細菌鞭毛蛋白作為疫苗佐劑應(yīng)用的研究進展

項婷婷，馬淑敏 綜述，沃恩康 審校

杭州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310013

細菌鞭毛位于細菌表面，是細菌中最活躍的運動細胞器，有助于細菌避開有害物質(zhì)，向營養(yǎng)物質(zhì)處移動。細菌鞭毛蛋白作為一種病原體相關(guān)分子模式，通過Toll 樣受體5（Toll like receptor 5，TLR5）和NOD 樣受體C4（NOD like receptor C4，NLRC4）兩條受體信號通路激活細胞和體液免疫反應(yīng)，可最大限度提高疫苗抗原的免疫效應(yīng)。另外，鞭毛蛋白還能與TLR 配體協(xié)同作用，用于定制靶向疫苗以滿足相關(guān)疫苗的要求。鞭毛蛋白佐劑疫苗在預(yù)防傳染病和抗腫瘤免疫方面具有獨特優(yōu)勢，已在多種動物模型和臨床試驗中得到證實，具有良好的安全性和有效性，有望成為新型疫苗的研發(fā)方向。本文主要就細菌鞭毛蛋白作為疫苗佐劑應(yīng)用的研究進展作一綜述，以期為鞭毛蛋白佐劑疫苗的研發(fā)提供新思路。

1 鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

細菌鞭毛的主要組成成分為鞭毛蛋白，相同鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)單元之間通過非共價鍵相互連接，呈螺旋狀依次組裝為鞭毛絲。如傷寒沙門菌的鞭毛蛋白由D0、D1、D2、D3 4 個結(jié)構(gòu)域組成，D0 和D1 結(jié)構(gòu)域?qū)⒈廾鞍走B接成規(guī)整的呈細絲狀的螺旋莖，形成α 螺旋結(jié)構(gòu)，位于絲狀部的內(nèi)部，且在鞭毛蛋白同源序列中高度保守，主要介導(dǎo)蛋白分子間和結(jié)構(gòu)域間的相互作用，維持整個鞭毛絲空間架構(gòu)的穩(wěn)定性；D2和D3 結(jié)構(gòu)域是以D1 結(jié)構(gòu)域為中心向外擴散和延伸，形成β 折疊，位于絲狀部的外部，在蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸組成、長度和構(gòu)象上呈高度變化，主要起輔助作用，修飾鞭毛絲表面［1］。明確鞭毛蛋白各結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點和作用，可為后續(xù)其功能的深入研究提供重要依據(jù)。

2 鞭毛蛋白作為疫苗佐劑的機制及潛力

鞭毛蛋白廣泛應(yīng)用于疫苗佐劑的研發(fā)，主要通過激活細胞表面的TLR5 誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)［2］，啟動和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TLR5信號途徑的激活主要通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）依賴性和非依賴性途徑［3］。MyD88 依賴性途徑刺激招募下游適配器分子，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和細胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），隨后刺激產(chǎn)生對宿主防御非常重要的多種基因［4］；MyD88非依賴性途徑涉及TLR5／TLR4異二聚體復(fù)合物的形成，該復(fù)合物通過信號分子TRIF 激活途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒細胞因子干擾素β，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1），促進誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)錄和一氧化氮的生成［5］，干擾素β 是一種重要的信使分子，參與血管、氣道平滑肌的調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、細胞殺傷、腫瘤細胞溶解及內(nèi)分泌激素釋放的過程，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

除了TLR5 對固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的作用外，炎性小體NLRC4 的識別在鞭毛蛋白激活免疫細胞中也起著重要作用［6］。鞭毛蛋白在宿主細胞中的傳遞首先被NLR蛋白家族中的NAIP5和NAIP6識別；隨后，結(jié)合磷脂酶的NAIP5／6復(fù)合物與NOD樣受體NLRC4 相互作用，激活半胱天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinylaspartatespecificproteinase-1，Caspase-1）。Caspase-1將未活化的白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）分解為活化IL-1β，形成一種有效的促炎細胞因子，對宿主抗感染及損傷修復(fù)具有重要作用。闡明其他識別途徑有助于更好地理解鞭毛蛋白與宿主的相互作用［7］，也為基于鞭毛蛋白疫苗的合理設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。

3 鞭毛蛋白作為疫苗佐劑的應(yīng)用

鞭毛蛋白可通過多種不同方式與外源抗原結(jié)合，提高抗原的免疫效果，增強機體細胞和體液免疫，也可作為黏膜佐劑激發(fā)免疫反應(yīng)，控制黏膜表面的細菌感染。另外，鞭毛蛋白在腫瘤疫苗和腫瘤免疫新療法的研發(fā)方面也取得較好的研究進展［8-9］。

