重組貽貝粘蛋白的表征及功效評價

李敏 ， 魏文培 ， 喬莎 ， 郝東 ， 周浩 ， 趙碩文 ， 張立峰 ， 侯增淼

西安德諾海思醫(yī)療科技有限公司，西安 710000

貽貝粘蛋白（mussel adhesive protein， MAP）也稱作貽貝足絲蛋白（mussel foot protein，Mfps），是海洋貝類——紫貽貝（Mytilus galloprovincalis）、厚殼貽貝（Mytilus coruscus）、翡翠貽貝（Perna viridis）等分泌的一種特殊的蛋白質(zhì)，貽貝中含有多種貽貝粘蛋白，包括貽貝粘蛋白（Mfp 1～6）、前膠原蛋白（precollagens）和基質(zhì)蛋白（matrix proteins）等［1］。其中，Mfp1～6 多數(shù)富含3，4-L-二羥基苯丙氨酸（dihydroxyphenylalanine，DOPA），也稱多巴，是一種行使黏附功能的主體蛋白質(zhì)。其中，Mfp1分子量約為110 kD，主要分布在貽貝足絲表面，在足絲纖維的膠原蛋白內(nèi)核外層形成堅硬的保護層，增強了足絲纖維鞘的機械強度和耐性。Mfp2分子量約為45 kD，是斑塊特有蛋白，同時也是斑塊中最為豐富的蛋白質(zhì)，半胱氨酸含量較高，主要依靠兩端的多巴將其他蛋白分子連接起來，能夠穩(wěn)定整個粘附斑塊的結(jié)構(gòu)。Mfp3 在足絲斑塊中分子量最小，約5.0～7.5 kD，多巴含量約為20 %（物質(zhì)的量分數(shù)），僅次于Mfp5，主要分布在斑塊與底物粘結(jié)的界面上。Mfp4 分子量約79 kD，富含精氨酸、組氨酸、甘氨酸和酪氨酸，位于遠端足絲和粘附斑塊的連接處，承擔足絲向斑塊的形態(tài)學和力學轉(zhuǎn)化。Mfp5的分子量為11 kD，含有30%（物質(zhì)的量分數(shù)）的多巴，是目前發(fā)現(xiàn)的多巴含量最高的足絲蛋白，主要分布在足絲斑塊與基質(zhì)的接觸面，被認為是貽貝與外界固體表面起粘附作用的主要蛋白質(zhì)。Mfp6分子量約11.6 kD，酪氨酸含量很高，與Mfp3、Mfp5 共同位于粘附斑塊的界面處，為Mfp3、Mfp5 中的多巴提供還原環(huán)境。而前膠原蛋白以及基質(zhì)蛋白則多數(shù)富含甘氨酸和脯氨酸，主要負責足絲內(nèi)部的分子交聯(lián)［1-2］。雖然這些足絲蛋白分子量跨度很大，但在理化性質(zhì)上具有一定相似性，并且成熟的足絲蛋白大都含有大量的多巴。多巴對足絲蛋白的粘附功能至關(guān)重要，多巴轉(zhuǎn)換為多巴醌并通過氫鍵與外界基質(zhì)形成牢固的連接以行使粘附功能［3-6］。貽貝分泌的這一類足絲蛋白會因海洋中鹽度、濕度、pH 的變化，使貽貝對不同類型的表面發(fā)生粘附以及脫粘附作用。受貽貝足絲蛋白粘附特性的啟發(fā)，目前部分貽貝足絲蛋白已被應用于醫(yī)用粘合劑、創(chuàng)面修復等醫(yī)藥領(lǐng)域。

目前，獲取貽貝粘蛋白最直接的方法就是從貽貝足腺中直接提取天然粘附蛋白成分，但由于貽貝足絲蛋白的分泌量很低，1 萬個貽貝僅能提取約1 mg 粘附蛋白，這種直接提取的粘合劑產(chǎn)品價格昂貴且容易固化，因此制約了其應用范圍。基因工程手段是目前獲得貽貝粘蛋白的另一有效途徑，但是獲得的貽貝粘蛋白也存在表達量低和粘附性能不如意的狀況。如何獲得純度高、生物安全性好且具備良好粘附性能的貽貝粘蛋白是未來重要的研究方向。

Hwang 等［7］構(gòu)建了重組雜交貽貝生物膠fp-151，該蛋白將來源于紫貽貝的足絲蛋白Mfp1 和Mfp5 進行融合，在大腸桿菌中表達。該蛋白共196 個氨基酸，其中，第1～60 位氨基酸為6 個Mfp1 序列的重復串聯(lián)，第61～136 位氨基酸為1個Mfp5 序列，第137～196 位氨基酸為6 個Mfp1序列的重復串聯(lián)。fp-151 解決了Mfp5 可溶表達抑制細胞生長以及其純化后在緩沖液中高度不溶的問題，fp-151 在大腸包涵體中產(chǎn)生，不抑制細胞的生長，同時也保留了貽貝的強粘附功能，純化后的溶解度也顯著增強，但未對其功效作用進行進一步評價。本研究對重組貽貝粘蛋白MFP151 進行了結(jié)構(gòu)表征，并在促進細胞遷移、修復愈合方面的功效進行了初步評價及原理分析，以期為貽貝粘蛋白的進一步應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

