動物細胞培養(yǎng)基質片狀載體的研究及應用進展

馬春英，王美皓 綜述，馬忠仁，王家敏 審校

1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730010；4.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030

從1962年Capstick等成功進行BHK21細胞的懸浮培養(yǎng)開始，動物細胞進入了規(guī)?；a階段，發(fā)展至今已成為生物醫(yī)學領域研究和應用中廣泛采用的技術方法［1］。動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)技術主要是指在控制溫度、溶氧、pH、流體動力學、營養(yǎng)物質和代謝產物濃度等參數條件下，依附于生物反應器的懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。而動物細胞貼壁培養(yǎng)作為分泌產物（如重組蛋白和病毒）等生物制品規(guī)模化生產的基本技術支持，其大規(guī)模培養(yǎng)技術一直是業(yè)內研究和關注的焦點，尤其對大規(guī)模培養(yǎng)基質載體技術的開發(fā)和實施，從20世紀50年代至今未停止過［2-3］。

作為細胞培養(yǎng)基質，其材料需具有物理結構簡單、有效的高表面積和機械穩(wěn)定性、不含動物源性成分、耐高壓性和化學及生物惰性等特性。目前市售的細胞培養(yǎng)基質主要包括離子交換交聯葡聚糖、纖維素、玻璃纖維、膠原蛋白、明膠、海藻酸鈣、聚乳酸-乙醇酸、三甲基銨包被聚苯乙烯、聚氨酯、聚賴氨酸／氟碳乳液以及聚酯纖維等天然高分子材料［4-5］，而以聚酯纖維高分子材料為基質的片狀載體作為動物細胞高密度培養(yǎng)的一種有效載體之一，在疫苗生產、細胞治療和組織工程等不同醫(yī)療應用中具有重要意義。

片狀載體又稱紙片載體或大載體，主要是由醫(yī)用級高分子化合物聚酯纖維［聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）］通過靜電超聲波紡絲技術熱黏合加工成多孔結構的無紡布基材，進一步經焊接、成型、清洗和表面改性處理等工藝后，制備的用于貼壁依賴型細胞和懸浮細胞培養(yǎng)的片狀固體支持生長基質［6-7］。目前，結合填充床生物反應器的片狀載體技術高密度灌注培養(yǎng)模式，在生物制品研發(fā)和實際生產中得到了廣泛應用［8］。本文從片狀載體的研究現狀、基質材料的合成構建、材料表面基質的設計、細胞培養(yǎng)環(huán)境系統(tǒng)以及在不同醫(yī)療制品生產中的應用等方面作一綜述，為后期片狀載體的繼續(xù)研發(fā)以及選擇片狀載體進行規(guī)?；a提供參考。

1 片狀載體的研究現狀

從20 世紀80 年代至今，在片狀載體的研究、應用和銷售領域，國外一直保持領先地位，已研制出各種不同類型的片狀載體。1976年，SPIER等［9］利用纖維圓形片狀載體（Fibra-Cel disks）成功實現了BHK-21 細胞的培養(yǎng)。之后各種不同類型的片狀載體相繼出現，見圖1。這些載體材料相似，僅形狀和結構有所不同，主要分為以聚丙烯（polypropylene，PP）為支架的聚酯圓片載體，如纖維圓片載體（Fibra-Cel disks）［10-11］，以及由100%聚酯纖維制成的各種不同形狀的片狀載體，如多層菱形纖維載體（BioNOCⅡ?）和各種微型聚酯片狀載體等［12-16］。由于結合填充床生物反應器灌注培養(yǎng)模式的片狀載體技術避開了傳統(tǒng)球狀微載體的不足，自動化程度高且經濟實惠，一出現便迅速搶占市場。如德國Eppendorf 公司的Fibra-Cel disks結合New BrunswickTMCelliGen?生物反應器，可從0.7 L至150 L 進行動物細胞大規(guī)模商業(yè)化生產。中國臺灣CESCO 公司的BioNOCⅡTM多層片狀載體結合Tide Cell?生物反應器，可從500 mL小試規(guī)模放大至5 000 L的生產規(guī)模，是世界上唯一一款可進行大規(guī)模細胞收獲的培養(yǎng)系統(tǒng)［12］。

