烯殼氮化鐵納米磁珠用于捕獲肺癌循環(huán)腫瘤細胞的初步研究

馬文博 ， 潘逸群 ， 王群 ， 馬壯 ， 王明連 ， 楊怡姝

1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124；

2.北京工業(yè)大學材料與制造學部，北京 100124

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，40%的肺癌患者有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象［1］，5 年生存率較低［2］，轉(zhuǎn)移是癌癥相關死亡的主要原因［3-4］。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是存在于外周血中各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱［5］，具有在接種于生態(tài)位組織后建立轉(zhuǎn)移性生長的能力，是腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移途徑［6-7］。CTC 的識別、捕獲和分析已成為當前癌癥研究中的關鍵問題［8-9］。但CTC 的半衰期小于3 h［10］，且在數(shù)百萬正常血細胞背景下，CTC的濃度非常低［11-12］，因此，需要開發(fā)專業(yè)化的分選技術。非抗體依賴性的微流體技術分選CTC 存在捕獲率低和純度低的問題［13-14］。在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等腫瘤細胞表面的上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）表達量遠高于正常細胞［15-16］，因此常采用基于EpCAM 抗體的CTC 捕獲方法［17］，但由于樣本量需求大、制備成本昂貴等原因無法普及［18-19］，且現(xiàn)有的免疫磁珠與細胞的生物相容性很低。

王群等［20］報道了一種全新的納米磁珠，即本研究使用的烯殼氮化鐵納米磁珠（graphene-coated iron nitride magnetic beads，G@FeN-MB），該磁珠為多層石墨烯片包覆的氮化鐵納米磁性顆粒。內(nèi)核氮化鐵相較于傳統(tǒng)的氧化鐵磁性材料，既具有與純Fe 相近的飽和磁化強度，又和氧化鐵一樣有很強的抗氧化性和耐腐蝕能力，在應用方面更具優(yōu)勢［21］。外層的石墨烯殼不僅對內(nèi)部的氮化鐵起到抗氧化、耐酸堿等保護作用，還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好和比表面積較高等優(yōu)勢，有利于細胞分選。此前，本課題組利用Hummers 法修飾G@FeN-MB，將其用于T 細胞分選［22］和特異性捕獲假病毒［23］。但Hummers 法利用濃硫酸氧化磁珠，反應過于強烈，容易將表面石墨烯破壞使磁性核漏出，導致殼核結(jié)構(gòu)破壞以及磁性能下降。低溫等離子體法修飾磁珠具有溫和可控的特點，不會對石墨烯殼造成較大破壞，目前在分選細胞領域有較大潛力，但尚未有報道顯示等離子體修飾磁珠在CTC捕獲方面的應用。

本研究擬采用等離子體修飾的不同基團的磁珠分別與鏈霉親和素結(jié)合，由于鏈霉親和素與生物素具有極高的親和力，因此將抗體生物素化偶聯(lián)至鏈霉親和素磁珠進一步制備免疫磁珠，用于捕獲CTC。同時，參照已有研究向小鼠或人血液樣本中添加不同數(shù)量的A549 肺癌細胞［24-26］，以模擬CTC在體內(nèi)的存在情況，進而探討免疫磁珠對CTC 的捕獲能力。

1 材料與方法

1.1 磁性顆粒、細胞和全血

G@FeN-MB：烯殼氮化鐵納米磁珠，由北京工業(yè)大學材料與制造學部制備并提供。具有明顯的殼核型結(jié)構(gòu)，外殼為石墨烯碳殼，殼本身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易與周圍環(huán)境相互作用，具有保護內(nèi)核，防止內(nèi)核被腐蝕等作用；內(nèi)核為氮化鐵材料，磁響應性優(yōu)于氧化鐵材料。

肺癌細胞A549由本實驗室保存，昆明小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，人血液樣本由健康志愿者提供。

