副溶血性弧菌特異性核酸適配體篩選

李潔 ， 岳曉禹 ， 崔麗偉 ， 許文濤，3 ， 李相陽

1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京 102206；

2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物學院，鄭州 450046；

3.中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系，北京 100083

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水產(chǎn)品中常見的食源性致病菌，根據(jù)報道，其已超過沙門氏菌成為造成細菌性中毒最主要的微生物［1-2］。副溶血性弧菌屬于革蘭氏陰性菌，作為中等嗜鹽菌，其在1%～9% NaCl 溶液中均可以生長繁殖，最佳生長濃度約為3% NaCl，最佳生長溫度30～35℃，低于4℃時停止生長，因此在溫暖的海水中優(yōu)先生長。根據(jù)菌體O 型抗原和莢膜K 型抗原的不同，副溶血性弧菌可以分為13種O型和71種K型［3-4］。副溶血性弧菌的爆發(fā)不僅會使大量的水產(chǎn)動物快速死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失，還會使消費者因食用被污染的水產(chǎn)品而引起流行性腹瀉，危害消費者的身體健康［5-7］。因此，針對副溶血性弧菌篩選核酸適配體對于其快檢技術的開發(fā)具有重要的意義。

核酸適配體是目前備受關注的一種識別元件，通過其特異性識別可以將靶標濃度歸一化為核酸分子，并進一步與不同的信號輸出方式結合實現(xiàn)快速檢測［8-10］。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）獲得的一段寡核苷酸序列，可以特異性的識別靶標物質［11］。1990 年首次被開發(fā)，此后的三十多年中多種靶標物質的適配體陸續(xù)被開發(fā)和應用，包括農(nóng)藥、重金屬、抗生素和微生物等［12-13］。

本研究利用cell-SELEX技術對副溶血性弧菌的適配體進行了篩選，并對每輪篩選中的PCR 輪數(shù)和Lambda外切酶使用量進行了優(yōu)化，以期為副溶血性弧菌的快速檢測奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗菌種 實驗使用的副溶血性弧菌ATCC 17802、單增李斯特氏菌CMCC 54002、金黃色葡萄球菌ATCC 29213 和鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115 由中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評估（食品）重點實驗室提供。

1.1.2實驗試劑 rTaq酶、dNTP、100 bp DNA Marker 和核酸染料購自北京天根生化科技有限公司；西班牙瓊脂糖購自北京沃比森科技有限公司；qPCR Mix購自北京全式金生物科技有限公司；3%氯化鈉堿性蛋白胨水購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3試劑配制 1×BB 緩沖溶液：稱取1.212 g Tris、0.175 4 g NaCl、0.203 3 g MgCl2·6H2O 溶于150 mL去離子水中，調(diào)至pH 7.5，加入去離子水補足至200 mL。

適配體處理：將合成的適配體粉末于4 ℃ 4 000 r·min-1離心2 min 后加入一定量的超純水得到100 μmol·L-1母液，置于-20 ℃儲存。每次使用前將100 μmol·L-1母液稀釋成相應的濃度，置于95 ℃、金屬浴中10 min，冰上立即冷卻10 min以獲得變性的核酸適配體，便于適配體與靶標的后續(xù)結合。

1.1.4實驗儀器 LineGene 9600plus 熒光定量PCR 檢測儀購自杭州博日科技有限公司；A300 基因擴增儀購自杭州朗基科學儀器有限公司；電泳儀購自北京市六一儀器廠；凝膠成像儀購自上海勤翔科學儀器有限公司；流式細胞儀購自貝克曼庫爾特有限公司；可調(diào)式混勻儀旋渦混合器購自北京開源國創(chuàng)科技有限公司；氣浴恒溫振蕩儀購自北京得利特科技有限公司；恒溫金屬浴購自北京富德安科技有限公司；CF1524R 臺式高速冷凍離心機購自杭州恒流科技有限公司；Nanodrop 超微量分光光度計購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1副溶血性弧菌生長曲線測定 取活化好的菌液1 mL 加入含30 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基的50 mL 錐形瓶中，37 ℃ 200 r·min-1下培養(yǎng)。每隔1 h 測量一次OD620，繪制生長曲線以確定菌生長的對數(shù)期。選取合適培養(yǎng)時間的菌液進行平板計數(shù)。

