水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的研究進(jìn)展

孫耕天，任金娜 綜述，錢明 審校

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021

近年來(lái)，水凝膠在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其具有類似組織的機(jī)械性能、高吸水性以及良好的生物相容性，因此適用于生物醫(yī)學(xué)。而組織生物工程學(xué)的主要目標(biāo)是模仿細(xì)胞外基質(zhì)再生受損組織，由于水凝膠具有良好的孔隙率和極為親水的3D結(jié)構(gòu)，在攝取大量的水或液體時(shí)溶脹而不溶解，是組織生物工程學(xué)中良好的細(xì)胞載體或基質(zhì)。但當(dāng)細(xì)胞以水凝膠為載體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，水凝膠需與外界培養(yǎng)基進(jìn)行物質(zhì)交換，進(jìn)而保證細(xì)胞的活力及生長(zhǎng)，行使其相應(yīng)功能，如藥物輸送［1-2］、修復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)［3］、3D 打印［4］等，而兩者的交換方式及影響因素尚不成熟。

本文對(duì)影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素及其兩者的交換方式作一綜述，以期為組織生物工程的發(fā)展和研究提供參考。

1 水凝膠的種類

水凝膠是由1 個(gè)或多個(gè)單體簡(jiǎn)單反應(yīng)產(chǎn)生的水膨隆和交聯(lián)聚合物的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其較強(qiáng)的親水特性取決于附著在高分子鏈上的親水官能團(tuán)，而對(duì)溶解的抵抗能力來(lái)自于網(wǎng)絡(luò)鏈之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)［5］。“水凝膠”一詞最早由Lee，Kwon 和Park 于1894 年在文章中提出，但最早對(duì)水凝膠特性進(jìn)行系統(tǒng)性描述并開(kāi)發(fā)聚甲基丙烯酸羥乙酯［poly（hydroxyethyl methacrylate），PHEMA］水凝膠是Wichterle 和Lim 于1960年在文獻(xiàn)中發(fā)表的，主要目的是使其與人體組織產(chǎn)生永久聯(lián)系，如隱形眼鏡的生產(chǎn)［6］。從那時(shí)起，水凝膠被廣泛應(yīng)用于藥物控制給藥系統(tǒng)［7］、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為細(xì)胞載體和生物分子［8］、洗滌劑的開(kāi)發(fā)、農(nóng)業(yè)、食品業(yè)以及其他領(lǐng)域［9］。水凝膠根據(jù)不同的基礎(chǔ)分類如下。

1.1 根據(jù)來(lái)源分類

1.1.1 天然高分子水凝膠 天然高分子水凝膠主要包括：蛋白質(zhì)類（膠原蛋白、明膠、蠶絲蛋白、纖維蛋白等）和多糖類（殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、瓊脂糖等），其優(yōu)點(diǎn)是由于與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成相似，具有良好的生物相容性、不刺激炎癥和排斥反應(yīng)，且具有良好的力學(xué)性能［10］；缺點(diǎn)為大多數(shù)天然聚合物的強(qiáng)度和韌性較差，不能滿足相關(guān)醫(yī)學(xué)要求［11］。

1.1.2 合成高分子水凝膠 合成高分子水凝膠是指將兩種或兩種以上的天然聚合物相互絡(luò)合而形成的水凝膠，包括PHEMA、聚丙烯酰胺（polyacryla-mide，PAM）、聚乙烯醇［poly（vinyl alcohol），PVA］、聚乙二醇（polyethylene，PEG）及其衍生物等各種高分子材料［12］。復(fù)合水凝膠將不同聚合物的優(yōu)點(diǎn)有效組合，相比天然高分子水凝膠，具有高吸水性、良好的生物相容性及生物降解性、有效期長(zhǎng)以及凝膠強(qiáng)度有所增加及其他功能［13］。

1.2 根據(jù)聚合物的組成分類

1.2.1 均聚水凝膠 由單一單體衍生的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成的基本網(wǎng)絡(luò)單元。其性質(zhì)由單體的性質(zhì)和聚合技術(shù)所決定［14］。

