì)胞色素C 和肝損傷指標(biāo)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 明顯減少，冷缺血損傷減輕。因此，抑制Cathepsin B 可能減輕脂肪變性供肝的冷缺血損傷，未來(lái)值得深入探討。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工的主要場(chǎng)所。當(dāng)細(xì)胞外理化因素改變時(shí)，未折疊蛋白的積累引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路被稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[28]。UPR 易引發(fā)細(xì)胞的凋亡與自噬，通常由轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）和蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）3 種跨膜蛋白介導(dǎo)[29-30]。這些跨膜蛋白可抑制過(guò)量的蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白進(jìn)入胞漿以進(jìn)行泛素化，最終被泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解[31]。有研究證實(shí)，抑制UPS 能夠抑制肝臟冷缺血期間泛素化蛋白的降解，從而延長(zhǎng)保存時(shí)間[32]。

3 脂肪變性供肝冷缺血損傷相關(guān)通路及干預(yù)措施

在脂肪變性供肝冷缺血狀態(tài)下，多種蛋白通過(guò)上述細(xì)胞器發(fā)揮著保護(hù)性作用。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monphosphate activated protein kinase，AMPK）、乙醛脫氫酶2 （aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）和HO-1 是脂肪變性供肝冷缺血損傷通路中的3 類重要蛋白。

3.1 AMPK 及其相關(guān)通路

AMPK 廣泛存在于真核生物中，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成，減少ATP 消耗[33]。Panisello-roselló 等[34]發(fā)現(xiàn)Institute Georges Lopez（IGL）-1 溶液含有較高的AMPK 成分，可通過(guò)抑制UPS 減輕冷缺血損傷。Zaouali 等[35]進(jìn)一步證實(shí)了較低劑量的UPS 抑制劑MG132 和硼替佐米對(duì)冷缺血狀態(tài)下脂肪變性供肝的保護(hù)作用。硼替佐米主要機(jī)制是激活A(yù)MPK/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路，而MG132 的作用則需進(jìn)一步探討。Zaouali 等[36]在IGL-1 溶液中加入褪黑素和曲美他嗪發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活A(yù)MPK，降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)，增加了自噬蛋白的表達(dá)，從而減輕脂肪變性供肝冷缺血損傷。Ben Mosbah 等[37]發(fā)現(xiàn)卡維地洛也可通過(guò)AMPK/eNOS 通路減輕脂肪變性供肝冷缺血損傷。綜上所述，IGL-1 溶液中的AMPK 主要通過(guò)激活eNOS 發(fā)揮作用，但上游通路需進(jìn)一步探討。碳酸酐酶是普遍存在的鋅金屬酶，有多種亞型，可催化可逆反應(yīng)二氧化碳的水化，形成碳酸氫鹽和1 個(gè)質(zhì)子[38]。為了探討其在器官保護(hù)方面的作用，Bejaoui 等[39-40]在IGL-1 溶液中加入碳酸酐酶，碳酸酐酶組再灌注后AMPK 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）應(yīng)激指標(biāo)明顯減少。乙酰唑胺是碳酸酐酶的特異性抑制劑，該學(xué)者將乙酰唑胺加入上述模型中，發(fā)現(xiàn)乙酰唑胺能通過(guò)抑制MAPK 減輕脂肪變性供肝的冷缺血損傷。

3.2 ALDH2 及其相關(guān)通路

ALDH2 是一種廣泛表達(dá)的線粒體酶，在肝臟中高表達(dá)[41]。Panisello-Roselló 等[42]發(fā)現(xiàn)ALDH2 能夠抑制轉(zhuǎn)氨酶的釋放，減輕脂肪變性供肝冷缺血損傷，因此推測(cè)ALDH2 是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。Bardallo等[43]發(fā)現(xiàn)IGL-2 溶液中的聚乙二醇35 可增加脂肪變性供肝ALDH2 的表達(dá)，從而減輕冷缺血損傷。

3.3 HO-1 及其相關(guān)通路

HO-1 是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)酶，能夠催化血紅素的降解[44-45]。Kim 等[46]在酒精性脂肪變性供肝模型中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，HO-1 組膽汁分泌增加，氧化反應(yīng)程度指標(biāo)丙二醛減少，因此HO-1 在酒精性脂肪變性供肝冷保存中具有保護(hù)作用，未來(lái)仍需探討在非酒精性脂肪變性供肝模型中的作用是否一致。Zaoualí 等[47-48]發(fā)現(xiàn)，褪黑素能通過(guò)激活HO-1 和eNOS 減輕脂肪變性供肝線粒體損傷，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。該學(xué)者還發(fā)現(xiàn)在IGL-1 溶液中加入曲美他嗪也能促進(jìn)HO-1的表達(dá)，減輕脂肪變性供肝的冷缺血損傷。褪黑素和曲美他嗪可能通過(guò)AMPK 和HO-1 蛋白保護(hù)上游細(xì)胞器。

4 小結(jié)

綜上所述，由于供臟短缺，大量的脂肪變性供肝用于肝移植。相比于正常肝臟，脂肪變性供肝的肝細(xì)胞更易受冷缺血損傷。肝細(xì)胞的損傷通常表現(xiàn)為細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體的損傷。硼替佐米、卡維地洛、聚乙二醇35、褪黑素等可通過(guò)激活A(yù)MPK、HO-1、ALDH2 等蛋白，保護(hù)冷缺血狀態(tài)下脂肪變性供肝的功能。eNOS 可能是AMPK、ALDH2和HO-1 的共同上游蛋白，保護(hù)線粒體等細(xì)胞器的功能。未來(lái)仍需進(jìn)一步探討eNOS 作用于細(xì)胞器的具體靶點(diǎn)以及相關(guān)通路。脂肪變性供肝冷缺血損傷機(jī)制尚不明了，未來(lái)仍需進(jìn)行深入細(xì)致的探究。