凝膠圖像分析系統(tǒng)（BG-gdsAUTO520，百晶）；電泳儀及電源（北京六一儀器廠）；電熱鼓風干燥箱（WGL-65B，天津市泰斯特儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV1800，島津）；細胞培養(yǎng)箱（BPN-150CRH，上海一恒）；倒置顯微鏡（IX73，奧林巴斯）；離心機（TGL-16，湘儀）；酶標儀（TECAN Infinite F50）。

1.2 主要材料

重組貽貝粘蛋白（型號：MFP151，本公司發(fā)酵生產(chǎn)，批號：2010C01）：共196個氨基酸殘基組成。其中，第1～60 位氨基酸為Mfp1 貽貝粘蛋白特征十肽（AKPSYPPTYK）6 重復串聯(lián)，第61～136 位氨基酸為Mfp5 貽貝粘蛋白序列，第137～196 位氨基酸為Mfp1貽貝粘蛋白特征十肽（AKPSYPPTYK）6重復串聯(lián)［7］。鱟試劑購自博康海洋生物有限公司（批號：1907082，靈敏度λ為0.25 EU·mL-1）。左旋多巴標準品（B2217189，阿拉丁）。實驗中所用DEME 高糖完全培養(yǎng)基、PBS 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）均由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.3 表征

1.3.1N 端測序 采用Edman 降解法測試，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

重組貽貝粘蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳（10%預制膠，Invitrogen 垂直電泳儀）分離目的條帶，通過半干法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用麗春紅染液染色，用純化水漂洗至條帶清晰，根據(jù)Marker 相對分子量確定目的條帶，將目的條帶剪下后放置到反應器中，通過PPSQ 全自動蛋白多肽測序儀（SHIMADZU）進行15個循環(huán)測試。

1.3.2分子量測定 通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（5800 MALDI-TOF/TOF）對重組貽貝粘蛋白相對分子量進行分析，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.3氨基酸組成分析 使用6 mol·L-1鹽酸將重組貽貝粘蛋白樣品酸水解為游離氨基酸，用異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）法對游離氨基酸進行衍生化處理之后，使用高效液相色譜對衍生化的氨基酸樣品進行分析，根據(jù)外標法計算確定樣品中氨基酸組成的摩爾百分比，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.4純度（電泳法）分析 純度測定按照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行。將重組貽貝粘蛋白配制成蛋白含量為1 mg·mL-1的溶液，同時配制0.01 mg·mL-1重組貽貝粘蛋白作為靈敏度對照溶液。分別與4×非還原型蛋白上樣緩沖液（三羥甲基氨基甲烷3.03 g，溴酚藍0.020 g，十二烷基硫酸鈉8.0 g，甘油40 mL，加水溶解并稀釋至約80 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，加水定容至100 mL）以3∶1的比例混合后，煮沸5 min，室溫冷卻后2 000 r·min-1離心20 s。采用5%濃縮膠、15%分離膠恒壓模式電泳，初始電壓80 V，進入分離膠后調(diào)至120 V，直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍R250進行染色，脫色至背景透明，使用Gel-Pro Analyzer 4.0進行純度分析。

1.3.5內(nèi)毒素測定 按照細菌內(nèi)毒素檢查法測定內(nèi)毒素含量［8］，每l mg 樣品中內(nèi)毒素的量應小于10 EU。

稱取0.050 g 重組貽貝粘蛋白于無熱源試管中，加入10 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水配置成濃度為5 mg·mL-1的溶液，同時配制對照溶液：①2λ/檢查用水（λ為鱟試劑的標示靈敏度，單位為EU·mL-1）：取細菌內(nèi)毒素工作標準品1 支，用內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋致含內(nèi)毒素為2λ 的標準品溶液。②2λ/供試品溶液：用10 mL 2λ/檢查用水溶液溶解重組貽貝粘蛋白0.05 g配制即得。③無內(nèi)毒素/檢查用水。所有樣品均配制2管，進行內(nèi)毒素測定。

1.3.6多巴含量測定 多巴含量測定按照YY/T 1293.6-2020中多巴含量試驗進行［9］。

多巴標準曲線制備：左旋多巴標準品20 mg，用0.012 mol·L-1鹽酸溶解定容到100 mL，分別取0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，用0.012 mol·L-1鹽酸稀釋定容至刻度，搖勻即得多巴濃度為：0、2、10、20、30、40、50、60 μg·mL-1系列標準溶液。