1.2.2 共聚水凝膠 由兩種或兩種以上具有至少1種親水性組分的不同單體所構(gòu)成，沿聚合物鏈以隨機(jī)、塊狀或交替結(jié)構(gòu)排列［15］。

1.2.3 互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠 由兩種或兩種以上聚合物交聯(lián)合成或天然聚合物組分制成，分子鏈相互貫穿，至少由1 種聚合物通過(guò)化學(xué)鍵的方式交聯(lián)而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，又稱互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)?；ゴ┚酆衔锞W(wǎng)絡(luò)具有兩種形式［13］：①半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)：一種聚合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)生交聯(lián)，而另一種聚合物與其發(fā)生物理結(jié)合而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；②全互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)：一種聚合物發(fā)生交聯(lián)后，另一種聚合物與其聚合物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)從而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.3 根據(jù)交聯(lián)類型分類

1.3.1 物理水凝膠 交聯(lián)過(guò)程通過(guò)疏水締合、鏈聚集、聚合物鏈絡(luò)合離子和氫鍵等物理過(guò)程形成的凝膠，其構(gòu)象的變化具有可逆性。

1.3.2 化學(xué)水凝膠 通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵等交聯(lián)過(guò)程形成的水凝膠，其構(gòu)象的變化具有永久性和不可逆性。

1.3.3 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠 由物理和化學(xué)交聯(lián)過(guò)程形成的水凝膠在靜電相互作用下形成的。相對(duì)于物理或化學(xué)水凝膠的性質(zhì)而言，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有更強(qiáng)的液體吸收能力及對(duì)pH 變化更加敏感［16］。傳統(tǒng)聚合物水凝膠通常強(qiáng)度弱、機(jī)械性能差，其斷裂能較低，一般在1 ～10 J／m2的范圍內(nèi)［17］；而一般情況下，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的斷裂能為100 ～1 000 J／m2［18］，因此，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠特有的結(jié)構(gòu)可改善水凝膠的性能。

水凝膠基于在不同基礎(chǔ)上分類方法眾多，除上述分類方法外，還可根據(jù)其結(jié)構(gòu)（即結(jié)晶式、非結(jié)晶式或半結(jié)晶式）、網(wǎng)絡(luò)電荷的有無(wú)（包含中性、離子、兩性電解質(zhì)或兩性離子）、外觀等進(jìn)行分類［19］。

2 水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的影響因素

細(xì)胞培養(yǎng)是組織工程學(xué)中最常用且重要的研究方法之一，其技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的研究成果至關(guān)重要。水凝膠具有高滲透性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和細(xì)胞代謝廢物的排放，這對(duì)維持細(xì)胞的生存和功能必不可少［20-24］。水凝膠可為細(xì)胞培養(yǎng)與增殖提供適宜且溫和的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）環(huán)境［25］，而培養(yǎng)基中主要包含各種氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素以及其他輔助物質(zhì)，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)其生長(zhǎng)與增殖。因此，水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性是決定細(xì)胞能否存活與增殖的關(guān)鍵因素之一，而影響其交換方式的因素更為重要。

2.1 水凝膠與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散類型

ALFREY 等［26］通過(guò)培養(yǎng)液的擴(kuò)散速率和水凝膠中聚合物的松弛速率將擴(kuò)散分為兩大類型：Fickian（CaseⅠ）型和Non-Fickian（CaseⅡ和不規(guī)則型）型。當(dāng)擴(kuò)散時(shí)間為t時(shí)，單位面積聚合物所吸收的溶劑量（Mt）為ktn（k 為常數(shù)，n 為與擴(kuò)散機(jī)理有關(guān)的一個(gè)參數(shù)，一般在1／2 ～1 之間）。該公式可用來(lái)描述任意溫度下高分子聚合物體系中的溶劑擴(kuò)散行為。

2.1.1 Fickian 擴(kuò)散 在穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散的條件下，單位時(shí)間內(nèi)與擴(kuò)散方向相垂直的單位面積內(nèi)的擴(kuò)散物質(zhì)流量（擴(kuò)散通量）與該橫截面積處的濃度梯度成正比，即濃度梯度越大，擴(kuò)散通量越大。Fickian 擴(kuò)散的特征為在溶脹過(guò)程中小分子的擴(kuò)散速率明顯小于高分子結(jié)構(gòu)的松弛速率。因此，水凝膠中溶劑的濃度存在較大的濃度梯度，從聚合物溶脹區(qū)到聚合物中心部位溶劑濃度分布呈指數(shù)衰減。溶劑的擴(kuò)散距離與時(shí)間的平方根呈正比：Mt=kt1／2。