1.2 等離子體氨化/氧化G@FeN-MB

在微波等離子體裝置（北京工業(yè)大學材料與制造學部）中，使用2.45 GHZ 微波源激發(fā)等離子體，打開石墨烯的C-C 鍵，使石墨烯表面形成C-N鍵或C=O 鍵。通入NH3、N2等氣體，激發(fā)NH3、N2等離子體，使G@FeN-MB 連接氨基等含氮基團，制備氨基烯殼氮化鐵磁珠（graphene ammoniated iron nitride magnetic bead，GA@FeN-MB）。通入CO2、O2等氣體，激發(fā)CO2等離子體，使G@FeN-MB連接羧基等含氧基團，制備羧基烯殼氮化鐵磁珠（graphene oxide-coated iron nitride magnetic bead，GO@FeN-MB）。GO@FeN-MB 表面羧基可以與物質(zhì)的氨基端相連。使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM，JEOL 公司）觀察等離子體改性后的磁珠殼核結(jié)構(gòu)是否完整，使用紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR，BRUKER公司）分析磁珠表面官能團。

1.3 GA@FeN-MB 與GO@FeN-MB 吸附能力比較

將1 mg 磁珠用去離子水清洗一次，用100 μL PBS溶液溶解，加入1 mL濃度為1 mg·mL-1的BSA（QIAGEN 公司），常溫下在混合器上反應2 h，吸取上清，參照BCA 蛋白定量試劑盒說明書檢測未吸附蛋白量。按照公式（1）計算磁珠吸附蛋白量。用純水洗滌磁珠，檢測蛋白在磁珠上的結(jié)合緊密程度。

1.4 免疫磁珠的構(gòu)建

1.4.1氨基免疫磁珠的構(gòu)建 利用直接吸附法將鏈霉親和素（streptavidin，SA，北京索萊寶科技有限公司）與GA@FeN-MB 結(jié)合。取1 mg GA@FeNMB 用去離子水清洗一次，用100 μL PBS 溶解，加入200 μL 1 mg·mL-1SA，常溫下混合反應2 h，用PBS 洗滌3 次，去除未反應的SA，然后加入1 mL濃度為1 mg·mL-1BSA溶液，4 ℃下混合反應過夜，封閉磁珠，防止非特異性吸附。將制備的氨基鏈霉親和素磁珠（amino-streptavidin magnetic bead，A-SAMB）用純水洗滌3次，溶解在900 μL PBS中，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

按照說明書將EpCAM 抗體（ThermoFisher 公司）進行生物素化，將反應后的混合溶液加入至截留量50 kD超濾管（Millipore公司）中，加入純水補至500 μL，4 ℃下12 500 r·min-1離心15 min，棄去外管溶液，再補純水至500 μL，再次離心，重復3次，洗去過量生物素，3 000 r·min-1離心2 min，濃縮樣本至約200 μL。

連接A-SAMB與生物素化的抗體。將200 μL生物素化的EpCAM抗體加入至900 μL的A-SAMB溶液中，置于冰上反應10 min，制備氨基免疫磁珠（amino immunomagnetic bead，AIMB）。磁吸附聚集AIMB 后用PBS 洗滌，除去未反應的生物素化抗體，并溶解在1 mL PBS中，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2羧基免疫磁珠的構(gòu)建 通過碳二亞胺活化反應，將帶有羧基的GO@FeN-MB與帶有氨基的鏈霉親和素偶聯(lián)。具體步驟為：取1 mg GO@FeN-MB用去離子水清洗1次，用25 mmol·L-12-（N-嗎咻基）乙磺酸溶液（MES，pH 5.4，北京百靈威科技有限公司）潤洗2次。加入900 μL 10 mg·mL-1N-羥基琥珀酰亞胺溶液（NHS，上海共價化學科技有限公司）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺溶液（EDC，北京邁瑞達科技有限公司）。室溫混合反應10 min后，吸去上清液，用MES溶液清洗磁珠3次，除去剩余的NHS、EDC 和反應副產(chǎn)物尿素。加入200 μL 1 mg·mL-1鏈霉親和素溶液（溶于MES），常溫下混合反應2 h，制備羧基鏈霉親和素磁珠（carboxylic-streptavidin magnetic bead，C-SAMB），用PBS洗滌3次，去除未反應的SA。然后加入1 mL濃度為1 mg·mL-1BSA 溶液，4 ℃下混合反應過夜，封閉磁珠，防止非特異性吸附。將制備的C-SAMB洗滌3次，溶解在900 μL PBS中，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

將EpCAM 抗體生物素化并與C-SAMB 偶聯(lián)的操作同1.4.1，制備的羧基免疫磁珠（carboxylic immunomagnetic bead，CIMB）4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光檢測與磁珠偶聯(lián)的EpCAM 抗體