稱取0.025 g重組貽貝粘蛋白，用0.012 mol·L-1鹽酸溶解定容到50 mL，即得濃度為0.5 mg·mL-1重組貽貝粘蛋白溶液。

分別取系列標準溶液和重組貽貝粘蛋白溶液各1 mL 置于試管中，向每支試管中加入0.5 mL 0.516 mol·L-1鹽酸，然后每管中依次加入1.5 mL亞硝酸試劑；5 min 后加入2 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉搖勻，在500 nm 波長下測定吸光度。用Origin 9.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，以多巴濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標制作標準曲線，再根據(jù)測得的樣品溶液的吸光度值計算出樣品的多巴含量W。

式中，W為供試品中多巴的百分含量；Ci為標準曲線中計算出的樣品測定液中多巴濃度，單位為μg·mL-1；M為重組貽貝粘蛋白稱樣量，單位為mg。

1.4 功效評價

1.4.1細胞遷移 采用細胞劃痕實驗來評價重組貽貝粘蛋白對人包皮成纖維細胞HFF-1（CL-0352，武漢普諾賽生命科技有限公司）細胞遷移率的影響。①鋪板：將2×106個細胞數(shù)接入6 孔板中，培養(yǎng)24 h（可調(diào)節(jié)）后用槍頭劃線，加入PBS緩沖液清洗細胞3 次。②隨后加入含不同濃度梯度的貽貝粘蛋白DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別為50、60、200、500、900 μg·mL-1，同時設(shè)置DEME 培養(yǎng)基為空白對照。培養(yǎng)0、6、20、28 h 在顯微鏡下拍照。用Image J 分析細胞劃痕面積，并按照式（2）計算細胞遷移速率。用GraphPad Prism 8.0 軟件采用雙向方差分析模型（雙因素ANOVA）進行數(shù)據(jù)分析，繪制細胞遷移速率和時間柱狀圖。其中細胞遷移速率越大，該濃度重組貽貝粘蛋白促進細胞增殖的作用越明顯。

1.4.2修復功效 本檢測由杭州環(huán)特生物科技有限公司完成，通過手術(shù)刀沿與軀干垂直方向切斷斑馬魚尾鰭，以再生的尾鰭面積定量結(jié)果來評價樣品的組織修復功效，用Image J進行尾鰭面積分析，用GraphPad Prism 8軟件進行獨立樣本t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N端測序

蛋白質(zhì)的生物合成起始于N 端，該區(qū)域是蛋白質(zhì)重要的結(jié)構(gòu)和功能部位，序列特異性高，通過N 端的少數(shù)幾個氨基酸殘基可以對大多數(shù)蛋白質(zhì)進行鑒定，因此對于重組蛋白N 端序列的分析是鑒定重組蛋白表達的最直接方式。測序結(jié)果顯示重組貽貝粘蛋白N 端序列為：NH2-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Tyr-Lys-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr，與設(shè)計預期的序列完全一致。

2.2 分子量測定

蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量是鑒別蛋白質(zhì)的重要特征參數(shù)，是確定一種新型蛋白及進行蛋白質(zhì)后續(xù)研究活動的重要前提。圖1 為重組貽貝粘蛋白MFP151 的MALDI-TOF-MS圖，圖中橫坐標為離子的質(zhì)荷比（m/z），縱坐標為離子相對豐度，重組貽貝粘蛋白MFP151 的理論分子量是22.61 kD，實測分子量為22.911 kD，圖2 中m/z 22 911.8 峰為MFP151 質(zhì)子化分子離子峰，即［M+H］+峰，m/z 45 858.4 峰為MFP151的二聚體峰［2M+H］+。實測分子量較理論分子量偏大，推測為酪氨酸酶將酪氨酸殘基修飾為多巴從而使分子量變大，符合預期。

圖1 MFP151分子量測定Fig. 1 Molecular weight determination of MFP151

2.3 氨基酸組成分析

蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的組成分析是研究蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，結(jié)果如表1所示，實測樣品氨基酸個數(shù)與摩爾數(shù)基本與理論序列一致。

表1 MFP151氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of MFP151

2.4 純度檢測結(jié)果

蛋白質(zhì)純度是重組蛋白制品的一項重要檢測指標，不僅能評價分離工藝的有效性，還對制品的質(zhì)量屬性起到重要的監(jiān)測作用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，表2為電泳結(jié)果進行光密度分析后得到的重組貽貝粘蛋白純度，達96%以上。