1.2.2引物退火溫度優(yōu)化 初始文庫由35 個堿基的核心區(qū)域和兩端各20 個堿基的引物區(qū)域組成，即5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-N10-AGGTTAAGAGGCGCT-N10-GAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3'，用于PCR 擴增的引物分別為上游引物5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-3' ，下游引物5'-ACTAACGACCGACTGACTTC-3'，其中下游引物的5'端磷酸化修飾用于單鏈制備。在實驗開始前將引物在55～65 ℃之間進行退火溫度的優(yōu)化，擴增后利用4%瓊脂糖凝膠電泳進行結果驗證。

1.2.3適配體篩選過程 本篩選過程一共為12 輪，包括9 輪正向篩選和3 輪反向篩選，在反向篩選中選擇國標中與副溶血性弧菌出現(xiàn)在同一食品中的微生物作為負篩靶標，包括金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌，負篩靶標的使用可以提高篩選到的適配體特異性。具體篩選中使用的各組分加樣量如表1 所示，在12 輪的篩選中逐漸減小菌液加樣量、減短孵育時間及增加孵育后洗滌次數(shù)以增加篩選壓力。雙鏈的大量擴增使用PCR 方法，單鏈獲得采用Lambda 酶切方法，在每輪擴增中對PCR輪數(shù)和Lambda外切酶用量進行優(yōu)化。次級文庫純化使用醇沉法。12 輪篩選完成后送測序公司進行序列測序并對得到的序列進行性能探究，親和力則利用Saika等［15］報道的方法進行計算。

表1 篩選過程中各組分加樣量及反應時間Table 1 Sample loading and reaction time of each component in the SELEX

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌生長曲線

在接菌完成后每小時測量一次OD620以對副溶血性弧菌生長的對數(shù)期進行探究。由圖1可知，經(jīng)過1 h 延滯期副溶血性弧菌進入快速生長階段，選擇培養(yǎng)5 h 的菌液進行平板計數(shù)得到此時菌落總數(shù)約為109CFU·mL-1，適合用于適配體篩選，因此選用5 h 作為后續(xù)菌液的培養(yǎng)時間。

圖1 副溶血性弧菌的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Vibrio parahaemolyticus

2.2 引物退火溫度優(yōu)化

合適的退火溫度有利于質量更高的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生［16］。在55～65 ℃之間進行退火溫度優(yōu)化，由圖2 可知，隨著退火溫度的不斷升高非特異性產(chǎn)物條帶（圖2 中75 bp 產(chǎn)物以外部分）越來越明亮，因此選擇55 ℃作為后續(xù)實驗的退火溫度。

圖2 退火溫度優(yōu)化結果Fig. 2 Results of annealing temperature optimization

2.3 適配體篩選

隨著篩選中PCR 擴增產(chǎn)生的偏差和Lambda外切酶在單鏈生產(chǎn)中發(fā)生的切割偏差，PCR 過程中會產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，因此每輪擴增中需對PCR輪數(shù)進行優(yōu)化，以第4輪篩選的PCR優(yōu)化為例，隨著擴增輪數(shù)的增加，非特異性產(chǎn)物越來越多，如果擴增輪數(shù)過少則不能產(chǎn)生足夠的目標產(chǎn)物，因此，在第4 輪中選擇28 輪作為擴增輪數(shù)（圖3）。PCR 產(chǎn)物的不同則需要不同的Lambda 外切酶用量，酶切時間過長和酶量使用過多都會造成目標序列的損失，而酶切時間過短和酶量使用過少則會導致目標單鏈的產(chǎn)量不足，難以有效構建次級文庫。以第3輪篩選的酶切優(yōu)化為例，在45 μL雙鏈產(chǎn)物中加入0.8、1.0、1.2、1.5和2 μL Lambda外切酶和5 μL緩沖液，結果如圖4 所示，0.8 μL 產(chǎn)生的單鏈最多。