本研究制備的免疫磁珠偶聯(lián)順序為“磁珠-SAEpCAM 抗體”，使用DyLight 488 標記的山羊抗小鼠的第二抗體（EarthOx 公司）與磁珠上的EpCAM抗體進行偶聯(lián)，以驗證磁珠是否與EpCAM 抗體連接成功。避光條件下，按照說明書向制備好并封閉完全的200 μL免疫磁珠中加入2 μL DyLight 488熒光標記的二抗，常溫下混合反應1 h，用PBS 洗滌3 次，并在熒光顯微鏡（Leica 公司）下觀察結(jié)合顆粒在吸收光譜495 nm、發(fā)射光譜521 nm 處的熒光，利用多功能酶標儀（PerkinElmer 公司）檢測熒光強度。

1.6 免疫磁珠捕獲細胞實驗

1.6.1免疫磁珠捕獲細胞并檢測捕獲效果 用含1% FBS 的PBS 緩沖液制備A549 細胞懸液，以1.55×105個·孔-1接種24孔板，每孔體積約為1 mL。向每孔細胞中加入1 mL 1 mg·mL-1磁珠，室溫下混合反應10 min，使細胞與抗體充分結(jié)合。將24孔板放置在磁鐵塊上，靜置等待磁力固定磁珠并與之相連的細胞，3 min 后吸出上清，上清液中的細胞保存至無菌1.5 mL EP 管中，計未捕獲細胞數(shù)。采用公式（2）計算捕獲細胞數(shù)，通過公式（3）計算細胞捕獲效率。

免疫熒光法觀察被捕獲的細胞。用PBS緩沖液洗滌細胞和磁珠的聚合物沉淀，重新置24 孔板于磁鐵塊上，洗去游離的未捕獲細胞3～4 次。加入100 μL 完全培養(yǎng)基重懸磁珠和與其相連的細胞，加至35 mm 共聚焦培養(yǎng)皿（NEST 公司）中，再加入400 μL 4%多聚甲醛（pH 7.4，Beyotime 公司），37 ℃固定細胞10 min。加入500 μL 含2%BSA 的PBS 緩沖液，室溫封閉60 min。用含2%BSA 的PBS 按照1∶500 比例稀釋EpCAM 抗體，然后加入至細胞中，室溫孵育3 h，棄去一抗溶液，用PBS 緩沖液洗滌細胞3 次。在避光條件下，用含2% BSA 的PBS 緩沖液按照1∶100 稀釋比例稀釋FITC標記的熒光二抗（Proteintech Group公司），并加入至細胞中，室溫孵育1 h，用PBS 緩沖液洗滌細胞3次。加入20 μL細胞核復染劑（DAPI，Beyotime 公司），在避光室溫條件下孵育45 min，PBS緩沖液洗滌細胞3 次，用共聚焦激光掃描顯微鏡（Nikon公司）觀察。

使用CCK8 試劑（Beyotime 公司）檢測捕獲細胞數(shù)量。用完全培養(yǎng)基重懸磁珠和與其相連的細胞，在96孔板中加入細胞與磁珠懸液，每孔100 μL。同時設定單純培養(yǎng)基組作為空白對照。每孔各加入10 μL CCK8 試劑。將96 孔板放入培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光值。

1.6.2免疫磁珠分選CTC細胞并檢測捕獲效果 參照文獻將不同數(shù)量的A549 加入至小鼠或人的血液中模擬CTC［24-26］。

取昆明小鼠血于抗凝管中，2 500 r·min-1離心10 min，棄血清，用1 mL PBS 緩沖液重懸血細胞。將含有104、103、102個A549的3種不同數(shù)量的細胞溶液加入至1 mL 含106個小鼠血細胞溶液中，制備不同濃度的細胞混液。向每份細胞混液中分別加入300 μg AIMB，室溫下混合反應10 min，使磁珠與細胞充分反應，在磁鐵塊上靜置3 min，待磁珠聚集，棄上清。被磁珠捕獲的細胞用PBS 緩沖液清洗3 次，用完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)12 h 后，用EpCAM抗體、FITC標記的熒光二抗做免疫熒光實驗，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

