RP-HPLC法同時檢測石榴皮3種多酚類提取物含量研究

范高福,韋夢強,吳 丹,方麗波,梁延波

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.上海海虹實業(yè)(集團)巢湖今辰藥業(yè)有限公司質(zhì)控科,安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) ,石榴科石榴屬植物,又名安石榴、山力葉、丹若等,具有藥食同源特性,源于中亞、東南亞地區(qū),在我國被廣泛種植,其中安徽懷遠(yuǎn)石榴作為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品,具有豐富的營養(yǎng)價值和保健功效[1]。當(dāng)前石榴產(chǎn)業(yè)主要以品種改良、產(chǎn)品深加工為主[2],特別是廢棄石榴皮再生利用備受關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)石榴皮功能部位中潛在安石榴苷(Punicalagin,PU)、鞣花酸(Ellagic acid,EA)、沒食子酸(Gallic acid,GA)等多酚類生物活性物質(zhì),具有抗氧化、消炎殺菌、調(diào)脂降糖及防癌等多種藥理作用[3-10]。當(dāng)前針對石榴中鞣花酸、沒食子酸或安石榴苷等單體提取物的檢測方法較多[11-12],但關(guān)于安徽主產(chǎn)區(qū)石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸3種成分含量同時檢測的方法尚未見報道,本次實驗采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC),對安徽本地的常見石榴品種的廢棄皮部位提取物安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸3種多酚類成分建立同時檢測方法,旨在為安徽本地及全國石榴產(chǎn)區(qū)廢棄石榴皮部位進行多酚類成分檢測提供補充方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

安徽懷遠(yuǎn)石榴購自安徽省蚌埠市懷遠(yuǎn)王氏榴園,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為石榴科石榴屬石榴;安石榴苷對照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);鞣花酸對照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);沒食子酸對照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);Milli-Q超純水,甲醇、乙腈為色譜純;其余所需試劑均為分析純;新鮮石榴皮干粉由實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters-e2695 HPLC系統(tǒng):2998-PDA檢測器(美國沃特世公司);Mnli-Q Biocel超純水系統(tǒng)(美國密理博公司);JC-QX-3.2L型超聲波清洗器(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司); R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);FD-1C-50冷凍干燥機(上海比朗儀器有限公司);ME104E電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);HX-0508數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇天翔儀器有限公司);SHZ-95B型實驗室循環(huán)水真空泵(上海申生儀器抽濾真空泵廠);DGG-9030A型干燥箱(北京宏展儀器有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 實驗方法

2.1.1 安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸檢測的色譜條件

色譜柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min,94% B;9～21 min,94%～85% B;21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B),甲醇沖柱 10 min,94% B平衡 30 min。流速1.0 mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長272 nm,進樣體積10 μL。在此色譜條件下,安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸特征峰峰型良好,無肩峰、拖尾等現(xiàn)象,其色譜圖如圖1所示。

1—沒食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(a)對照品

1—沒食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(c)紅酸石榴皮樣品圖1 HPLC色譜圖

2.1.2 安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸對照品溶液的制備

分別精密稱取石榴皮提取物安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸各對照品適量,置入容量瓶,加60%甲醇稀釋液定量,配制濃度分別為52.0 μg/mL,50.2 μg/mL,50.8 μg/mL的對照品溶液備用。

2.1.3 安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸檢測的供試品石榴皮溶液的制備

取鮮石榴剝皮后收集,30℃干燥箱烘干粉碎處理后過篩,精密稱取石榴皮干粉0.252 0 g,移入容量瓶中,加入60%甲醇稀釋液25 mL,經(jīng)超聲(100 W,40 Hz)震蕩搖勻30 min后稱重,再用60%甲醇稀釋液補缺,搖勻后抽濾取濾液,并經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)精濾制得。

2.1.4 檢測波長的選擇

利用PDA檢測器對安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸各對照品溶液進行全波長紫外掃描,測得吸收輪廓線圖譜見圖2。結(jié)果顯示,安石榴苷在257 nm、358 nm和388 nm處有最大吸收,鞣花酸在254 nm和359 nm處有最大吸收,沒食子酸在254 nm和359 nm處有最大吸收,未出現(xiàn)干擾峰,且分離度較好。根據(jù)相關(guān)文獻[13-15],最終確定272 nm作為安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸同時檢測的波長。

1—沒食子酸對照品;2—安石榴苷對照品;3—鞣花酸對照品。圖2 安石榴苷對照品、鞣花酸對照品、沒食子酸對照品溶液輪廓線掃描圖

3 結(jié)果分析

3.1 安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸檢測的方法學(xué)考察

3.1.1 線性范圍

避光環(huán)境下精密稱取安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸各對照品干粉適量,置于棕色容量瓶中,加60%甲醇稀釋液定容至50 mL,超聲震蕩后搖勻即得對照品母液,再用60%甲醇分別稀釋得到不同質(zhì)量濃度對照品混合溶液,安石榴苷溶液(濃度分別為209.92 μg/mL,104.96 μg/mL,52.480 μg/mL,26.240 μg/mL,13.120 μg/mL)、鞣花酸溶液(濃度分別為213.20 μg/mL,106.60 μg/mL,53.300 μg/mL,26.650 μg/mL,13.325 μg/mL)和沒食子酸溶液(濃度分別為212.40 μg/mL,106.20 μg/mL,53.10 μg/mL,26.550 μg/mL,13.275 μg/mL),每個濃度均進樣10 μL。以溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸各對照品響應(yīng)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)測得安石榴苷回歸方程為y=52 421x+70 824(r=0.999 9),鞣花酸回歸方程為y=29 217x-32 100(r=0.999 9),沒食子酸回歸方程為y=34 094x+38 096(r=0.999 9)。實驗結(jié)果表明,安石榴苷在13.120～209.92 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系,鞣花酸在13.325～213.20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系,沒食子酸在13.275～212.40 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