圖1 不同類型片狀載體Fig.1 Different types of fibracel carriers

由于國內動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術起步較晚，規(guī)?；a能力和技術創(chuàng)新實力相對較弱，在片狀載體的研發(fā)及生產上一直處于起步階段，尤其載體原材料受限，主要依賴進口。因此，國內生物制藥領域急需加快片狀載體原材料的研發(fā)及生產。上海楚鯤生物科技有限公司、中生天信和生物科技有限公司、蘭州百靈生物技術有限公司及武漢賽科成科技有限公司等也一直在開展片狀載體的研究工作。其中中生天信和生物科技有限公司宣稱開發(fā)了從原材料、關鍵技術到核心工藝全面國產化的產品編碼為ZT 的Cellcomb 載體，擺脫了一直以來片狀載體高度依賴進口的“卡脖子”困境［13］。

2 片狀載體的性能

片狀載體作為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的載體基質，其良好的生物相容性以及細胞培養(yǎng)效果主要由載體材料的表面性能和基于載體的整個培養(yǎng)環(huán)境的提供及優(yōu)化共同組成。

2.1 合成構建依據 作為細胞培養(yǎng)基質材料，最基本的條件就是蛋白質吸附。而吸附蛋白層的組成和結構取決于材料表面的化學和物理性質，以及細胞響應和黏附強度。細胞的黏附是由整合素引起。整合素是一種位于細胞膜上的受體蛋白，其與被吸附的蛋白層相黏附，之后，由于應力纖維（肌動蛋白絲）的形成，細胞開始擴散和增加表面接觸面積，最后形成細胞附著點，從而引起細胞的黏附及生長。而片狀載體作為哺乳動物細胞體外培養(yǎng)基質，其合成構建的研究方向主要集中在材料的各種理化性質等表面特性的優(yōu)化以及不同形態(tài)的研究及開發(fā)，包括表面化學結構、電荷分布、孔徑大小和表面粗糙度等均能影響細胞貼壁和黏附效果。適度親水性的材料更有利于誘導細胞黏附［17］，材料表面引入羰基（-C=O）、羧基（-COOH）和羥基（-OH）等含氧基團，可改善其與細胞的生物相容性；而含氮基團的引入不僅能改善親水性，還能影響材料表面電荷分布以及與細胞膜上蛋白質肽鏈產生相互作用等，從各個角度促進細胞的黏附生長［18］。粗糙表面有利于生物膜的迅速再生長，更有利于細胞的貼壁黏附［19］。多孔結構有利于營養(yǎng)物質的滲透和細胞正常代謝，也對細胞的黏附生長有積極作用，且孔徑的大小對細胞生長也有影響，如用不同孔徑尼龍網培養(yǎng)3T3 成纖維細胞，小孔徑尼龍網的細胞量遠高于大孔徑尼龍網［20］。因此，載體基質材料表面條件的優(yōu)化與重組，一直是其合成制備工藝中的重要組成部分。

2.2 表面基質優(yōu)化 聚酯纖維類聚合物PET 作為片狀載體的主要材料，其形成的3D 網狀空間立體結構織物具有良好的耐酸堿、耐熱性及無毒、不可生物降解等特點，剛度適中、柔韌性好，對高流體應力有很好的耐受性。對于細胞培養(yǎng)而言，是一個極具經濟效益和良好結構優(yōu)勢的基質材料［16］。主要缺點為疏水性強，表面能低，不具備細胞識別位點，影響細胞黏附及生長［21］。需進行一定的表面改性修飾以增強其生物相容性和細胞親和性。目前文獻報道最多的表面改性方法主要有化學法、常壓等離子體法和輻射接枝法等。其中，運用最多的為化學接枝法和常壓等離子體法。如OZAKI 等［22］通過1-乙基-3-（二甲氨基丙基）鹽酸碳二亞胺交聯水溶劑將凝集素I（ulex europaeus I，UEAI）與PET 共價結合，實現了低聚糖介導的內皮細胞的特異性黏附；DESAI 等［23］在PET 表面共價結合強親水性聚乙烯氧化物（polyethylene oxide，PEO）改善其親水性；PET 也可在堿性溶液中部分水解，使表面基團轉變產生羥基，與乙二胺反應引入胺基，通過親水性基團的含量提高細胞生物相容性［17］；TURKOGLU 等［24］通過低壓H2O／O2等離子體處理NWPE（non-woven polyethylene）無紡布，使牙周韌帶成纖維細胞的增殖和活力均獲得改善；劉偉等［16］通過氬氣等離子體處理在PET 支架上接枝與肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）特異性結合的L-NH2半乳糖內酯配體，使支架表面產生胺基和羧基等基團調節(jié)其細胞生物相容性，有效促進肝細胞的黏附、增殖、高密度生長和分化；利用氬氣等離子體將碳納米顆粒（carbon nano particles，CNPs）接枝到PET 表面，也可增強血管平滑肌細胞的黏附及增殖［25］；而Fibra-Cel disks 載體通過甲醇清洗和靜電技術處理后，產生了凈結合電荷，使細胞流過載體時截獲至內部纖維并貼附生長，從而增強細胞的黏附及生長［7］。另外，還可通過輻射引起PET 表面大分子的降解生成自由基，而參與接枝的單體同時受輻射引發(fā)，與大分子鏈上的自由基產生接枝反應；如用激光束照射處理PET，通過增加極性基團而提高PET 的極性，從而修飾其表面特性［26］。