3.1 鞭毛蛋白與疫苗抗原共同作用 鞭毛蛋白是各種外源抗原的有效佐劑，為疫苗開發(fā)提供了多種可能性?？扇苄员廾鞍着c抗原共同免疫時，鞭毛蛋白和TLR5 協(xié)調(diào)相互作用影響抗體反應(yīng)，可誘導(dǎo)Th2型細胞免疫反應(yīng)，刺激巨噬細胞產(chǎn)生漿細胞生長因子，促進漿細胞分化，達到疫苗最佳免疫效果［10］。有研究以蠟樣芽孢桿菌鞭毛蛋白為目標(biāo)進行開發(fā)和優(yōu)化，通過對其融合位點的實驗分析，證明抗原-佐劑融合疫苗具有同時將抗原和佐劑遞送至組織的優(yōu)點，并可用于設(shè)計其他鞭毛蛋白結(jié)合疫苗［11］。另有研究采用分子生物學(xué)方法將包含人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）膜近端外區(qū)（membrane proximal external region，MPER）的HIV-gp41（gp41607-683）插入基于鞭毛蛋白的載體，以TLR5 依賴的方式顯著增強了gp41 膜近端外區(qū)的免疫原性，并在小鼠模型中引發(fā)適度的MPER 特異性體液反應(yīng)，表明鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)中加入抗原表位后具有明顯的優(yōu)勢，且在增強體液免疫反應(yīng)方面特別有效［12］。因此，TLR配體是疫苗開發(fā)中具有較大潛力的候選佐劑。

3.2 鞭毛蛋白與疫苗抗原融合表達 鞭毛蛋白的特殊結(jié)構(gòu)使其能夠在不影響構(gòu)象表位的情況下構(gòu)建融合蛋白。在流感疫苗研發(fā)中，由于流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）頭部具有易突變性，使流感病毒結(jié)構(gòu)每年均會發(fā)生改變。有研究將流感病毒HA 頭部蛋白亞單位與鞭毛蛋白基因連接，構(gòu)建融合表達質(zhì)粒，并于原核表達系統(tǒng)中高效表達，制備高免疫效力的重組疫苗［13］。SONG 等［14］將流感病毒HA 抗原的球狀頭部與鞭毛蛋白C-末端基因構(gòu)建融合表達質(zhì)粒，于大腸埃希菌中高效表達，可在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出較高的免疫原性和有效性。后續(xù)研究用H5N1的HA球狀頭替換了鞭毛蛋白的高變區(qū)域，發(fā)現(xiàn)刪除高變區(qū)的鞭毛蛋白融合蛋白不會影響TLR5信號傳導(dǎo)，且具有更好的免疫原性［15］。HULEATT 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，融合蛋白刺激小鼠產(chǎn)生M2e特異性抗體反應(yīng)的能力優(yōu)于明礬佐劑，串聯(lián)M2e 融合鞭毛蛋白的重組蛋白作為流感疫苗候選物具有良好的安全性和機體耐受性，對預(yù)防甲型流感有效。

鞭毛蛋白與異源抗原重組融合可增強抗原的免疫原性，刺激病原微生物產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答［17］。有研究將鼠疫桿菌的兩種保護性抗原（F1和V蛋白）融合至鞭毛蛋白的高變區(qū)，重組鞭毛蛋白-F1-V 蛋白可被TLR5識別，通過NK-κB途徑刺激促炎細胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等）的產(chǎn)生，免疫小鼠和非人靈長類動物后，可產(chǎn)生較強的抗F1和抗V體液免疫應(yīng)答［18］?；谂R床前研究結(jié)果，研究者對鞭毛蛋白-F1-V 重組融合蛋白在人體中的安全性、免疫原性和耐受性進行評估，進入Ⅰ期臨床試驗。另有研究表明，融合蛋白可增強過敏原特異性免疫治療的療效［19］。將樺樹花粉的主要過敏原Betv1 與鞭毛蛋白融合，對其適用性的研究結(jié)果顯示，該融合蛋白對T細胞具有更強的刺激性和降低IgE 結(jié)合的能力［20］。對Betv1 介導(dǎo)的細胞因子分泌代謝機制的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK介導(dǎo)的NF-κB和雷帕霉素機械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信號的激活是融合蛋白疫苗產(chǎn)生促炎和抗炎癥細胞因子的關(guān)鍵途徑［21］。有研究表明，細菌鞭毛蛋白與抗體αCD40融合，能與病毒或白血病特異性抗原結(jié)合，促進樹突狀細胞成熟；且該融合蛋白制備的多功能抗體能同時將抗原和佐劑輸送至CD40+DCs，誘導(dǎo)肽特異性T細胞反應(yīng)［22］。

鞭毛蛋白無論是制備為融合蛋白，還是與其他抗原共同作用，均顯示出較好的免疫效果［23］。另外，鞭毛蛋白還能通過病毒樣顆粒方式進行免疫，保護疫苗抗原，發(fā)揮其免疫佐劑效應(yīng)［24-26］。