2.1.2 Non-Fickian 擴(kuò)散 在非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過(guò)程中，擴(kuò)散物質(zhì)的濃度隨時(shí)間的變化而發(fā)生變化。Non-Fickian 型擴(kuò)散可分為兩種：一種為CaseⅡ型擴(kuò)散：在溶脹過(guò)程中，溶劑的擴(kuò)散速率大于聚合物網(wǎng)絡(luò)的松弛速率，擴(kuò)散的距離與時(shí)間成正比，即Mt= kt，但溶劑向高分子聚合物中心擴(kuò)散時(shí)，存在一段呈現(xiàn)Fickian擴(kuò)散濃度特征的誘導(dǎo)時(shí)間［27］；另一種為非常規(guī)擴(kuò)散：在此狀態(tài)下，溶劑的擴(kuò)散速率與高分子聚合物的松弛速率在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，擴(kuò)散距離與時(shí)間的關(guān)系為：Mt=ktn（1／2 ＜n ＜1）。

研究水凝膠與培養(yǎng)基物質(zhì)擴(kuò)散的類型對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)、藥物的傳遞與釋放等功能起著前瞻性和重要的作用。

2.2 影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素

細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)外界環(huán)境的要求較高，首先要求具備無(wú)菌、無(wú)毒的培養(yǎng)環(huán)境，其次要具有充足的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素、無(wú)機(jī)離子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最后還需具備適宜的pH、溫度、滲透壓以及合適的氧氣和二氧化碳［28］。在此基礎(chǔ)上，還需了解影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素，這也是決定細(xì)胞能否存活與繁殖的關(guān)鍵因素之一。

2.2.1 Michael 加成型反應(yīng) Michael 加成型反應(yīng)又稱1，4 型加成反應(yīng)，該反應(yīng)發(fā)生在親核試劑（如胺、硫醇等）和不飽和羰基化合物（如醛、酮等）之間。ELBERT 等［29］是第1批開(kāi)發(fā)并利用Michael 加成型反應(yīng)制備水凝膠的研究者。其使用多丙烯酸聚乙二醇與聚乙二醇二硫醇交聯(lián)制備水凝膠，探究運(yùn)送蛋白質(zhì)的可能性，結(jié)果表明，從凝膠基質(zhì)中釋放蛋白質(zhì)超過(guò)12 d。LUTOLF等［30］觀察到，當(dāng)硫醇基團(tuán)附著在多肽鏈上時(shí)，凝膠的形成具有不同的動(dòng)力學(xué)。PHELPS等［31］研究了聚乙二醇-4-馬來(lái)酰亞胺在離體心臟中的原位應(yīng)用，該水凝膠形成迅速，能夠與周圍組織很好地黏附，組織滲透率高達(dá)50 μm。

因此，Michael 加成型反應(yīng)對(duì)于水凝膠與培養(yǎng)基滲透性具有輔助增強(qiáng)效果。但由于親核試劑中胺、氰離子、鹵離子等帶來(lái)因環(huán)境、溫度以及毒性產(chǎn)生的不良影響，硫醇作為主要的優(yōu)選材料，主要原因是Michael加成型反應(yīng)是在生理?xiàng)l件下自發(fā)進(jìn)行的［32-33］。