2.3 細胞培養(yǎng)微環(huán)境 以聚酯纖維為基質的片狀載體作為細胞生長基質的新選擇廣泛應用于各種細胞規(guī)?；囵B(yǎng)，除了材料表面基質優(yōu)化設計誘導細胞黏附生長，還主要依賴于載體自身宏觀的結構特點以及在不同類型生物反應器中培養(yǎng)細胞時提供的培養(yǎng)環(huán)境。

首先，就載體本身而言，高表面積與體積比為細胞貼附和生長提供了更多的有效面積，如Fibra-Cel disks 載體有效面積為1 200 cm2／g，BioNOCⅡTM多層片狀載體可達2 400 cm2／g，其三維立體空間結構和高孔隙率，在細胞培養(yǎng)過程中形成吸附面和保護層，減少了載體內擴散限制，可對細胞進行高效的捕獲及吸附，使細胞均能貼附在片狀載體的表面和內部纖維上生長。見圖2。固定在反應器罐內的片狀載體相互堆積，貼附在載體上的細胞可遷移至臨近載體上增加其相互作用，使片狀載體不僅對細胞的接種密度要求低，還使細胞的貼附和生長迅速［27-29］；一般以1×106cells／mL 的初始密度接種，片狀載體在15 ～60 min 即可迅速完成貼附，且?guī)缀跛匈N壁細胞均能在片狀載體上生長，除一般貼壁細胞外，更有利于如MRC-5 和293T 細胞等一些黏附性較低，難以附著的細胞培養(yǎng)［30］。目前成功用于片狀載體的細胞有123A、127A、GAMMA、67-9-B、DA4-4、3T3、Tn-368、Sf9、rSf9、Hi-5、Vero、MDCK、HEK293、BHK、ST、MRC-5、COS、CHO 細胞及小倉鼠腎細胞、基質細胞、肝細胞和人成纖維細胞等［31-35］。

圖2 片狀載體3D模擬及細胞生長圖Fig.2 3D simulation and cell growth diagram of fibracel carriers

其次，片狀載體培養(yǎng)系統(tǒng)主要是指在控制溫度、溶氧、pH、流體動力學、營養(yǎng)物質和代謝產物濃度等參數條件下，為細胞生長提供極具生理學特性的微環(huán)境。目前主要依靠籃式生物反應器、潮汐式生物反應器和激流式生物反應器等填充床生物反應器完成，這些反應器的設計主要針對載體固定化與懸浮、床層等各種培養(yǎng)方式之間的相互關系。如籃式生物反應器配有提升槳，通過提升槳旋轉產生離心力將細胞培養(yǎng)液從溢流口甩出，致使攪拌槳內部的導管形成負壓并產生吸力，將罐體底部的培養(yǎng)液吸入導管內。而從溢流口流出的培養(yǎng)液自上而下流穿床層內固定的載體，從而實現培養(yǎng)液載體罐體內的循環(huán)。導管底部設置有氣體分布器，培養(yǎng)基在導管內部獲得氧氣供應，并避免通氣產生的泡沫與細胞接觸。提升槳頂部增設消泡腔，對導管內產生的泡沫進行收集并消除，有效降低了因機械攪拌以及泡沫破裂產生的剪切力。激流式生物反應器采用分體設計，分為激流細胞培養(yǎng)袋和灌注細胞培養(yǎng)袋兩部分，載體置于灌注細胞培養(yǎng)內，通過表層通氣方式進行無泡通氣，再通過振蕩器振蕩細胞培養(yǎng)袋產生激流，增加氣液接觸面和液體混合性能，在最大振蕩速度［120 r／（min·kLa）］下，混合培養(yǎng)液通過蠕動泵泵入灌注細胞培養(yǎng)袋中，為細胞提供營養(yǎng)物質，而流穿的培養(yǎng)液回流至激流細胞培養(yǎng)袋中，往復循環(huán)培養(yǎng)。而潮汐式反應器同樣采用分體式設計，反應器分為儲液罐和載體罐，片狀載體裝填于載體罐。通過對儲液罐中正壓或負壓的控制，將培養(yǎng)液周期性地從儲液罐壓入載體罐并浸潤片狀載體，再吸回至儲液罐使載體暴露空氣中。當培養(yǎng)液浸潤載體時，細胞吸收培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質，當載體暴露于空氣中時，細胞獲得空氣中氧氣。儲液罐采用表層通氣，通過攪拌的方式進行混合［23］。這些填充床生物反應器的獨特設計，在細胞規(guī)?；囵B(yǎng)過程中降低剪切應力對細胞毒性效應的同時，還有效擴大了細胞產量。一般填充床生物反應片狀載體的裝載量可達30 ～40 g／L，收獲的細胞量高達108cells／mL［36］。另外，再結合灌注培養(yǎng)模式，使細胞在培養(yǎng)過程中實現高效的氧傳遞效率和營養(yǎng)物質的及時補充，以及代謝產物的及時去除，從而使細胞在培養(yǎng)過程中實現持續(xù)的高密度和高活力生長，通?？沙^1 ～2個月，并且不會發(fā)生堵塞的風險［34］。