取正常人血于抗凝管中，在1 mL 健康人血中分別摻入10、20、50、100、200 個A549，以制備不同濃度的細胞混液。參照說明書向細胞混液中分別加入3 mL 紅細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司），1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS 緩沖液重懸細胞沉淀。向每份細胞混液中各加入300 μg AIMB，室溫下震蕩10 min，在磁力架上靜置3 min待磁珠聚集，棄去上清液。被磁珠捕獲的細胞用PBS 緩沖液清洗3 次，用完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)12 h。用EpCAM抗體、FITC標記的熒光二抗及PE標記的CD45抗體進行免疫熒光實驗，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察并計數(shù)。共設4次重復。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 烯殼氮化鐵納米磁珠的表征

TEM結(jié)果如圖1所示，GA@FeN-MB與GO@FeNMB 的殼核結(jié)構(gòu)相對完整。磁珠的磁性內(nèi)核氮化鐵顆粒直徑約為10～40 nm，石墨烯片包覆殼為多層結(jié)構(gòu)，約5 nm，外層的石墨烯殼可對內(nèi)部的氮化鐵起到保護作用。

圖1 GA@FeN-MB與GO@FeN-MB的透射電鏡表征Fig. 1 Transmission electron microscopy characterization of GA@FeN-MB and GO@FeN-MB

利用紅外光譜分析磁珠表面官能團，如圖2A所示，GA@FeN-MB 在3 450 cm-1處有明顯的吸收峰，提示存在N-H基團，且強度大于GO@FeN-MB。GO@FeN-MB在1 630 cm-1、1 100～750 cm-1、585 cm-1處有明顯吸收峰，提示存在羧基C=O、C-O 振動特征峰，印證了GO@FeN-MB含有所需的羧基及其他含氧基團；GO@FeN-MB 在2 900 cm-1、2 300 cm-1、1 500～1 200 cm-1處有吸收峰，提示GO@FeN-MB存在C-H與苯環(huán)特征峰，然而GA@FeN-MB在這幾處均發(fā)現(xiàn)明顯吸收峰，說明GA@FeN-MB比GO@FeNMB 保存了更完整的二維苯六元環(huán)結(jié)構(gòu)，因此GA@FeN-MB 比GO@FeN-MB 更穩(wěn)定。GA@FeNMB 和GO@FeN-MB 在4 000～3 300 cm-1處高波數(shù)端，有官能團O-H 的伸縮振動吸收帶，說明其親水基團增加，水溶性增加。圖2B 顯示，A-SAMB 與GA@FeN-MB 相比，吸收峰變化并不明顯，可見石墨烯吸附蛋白對磁珠表面官能團影響不大，但ASAMB 在2 900 cm-1、2 300 cm-1、600 cm-1有吸收峰變化，提示A-SAMB 存在C-H 與苯環(huán)特征峰，可能是因為在制備A-SAMB時，石墨烯的二維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分結(jié)構(gòu)變成三維。圖2C 顯示，C-SAMB與GO@FeN-MB相比，在3 400 cm-1處、1 630 cm-1處吸收峰略有加深，1 100 cm-1～750 cm-1處的吸收峰減少，585 cm-1處吸收峰深度有較大幅度縮小，提示GO@FeN-MB 表面羧基及含氧基團被消耗，又因連接的蛋白上有羧基與氨基基團，因此基團總量變化不大，其他官能團的吸收峰變化并不明顯。

圖2 烯殼氮化鐵磁珠與其功能化后的SAMB的紅外光譜分析Fig. 2 FTIR of the magnetic beads and their functionalized SAMBs

2.2 磁珠的吸附能力比較

對3 種烯殼氮化鐵磁珠吸附蛋白能力進行比較，由圖3 可知，GA@FeN-MB 的吸附蛋白量遠遠大于G@FeN-MB，與GO@FeN-MB 的吸附量接近，但GA@FeN-MB 的標準差小于GO@FeN-MB，這提示GA@FeN-MB 吸附蛋白性能更穩(wěn)定；而洗脫蛋白量結(jié)果表明GA@FeN-MB 被洗脫下來的蛋白少于GO@FeN-MB（P＜0.005），說明GA@FeN-MB 吸附的蛋白比GO@FeN-MB 更多、更牢固。雖然石墨烯表面引入氨基與羧基等基團均可提高石墨烯與分子間相互作用的范德華力，但由于鏈霉親和素帶負電呈酸性，易與氨基等堿性基團形成氫鍵與鹽橋，這2 種鍵形成的能量通常比普通共價鍵低，而比范德華力要高得多，因此，GA@FeN-MB要比GO@FeN-MB吸附蛋白性能穩(wěn)定。