2.2.2 孔隙度 在凝膠過(guò)程中，相互連接的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于培養(yǎng)基中的溶質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等更有效地向水凝膠中移動(dòng)，促進(jìn)以水凝膠為載體的細(xì)胞更快地生長(zhǎng)和增殖［34］?？紫抖瓤赏ㄟ^(guò)制備水凝膠前后不同的技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)［35］。研究表明，孔隙度較小的水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性越好，因?yàn)樘烊唤M織中的孔隙度是納米級(jí)別的，但具有較大孔隙度的水凝膠對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖需要更長(zhǎng)的時(shí)間［36-37］。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)［38］，相比具有更大或更小孔隙度的水凝膠來(lái)說(shuō)，細(xì)胞在孔徑為0.8 ～8 μm的水凝膠中生長(zhǎng)能力增強(qiáng)。YESILYURT 等［39］發(fā)現(xiàn)，聚合物網(wǎng)絡(luò)之間的孔徑大小對(duì)培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的流動(dòng)性會(huì)造成影響。PRASOPTHUM 等［40］和DALY 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞會(huì)隨著孔隙度的變化而發(fā)生變化。當(dāng)孔徑較小時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)去分化現(xiàn)象；而在較大孔徑的支架中，細(xì)胞停止增殖而分泌ECM 成分。因此，支架中孔徑的大小在水凝膠與培養(yǎng)基滲透性之間起著重要作用。調(diào)節(jié)孔隙度最常用的方法之一是改變交聯(lián)劑的種類以及控制交聯(lián)劑的量［38］，增加交聯(lián)劑的量會(huì)導(dǎo)致更多交聯(lián)的產(chǎn)生，從而使支架的孔徑變小。而增加孔隙數(shù)量的方法有：溶劑澆鑄、顆粒浸出、氣體發(fā)泡以及冷凍干燥等技術(shù)，均會(huì)留下多孔結(jié)構(gòu)。凝膠過(guò)程中支架孔徑的大小還決定培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的釋放效應(yīng)［39］，這對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)更為重要。

2.2.3 交聯(lián)劑的種類與交聯(lián)方式 交聯(lián)劑是構(gòu)成水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也是水凝膠制備過(guò)程中必不可少的成分。水凝膠從液體狀態(tài)轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)主要通過(guò)物理（疏水締合、鏈聚集和氫鍵）或化學(xué)（共價(jià)鍵）交聯(lián)方法實(shí)現(xiàn)［42］。不同交聯(lián)方式的水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性不同，從而導(dǎo)致水凝膠承載的細(xì)胞活性不同［43］。因此，聚合物在水凝膠制備過(guò)程中交聯(lián)劑的使用對(duì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。但由于目前的交聯(lián)劑對(duì)細(xì)胞活性均有一定影響，近年來(lái)學(xué)者們嘗試不同的交聯(lián)方法以及優(yōu)化交聯(lián)過(guò)程，從而促進(jìn)細(xì)胞的活力和生物學(xué)性能。LI等［44］以海藻酸鈉和絲素蛋白溶液為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了雙組分雙交聯(lián)水凝膠，構(gòu)建了中空管道結(jié)構(gòu)及管壁的微孔結(jié)構(gòu)，為毛細(xì)血管的長(zhǎng)入提供更多的空間和通道，從而增加了細(xì)胞的生物學(xué)性能。

2.2.4 其他 除了Michael 加成型反應(yīng)、孔隙度以及交聯(lián)劑之外，學(xué)者們還研究了其他影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素，如剪切速率等。對(duì)于可注射水凝膠，注射器和針頭的剪切速率會(huì)改變水凝膠的黏度，進(jìn)而使水凝膠與培養(yǎng)基的通透性發(fā)生改變。根據(jù)LOPEZ HERNANDEZ 等［45］研究表明，通過(guò)對(duì)剪切速率的提高，使水凝膠的黏度下降，為培養(yǎng)基的物質(zhì)與水凝膠進(jìn)行物質(zhì)交換提供了相對(duì)較低的阻力。

3 小結(jié)

綜上所述，水凝膠和培養(yǎng)基兩者之間的滲透性與Michael 加成型反應(yīng)、孔隙度以及交聯(lián)劑的種類及交聯(lián)方式密切相關(guān)。近年來(lái)，研究者也從三方面進(jìn)行了大量研究與實(shí)驗(yàn)，并取得了較豐碩的成果。但目前仍存在一些問(wèn)題：影響水凝膠與培養(yǎng)基兩者之間滲透性的重疊因素較多，且細(xì)胞活力較為敏感，如何通過(guò)控制單一變量研究?jī)烧咧g滲透性的影響因素是目前面臨的巨大挑戰(zhàn)，今后應(yīng)更加關(guān)注相關(guān)研究。