3 片狀載體應用

隨著生物制藥領域的不斷發(fā)展，以動物細胞為基質的生物制品的規(guī)?；a對當代生物技術的發(fā)展具有極其重要的意義。而片狀載體作為提供哺乳動物及昆蟲細胞生長的一種固體支持基質，除用于前期實驗研究和商業(yè)生產中動物細胞的規(guī)模化培養(yǎng)外，主要還應用于以下幾個方面。

3.1 在疫苗生產中的應用 疫苗作為預防和控制傳染病爆發(fā)最有效的手段，在公共衛(wèi)生防護安全中具有重要作用。細胞源病毒疫苗的生產作為疫苗生產的主要方法，需要高密度細胞來實現更高的疫苗生產水平。片狀載體培養(yǎng)系統(tǒng)為高滴度病毒疫苗生產提供了一個理想平臺。其高密度和高活力細胞灌注培養(yǎng)模式，不僅為病毒擴增提供了相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，還延長了病毒培養(yǎng)時間并增加了收獲量，在一定程度上減小了批間差異、縮小了生產空間和時間，在降低經濟投入的同時保證了產品均一性［33］。而由于載體對細胞有一定的截留作用，在獲取細胞收獲液時，無需采用旋轉過濾器或沉降柱等細胞截留裝置，使收獲液中的細胞、宿主蛋白和DNA 含量降低，相較于其他培養(yǎng)系統(tǒng)，更有利于下游純化，可降低整體疫苗生產的成本［36］。

另外，大規(guī)模生產疫苗需要大量種子細胞接種培養(yǎng)，若使用轉瓶或細胞工廠進行種子鏈擴增，增加了成本和污染風險。同時，低傳代和高傳代細胞系間的基因表達和表型也存在差異［37］。而片狀載體培養(yǎng)則不存在該方面的困擾，非常有助于擴大疫苗生產的需求，廣泛應用于大規(guī)模病毒疫苗生產。

片狀載體目前已成功用于日本腦炎、流感、牛皰疹、裂谷熱、牛結節(jié)疹、脊髓灰質炎、腎綜合癥出血熱、豬瘟、小反芻動物麻疹、豬腹瀉、桿狀病毒及腺相關病毒的高滴度培養(yǎng)，為疫苗的規(guī)?；a提供了更多的選擇［34-38］。并且，隨著新冠疫情的爆發(fā)，片狀載體技術也被廣泛應用于新冠疫苗的規(guī)?；a，如北京生物制品研究所有限責任公司的SARS-CoV-2全病毒滅活苗就是通過片狀載體制備的［39-40］。

3.2 在治療類生物制品生產中的應用 片狀載體培養(yǎng)技術除了在病毒疫苗生產中具有優(yōu)勢外，在其他多種重組蛋白細胞因子、干擾素、激素、單克隆抗體等的規(guī)?；a中同樣具有優(yōu)勢，包括世界上首個批準上市的基因治療產品“今又生（Gendicine）”就是利用Fibra-Cel disks 載體培養(yǎng)技術制備的［41］。如制備單克隆抗體的雜交瘤細胞天生對代謝廢物堆積比較敏感，獨特的灌注式片狀載體培養(yǎng)可滿足雜交瘤細胞生長的特定需求［40］；而在慢病毒載體制備中，利用片狀載體培養(yǎng)技術不僅可提高PEI 轉染效率，降低PEI 毒性對細胞的持續(xù)影響，還可連續(xù)灌流收獲病毒液，提高病毒收獲液總量，在制備出高滴度慢病毒原液同時，降低了后期純化的壓力，從而提高了慢病毒的質量和產量［33，42］。另外，有研究證明，結合Fibra-Cel disks 載體技術，組織纖維溶酶原激活蛋白等重組蛋白的表達活性相較于傳統(tǒng)微載體可提高十幾倍［32］。