圖3 3種烯殼氮化鐵磁珠吸附蛋白能力比較Fig. 3 Comparison of the ability of three kinds of GO@FeNMB to adsorb proteins

2.3 驗證磁珠與抗體的偶聯(lián)

圖4A～B 顯示，2 種免疫磁珠在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光，說明抗體與磁珠偶聯(lián)成功；采用酶標儀測量免疫磁珠與對照組磁珠的熒光強度，由圖4C可知，2種免疫磁珠的熒光強度遠遠大于對照組磁珠，且AIMB 與CIMB 的熒光強度無明顯差異，提示2 種磁珠均能成功偶聯(lián)EpCAM 抗體制備成為免疫磁珠。其中制備AIMB 的直接吸附法較制備CIMB的碳二亞胺法操作更為簡單。

圖4 2種磁珠與EpCAM抗體偶聯(lián)的結(jié)果Fig. 4 Results of two magnetic beads coupled to EpCAM antibodies

2.4 免疫磁珠捕獲A549肺癌細胞

將捕獲后的A549肺癌細胞進行免疫熒光染色，共聚焦激光掃描顯微鏡顯示EpCAM 陽性表達（綠色），DAPI陽性表達（藍色）的細胞為A549（圖5），且2種免疫磁珠都能捕獲A549。

圖5 免疫磁珠捕獲細胞后免疫熒光觀察結(jié)果Fig. 5 Immunofluorescence observations after cells were captured by IMB

使用CCK-8試劑檢測磁珠捕獲A549的能力，結(jié)果如圖6所示，AIMB捕獲的細胞數(shù)量大于CIMB，且免疫磁珠與其他磁珠的捕獲結(jié)果有顯著性統(tǒng)計學差異（P＜0.001），提示免疫磁珠捕獲A549 的能力強于未偶聯(lián)抗體的磁珠。

圖6 CCK-8法檢測免疫磁珠捕獲A549的能力Fig. 6 The CCK-8 method detected the ability of immunomagnetic beads to capture A549

如圖7 所示，CIMB 的捕獲效率為85.08%±2.02%，C-SAMB 的捕獲細胞率為27.82%±8.47%，GO@FeN-MB 的捕獲細胞率為10.08%±10.08%，CIMB的捕獲效率遠高于C-SAMB和GO@FeN-MB；AIMB 的捕獲效率為93.34%±1.21%，A-SAMB 的捕獲細胞率為29.84%±10.49%，GA@FeN-MB 的捕獲細胞率為18.95%±0.40%，AIMB 的捕獲效率遠高于A-SAMB 和GA@FeN-MB。同時，AIMB 與CIMB的捕獲效率無明顯差別。

2.5 AIMB從小鼠血中分選A549肺癌細胞

使用AIMB 對小鼠血中A549 進行分選，并對分離的細胞進行免疫染色鑒定，DAPI 陽性表達（藍色），EpCAM 陽性表達（綠色）為A549。圖8顯示AIMB能從小鼠血中捕獲A549。

圖8 免疫磁珠從小鼠細胞混液捕獲A549后免疫熒光觀察結(jié)果Fig. 8 Immunofluorescence observation of A549 captured from mouse cells mixture by AIMBs

2.6 AIMB從人血中分選A549肺癌細胞

圖9顯示，DAPI 陽性表達（藍色），EpCAM陽性表達（綠色），CD45 陰性表達（無紅色）為A549；DAPI 陽性表達（藍色），EpCAM 陰性表達（無綠色），CD45 陽性表達（紅色）為白細胞。區(qū)分A549 與白細胞后，分別計數(shù)A549 和白細胞的數(shù)量，計算捕獲效率與純度。表1 顯示，AIMB 捕獲A549 的效率在66.25%～81.50%之間，純度約為50%。如圖10 所示，AIMB 捕獲的CTC 數(shù)量與摻入的A549 數(shù)量呈線性關系（R2=0.990 7，P＜0.001）。

圖9 磁珠從人血細胞混液捕獲CTC后免疫熒光觀察結(jié)果Fig. 9 Immunofluorescence observation of CTCs captured from human blood cells mixture by AIMBs

圖10 AIMB捕獲CTC數(shù)量線性關系Fig. 10 Linear relationship of AIMBs captured CTCs number