3.3 鞭毛蛋白作為黏膜佐劑 黏膜免疫反應(yīng)是抵御許多細菌和病毒感染的第一道防線［27］，特別是在預(yù)防呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道感染等方面［28］。鞭毛蛋白作為一種有效的黏膜佐劑廣泛應(yīng)用于流感、痘病毒病、艱難梭菌病、空腸弧菌腸炎、鏈球菌感染和惡性瘧原蟲病等疫苗的研發(fā)［29］。研究表明，鞭毛蛋白可引起上皮細胞中NF-κB 的抑制劑快速降解，是一種比脂多糖更有效的上皮細胞激活劑［30］。鞭毛蛋白在黏膜表面固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活中發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)（包括一氧化氮、IL-6、IL-8 等），對病原體的入侵具有抵御作用。用純化滅活銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）鞭毛蛋白對PA 肺炎模型小鼠進行鼻內(nèi)黏膜免疫，結(jié)果表明，鞭毛蛋白對肺黏膜固有免疫具有強烈的刺激作用，提高了細菌清除率，降低了肺泡通透性，對氣管內(nèi)PA 誘導(dǎo)的致死性攻擊具有顯著保護效果［31］。另外，在對新生兒肺移行性樹突狀細胞成熟和激活的研究中也發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白具有固有性免疫調(diào)節(jié)作用，在增強肺抗原呈遞細胞活性方面具有獨特功效，可誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子，是早期經(jīng)鼻黏膜接種疫苗最具希望的靶點［32］。

3.4 鞭毛蛋白作為抗腫瘤疫苗佐劑 鞭毛蛋白以多種方式參與抗腫瘤免疫［33］，已作為一種治療腫瘤的輔助藥物廣泛應(yīng)用于腫瘤疫苗的研發(fā)［34-37］。研究發(fā)現(xiàn)，光動力療法與鞭毛蛋白佐劑腫瘤疫苗聯(lián)合應(yīng)用治療惡性黑色素瘤是一種安全可行的組合療法［35］。通過TLR5 發(fā)揮作用的鞭毛蛋白可誘導(dǎo)促炎基因和抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄表達，觸發(fā)先天免疫，增強了抵抗程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）介導(dǎo)的抑制黑色素瘤作用。有研究開發(fā)了一種調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的納米刺激劑，是由創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白B 與載有IR 780 的透明質(zhì)酸硬脂胺膠束結(jié)合而成，通過抑制免疫調(diào)節(jié)細胞和增加CD103+遷移樹突狀細胞的比例來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強疫苗特性［36］。這種組合策略甚至可應(yīng)用于老年患者，拓寬了該免疫治療策略的臨床應(yīng)用范圍。

另外，已有研究在動物模型中檢測了抗腫瘤劑TLR 激動劑的抗腫瘤活性，且部分研究已進入臨床試驗［37］。將鞭毛蛋白與刺激伴侶分子Flagrp170 共同免疫，通過其與NLRC4 結(jié)合，可成為一種新的免疫藥物，增強免疫活性，能夠重塑腫瘤免疫表型，并克服耐藥性［37］。

4 鞭毛蛋白作為佐劑的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的免疫佐劑存在多種缺點，受到諸多限制，如部分佐劑在動物模型中的效果有限，且價格昂貴，不利于大規(guī)模生產(chǎn)［38-39］。鞭毛蛋白不僅能有效刺激機體產(chǎn)生固有和適應(yīng)性免疫，還能提高疫苗的穩(wěn)定性，抵御輻射、化學(xué)物質(zhì)和病原體等各種傷害，避免宿主自身超敏反應(yīng)［40-41］。HONKO 等［42］研究表明，鞭毛蛋白可促進針對鼠疫桿菌抗原的強烈體液免疫反應(yīng)，增強抗原提呈細胞對外源抗原的攝取、加工和提呈能力，且可對接種致死劑量鼠疫桿菌的小鼠提供有效保護；該研究還用鞭毛蛋白免疫食蟹猴，未發(fā)現(xiàn)局部或全身的炎癥反應(yīng)，免疫小鼠時僅肺部產(chǎn)生微弱的炎癥反應(yīng)。另外，鞭毛蛋白作為免疫佐劑的關(guān)鍵優(yōu)勢是能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜IgA保護宿主，這也是防止黏膜表面局部感染的重要因素之一［43］，且較小劑量的鞭毛蛋白仍有效。WEIMER等［44］采用OprF311-341-OprI-鞭毛蛋白免疫靈長類動物，發(fā)現(xiàn)當(dāng)劑量低至1 μg時，也能獲得較高的抗OprF-IgG、抗OprI-IgG 和鞭毛蛋白抗體滴度。目前該項研究已進入Ⅰ期臨床試驗階段，但結(jié)果尚未公布。鑒于上述結(jié)論，采用極低劑量的鞭毛蛋白融合蛋白（如1～10 μg）可較大程度避免副作用的發(fā)生。

5 小結(jié)

近年，許多微生物成分被用作疫苗佐劑，以增強免疫原性較差疫苗的免疫應(yīng)答，取得了較理想的效果。鞭毛蛋白是一種非常有效的免疫反應(yīng)刺激劑，也是一種安全的佐劑。鞭毛蛋白作為疫苗佐劑的使用，除TLR5 和NLRC4 兩條機制外，其他涉及哺乳動物的炎癥感知和免疫調(diào)節(jié)受體或途徑機制尚未明確。相信隨著這些問題的深入研究，鞭毛蛋白作為有效佐劑的應(yīng)用前景會更加廣闊。