圖3 第4輪篩選PCR輪數(shù)優(yōu)化結果Fig. 3 Results of PCR cycle optimization in fourth round of SELEX

圖4 第3輪篩選Lambda外酶切優(yōu)化結果Fig. 4 Results of Lambda exonuclease enzyme optimization in third round of SELEX

經(jīng)過12輪的篩選后進行測序及同源性分析，從中初選了10條序列進行qPCR，當適配體與靶標菌具有較好的結合效果時，同樣的菌數(shù)可以結合更多的適配體數(shù)量，因此產(chǎn)生更小的Ct值，由圖5可知，F(xiàn)-3-2和F-28-10在10條序列中更好的結合效果。

圖5 10條候選適配體序列的qPCR結果Fig. 5 Results of qPCR for 10 candidate aptamer sequences

利用流式細胞術對這2 條序列進行適配體結合效果和特異性的進一步探索。如圖6所示，2條適配體均表現(xiàn)了較好的特異性，其中F-28-10特異性表現(xiàn)更佳。由圖7 陰性菌和適配體孵育后的菌體熒光對比可知，2 條適配體均具有較好的結合能力且F-28-10 表現(xiàn)更佳。因此，F(xiàn)-28-10 為篩選得到的效果最佳的適配體，序列為5'-ATCCATT GCCACTGACTACCAATATCACGTAGGTTAAGAGGC GCTCTCCCACCAAGAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3'。

圖6 適配體與細菌結合的流式細胞術分析Fig. 6 Flow cytometric analysis of aptamers binding to bacteria

圖7 適配體F-3-2和F-28-10結合效果對比Fig. 7 Comparison of binding effects of aptamers F-3-2 and F-28-10

進一步對F-28-10 的親和力進行研究，適配體濃度按100～10-4nmol·L-1梯度對F-28-10 做標準曲線（圖8），獲得了用于適配體結合濃度計算的回歸方程y=（8.89±0.30）-（3.73±0.14）x（R2=0.995）。固定副溶血性弧菌濃度，增加適配體濃度獲得適配體-靶標解離飽和曲線。將1、10、50、100、200 nmol·L-1濃度的適配體序列與靶標孵育，qPCR 后計算結合濃度獲得了解離飽和曲線（圖9）。Kd值越低證明適配體與靶標結合越好，利用Origin 軟件擬合得到F-28-10 的Kd值為44.31±31.46 nmol·L-1。

圖8 適配體F-28-10的親和力研究Fig. 8 Affinity study of aptamer F-28-10

圖9 F-28-10與副溶血性弧菌的結合解離曲線Fig. 9 Dissociation saturation curves of F-28-10 and Vibrio parahaemolyticus

3 討論

自1950 年首次在日本被發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌就成為了全球性的衛(wèi)生安全問題，并隨著我國居民生活水平提升和水產(chǎn)品消費量的不斷增長成為我國細菌性中毒事件發(fā)生的首要原因。在合適的條件下副溶血性弧菌將在3～4 h 內(nèi)快速生長［17］，因此用于副溶血性弧菌檢測的適配體傳感器的開發(fā)近年來受到廣泛關注［18-19］，然而相比于大腸桿菌等其他常見食源性致病菌，副溶血性弧菌適配體篩選的數(shù)量較少，因此本研究通過在12 輪的篩選中逐漸增加篩選壓力，并對每輪PCR 擴增輪數(shù)和Lambda外切酶用量進行優(yōu)化，同時在測序后通過qPCR 和流式細胞術技術驗證分析得到了一條在特異性和結合能力方面表現(xiàn)最佳的適配體序列F-28-10，研究結果豐富了副溶血性弧菌在適配體傳感器開發(fā)中識別元件的選擇。