3 討論

肺癌患者長期存活率低與腫瘤細胞擴散有關，腫瘤細胞擴散會導致腫瘤轉(zhuǎn)移或復發(fā)。因此，血液中循環(huán)腫瘤細胞的檢測對于預測腫瘤復發(fā)、提高生存率具有重要意義。檢測血液中肺癌循環(huán)腫瘤細胞的常用技術包括抗體依賴性磁珠捕獲技術和非抗體依賴性流體捕獲技術，其中非抗體依賴性流體捕獲技術存在純度低的問題?？贵w依賴性免疫磁珠捕獲CTC 的方法具有操作簡便、快捷等特點，但存在樣本需求量大和制備成本昂貴等問題。因此，本研究通過改進磁珠和簡化分選過程，提供了一種基于抗EpCAM 的磁性顆粒分離CTC的方法。

石墨烯是一種單層厚度的二維材料，其比表面積非常高，是同等質(zhì)量三維材料的數(shù)百倍，這使得石墨烯能夠有效地吸附分子。紅外光譜分析結(jié)果顯示，GA@FeN-MB 的二維結(jié)構(gòu)比GO@FeN-MB完整，因此GA@FeN-MB 的吸附能力更好。先前研究顯示，石墨烯由碳原子組成的六元環(huán)構(gòu)成，具有特殊的電子結(jié)構(gòu)和化學活性，使其能夠與各種分子相互作用，并吸附在表面。而氨基等官能團可以提供孤對電子，使石墨烯表面具有一定的親電性，從而與部分帶正電荷的分子發(fā)生范德華力相互作用；此外，氨基等官能團還可以與一些具有酸性的分子形成酸堿配對，進一步增強吸附能力。鏈霉親和素是一種糖蛋白，由多個糖基組成，糖基通常帶負電，即呈酸性，因此GA@FeN-MB 的吸附能力優(yōu)于GO@FeN-MB。

與其他檢測CTC 的方法相比，本研究建立的方法簡單、快速且成本低。首先，本研究的磁珠可現(xiàn)用現(xiàn)制，便于貯存。通常已連接抗體的磁珠存在不易保存、抗體易失活等問題，本研究的磁珠現(xiàn)用現(xiàn)制，在使用時將抗體生物素化后連接在鏈霉親和素磁珠上，保證了抗體的活性，不需要特殊的保存管。其次，制備方法方便快捷。本研究所使用的試劑與材料，如鏈霉親和素、PBS 緩沖液等都是實驗室常見試劑。第三，整個操作過程簡單，沒有繁瑣的步驟。AIMB 制備更簡單快捷，且捕獲效率不低于CIMB，因此，選用AIMB 進行小鼠或人血液CTC 的捕獲實驗。若在后續(xù)實驗中需要去除磁珠分析CTC，直接吸附法制備的AIMB 比碳二亞胺法制備的CIMB更容易去除。

血液中主要的細胞成分是紅細胞和白細胞，通過紅細胞裂解液可剔除大多數(shù)紅細胞。CD45是所有白細胞的共同抗原，EpCAM 是腫瘤細胞最常見的抗原，結(jié)合DAPI 對細胞核進行染色，可以區(qū)分CTC 與白細胞。通常，捕獲CTC 的純度為40%～50%［27-28］，本研究結(jié)果表明，烯殼氮化鐵納米磁珠經(jīng)過功能化修飾后，能有效地捕獲A549腫瘤細胞，純度為50%左右。

通常情況下，檢測外周血中的CTC 需要7.5 mL以上的血樣［18，29-30］，而本研究建立的方法只需要1 mL 血液樣本，對樣本的需求量減少，這意味著更容易被志愿者和患者接受。

雖然使用EpCAM 抗體的免疫磁珠對乳腺癌CTC 的回收率為70%～82%［31］，但對非小細胞肺癌CTC 的回收率無準確數(shù)值。需要注意的是，基于免疫磁珠的CTC 捕獲效率可能因癌癥類型、疾病階段和所用樣品制備方法等多種因素而異。將A549 細胞加入1 mL 血液樣本中，用本研究建立的方法進行檢測，其回收率在66.25%～81.50%之間，表明該方法有較高的靈敏度。

綜上所述，本研究建立了一種簡便的檢測肺癌循環(huán)腫瘤細胞的方法。CTC的檢測對肺癌的診斷、預后和治療具有重要意義，烯殼氮化鐵納米磁珠這種新的材料可能在今后的肺癌臨床研究中有相當大的潛在價值。