3.1.2 高效液相色譜法系統(tǒng)適用性實驗

精密量取安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣上述劑量的對照品溶液6次,測得安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為0.6%、0.4%和0.3%。

3.1.3 穩(wěn)定性實驗

量取上述方法制備的石榴皮供試品溶液適量,分別在0,1,3,5,7,12,24 h各加樣10 μL,測得供試品中安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸的峰面積RSD分別為1.2%、0.9%和0.6%。

3.1.4 精密度實驗

稱取等份石榴皮樣品干粉6份,每份取樣約 0.25 g,精密稱定適量,制備供試品溶液,測得安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸的RSD分別為1.7%、1.4%和1.3%。

3.1.5 準(zhǔn)確度實驗

精密稱取等份石榴皮樣品6份,分別準(zhǔn)確加入安石榴苷對照品適量,測定石榴皮供試品所含安石榴苷的質(zhì)量并計算回收率,鞣花酸和沒食子酸對照品同法操作,石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸回收率見表1。

表1 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸回收率及RSD

3.2 樣品含量測定

取安徽蚌埠市懷遠(yuǎn)產(chǎn)地石榴經(jīng)典品種2種,分別為白玉石榴(A品種)和紅酸石榴(B品種),制得石榴皮供試品待測溶液,采用外標(biāo)法同時測定石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸與沒食子酸的質(zhì)量比,測試結(jié)果見表2。

表2 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸的含量(n=3)

4 討論

本實驗通過反相高效液相色譜法同時檢測安徽本地特色石榴功能部位皮中多酚類物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸含量,考察了不同溶劑、時間、溫度條件下對樣品石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸的提取效率的影響,結(jié)果表明,60%甲醇水溶液浸漬樣品12 h,再超聲(100 W)萃取45 min,提取回流溫度60℃,有利于安石榴苷、鞣花酸浸出;而80%乙醇水溶液浸提處理,有利于沒食子酸浸出;超聲處理樣品時長分別為30 min、60 min時,對應(yīng)的石榴皮多酚安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸成分總量分別為8.11%、8.14%,對浸出率影響不大。此外,通過不同濃度(40%,60%,80%)的提取溶劑對石榴皮干粉進行浸提,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此不同溶劑浸提回收率由高到低依次為甲醇、乙醇、丙酮,從而,優(yōu)選甲醇溶劑。

通過PDA掃描,3個色譜主峰在272 nm 均有較強的紫外吸收且供試品溶液的雜質(zhì)峰在此波長吸收較少,因此選擇272 nm 作為檢測波長。安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸均顯弱酸性,當(dāng)流動相pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于三個主成分的酸解離常數(shù)值時,這三種主成分主要以分子形式存在,因此選用磷酸溶液配比甲醇作為首選流動相,色譜柱規(guī)格為250 mm×4.6 mm,5 μm,推薦流速為1.0 mL·min-1,在選擇進樣量時,考慮到檢測靈敏度,首選20 μL進樣量,再逐步降低進樣量到10 μL,三個主峰的峰型對稱度和理論塔板數(shù)都很好,考慮到安石榴苷峰分為安石榴苷A和B組成,同分異構(gòu)體在等度洗脫下難以分開,且分析時間較長,改為梯度洗脫:流動相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min,94% B; 9～21 min,94%～85% B; 21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B)。分析方法學(xué)驗證指標(biāo)精密度良好(RSD<3%),溶液的穩(wěn)定性實驗中,對照品溶液放置室溫條件下,在24 h內(nèi)峰面積的RSD小于3%,準(zhǔn)確度實驗結(jié)果良好。檢測圖譜中安石榴苷存在同分異構(gòu)現(xiàn)象,本次測算以總量計算。與相關(guān)文獻[15-16]報道相比,提取液多使用醋酸乙酯及硼氫化鈉前處理,且干擾因素多,本實驗采用甲醇水溶液進行萃取,檢測波長均為272 nm,流動相條件也較簡單,整體實驗操作簡單,樣品收率穩(wěn)定且環(huán)境污染性小。

本實驗采集了安徽懷遠(yuǎn)地區(qū)的不同優(yōu)良品種石榴皮樣品,并對樣品有效成分的安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸總含量進行了測定,結(jié)果表明,與紅酸石榴皮(B品種)相比,白玉石榴皮(A品種)所含安石榴苷和鞣花酸2種多酚類提取物的含量均有所增加,沒食子酸含量不變,利于安徽本地石榴皮多酚類物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸質(zhì)量同時檢測。此外,本研究通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)初步建立了同時檢測安徽地區(qū)主品種石榴皮多酚類物質(zhì)含量的方法,可作為現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》中有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效補充,且檢測方法靈敏度和準(zhǔn)確度高。