3.3 在組織工程中的應用 人類疾病的細胞治療和組織再生需大量細胞，片狀載體培養(yǎng)技術除了具有生產大量細胞的巨大潛力外，在組織工程和再生醫(yī)學中也具有較廣泛的應用前景，如在干細胞的應用評估以及生物人工肝等各種體外器官模型的構建中，提供比常規(guī)培養(yǎng)更穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境［17］。

大量功能細胞的生產一直是臨床應用的一大挑戰(zhàn)，尤其是干細胞，如骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）體外擴增培養(yǎng)后，會表現為表型改變、細胞缺失及快速老化［43］。因此，干細胞穩(wěn)定的體外放大培養(yǎng)方法成為近年來再生醫(yī)學領域關注的一個重要課題。而一般廣泛應用于干細胞研究的大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)主要是T 型燒瓶和旋轉燒瓶，雖然是一種可行和簡單的培養(yǎng)方法，但在控制pH 值、氧壓力、代謝活性等，以及可擴展性方面是有限的。

因此，片狀載體培養(yǎng)技術在干細胞的應用評估中具有重要意義。有研究表明，在Fibra-Cel disks 片狀載體上，干細胞（如MSCs）可分泌廣泛的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），并能更好地保持其莖干性和增殖潛力的固有特性，可用于大規(guī)模的人造血干細胞擴張［42］；而由纖維連接蛋白（fibronectin，FN）共軛的片狀載體支架（polyethylene terephthalate，PET），可實現人造血干細胞（hematopoietic stem cells，HCS）的體外擴增［43］；TSAI等［44］也證明，Fibra-Cel disks載體在500 mL一次性生物反應器中可擴增產生（4.15 ±0.81）×108個／mL人類臍帶血來源的骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）。

另外，VENTRE 等［45］利用片狀載體基質PET 薄膜制成一種用于哺乳動物細胞高密度貼壁培養(yǎng)的可伸縮滾轉支架（roll support，RS），實現了小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）的成功培養(yǎng)等。因此，隨著現代生物技術的飛速發(fā)展，片狀載體在組織工程和再生醫(yī)學中將會展示出更高的應用價值。

4 展望

如今市面上超過一半的治療性生物制品均是通過動物細胞生產的，而以動物細胞為基質的疫苗生產更被認定為現代疫苗技術的支柱。因此，快速實現各種動物細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)是現代生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點。

以高分子材料聚酯纖維為基質的片狀載體技術已成為大規(guī)模生產細胞的關鍵技術手段之一，廣泛用于疫苗生產、細胞治療和組織工程等不同醫(yī)療應用中［46-47］。但片狀載體仍存在一些有待解決的問題，如不可重復利用；在培養(yǎng)過程中無法實時監(jiān)測細胞生長狀態(tài)，且細胞位于纖維微結構深處，營養(yǎng)物質和氧氣供應不充分，細胞生長不均勻；不易消化；由于載體自身對細胞的截留，使細胞收獲不完全等［35-36，48］?？傊瑺钶d體在生物制品生產應用中具有巨大的優(yōu)越性，如何攻克其弊端和缺點，有待進一步研究。

目前我國在片狀載體技術上的研發(fā)雖初有成效，但在原材料的精細化研究以及更高層次的規(guī)?；瘧醚芯可先悦媾R巨大挑戰(zhàn)。這一挑戰(zhàn)不僅體現在優(yōu)化出具有良好生物相容性、促使細胞黏附生長等的載體原材料本身的結構特點，還包括與其相匹配的生物反應器的理想設計，在保證良好生物相容性的同時，提供與生理學相關的培養(yǎng)環(huán)境是片狀載體技術成功的關鍵。而這一難題，除了材料科學，還需生物工程、流體力學和分析化學等綜合學科的介入。本文從片狀載體的研究現狀、載體特性以及應用方面進行了詳細介紹，以便了解片狀載體目前的研究狀況及今后發(fā)展趨勢，為片狀載體技術的繼續(xù)研發(fā)以及生產上的應用提供參考。