表2 MFP151純度分析結(jié)果Table 2 Purity analysis results of MFP151

2.5 內(nèi)毒素含量測定

細菌內(nèi)毒素試驗主要用于檢測樣品是否含有引起機體發(fā)熱的內(nèi)毒素，是評價生物材料生物安全性的指標之一。內(nèi)毒素是由細菌死亡裂解或自溶引起的，極微量的細菌內(nèi)毒素進入動物或人體內(nèi)都會引發(fā)強烈的炎癥反應，因此細菌內(nèi)毒素是需要在生產(chǎn)階段控制的一項安全指標，本研究中采用凝膠法對重組貽貝粘蛋白內(nèi)毒素進行檢測，結(jié)果如表3 所示，重組貽貝粘蛋白內(nèi)毒素小于10 EU·mg-1，符合T/CASME 530—2023 標準中對內(nèi)毒素含量的要求［8］。

表3 內(nèi)毒素檢測結(jié)果Table 3 Endotoxin test results

2.6 多巴含量

多巴是貽貝粘附的關(guān)鍵，貽貝粘蛋白中的多巴及其氧化物極大地促進了粘附蛋白的附著能力，這些附著能力主要由多巴側(cè)鏈中的鄰苯二酚提供［11］。文中采用改良的Arnow 方法對重組貽貝粘蛋白中多巴的含量進行測定，繪制的標準曲線如圖3，標準曲線回歸方程為y=0.010 15x-0.006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 27。多巴含量測定結(jié)果如表4所示，平均為5.81%±1.07%，大于5%。

表4 多巴含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of DOPA content

圖3 多巴含量測定標準曲線Fig. 3 Standard curve of DOPA content determination

2.7 功效評價

2.7.1細胞遷移 本實驗通過細胞劃痕實驗考察不同濃度的重組貽貝粘蛋白對人包皮成纖維細胞遷移作用的影響。由圖4～5可知MFP151高濃度組900、500 μg·mL-1均抑制人包皮成纖維細胞增長，其中900 μg·mL-1的抑制效果大于500 μg·mL-1，并在20～28 h內(nèi)具有顯著性（P＜0.05）；低濃度組（50、60、200 μg·mL-1）在6～28 h 均具有促進細胞遷移的作用，濃度為60 μg·mL-1時促進增殖的作用最明顯，且具有極顯著性差異（P＜0.01）。貽貝粘蛋白通過靜電相互作用對細胞的貼壁和粘附產(chǎn)生影響［12］，在高濃度條件下，對細胞的靜電作用力增強，粘附性能增強，減緩了細胞遷移的速率；當濃度較低時，這種靜電吸附作用力的吸引會促進細胞的快速爬行和增殖，因此出現(xiàn)了高濃度抑制細胞遷移、低濃度促進細胞遷移的現(xiàn)象。

圖5 不同濃度MFP151對細胞遷移速率的影響Fig. 5 Effects of MFP151 at different concentrations on cell migration rate

2.7.2修復功效 斑馬魚尾鰭的再生與人類皮膚、骨骼、血管等修復作用機制相似，通過手術(shù)沿軀干垂直方向切斷尾鰭，以斑馬魚尾鰭的再生面積定量結(jié)果可評價重組貽貝粘蛋白的組織修復功效。由表5 可知，重組貽貝粘蛋白組斑馬魚尾鰭面積與模型對照組相比極顯著增加（P＜0.001），圖6 為斑馬魚尾鰭修復果對比圖，重組貽貝粘蛋白組尾鰭明顯比模型對照組尾鰭面積增大，說明重組貽貝粘蛋白具有修復功效。

表5 斑馬魚修復功效分析結(jié)果Table 5 Statistical analysis results of repair efficacy

圖6 斑馬魚尾鰭修復效果Fig. 6 Repair effects of tail fin of zebrafish

3 討論

本文中所述的重組貽貝粘蛋白采用MFP1 和MFP5 融合，其氨基酸序列組成如前所述，對獲得的重組貽貝粘蛋白關(guān)鍵質(zhì)量指標表征，如蛋白一級結(jié)構(gòu)相關(guān)指標、蛋白純度、內(nèi)毒素含量、多巴含量，結(jié)果均滿足醫(yī)用要求；同時從細胞水平和動物水平進行功能評測，顯示出重組貽貝粘蛋白具有促進創(chuàng)面修復和愈合的作用。分析上述原因，可能與氨基酸組成有關(guān)。首先，MFP151 的196 個氨基酸序列中有40 個賴氨酸，占整個氨基酸序列的20.4%，賴氨酸為堿性氨基酸，當pH 低于等電點時賴氨酸使蛋白帶有高載量正電荷，表皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞等均帶負電荷，因此，MFP151可以通過靜電相互作用與細胞緊密、快速結(jié)合，促進細胞的貼壁、爬行替代，從而加速創(chuàng)面的愈合［12-14］。其次，MFP151 中含有的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等均為疏水氨基酸，占整個氨基酸序列的34.7%，可與細胞膜的脂質(zhì)雙分子層通過疏水作用相互結(jié)合，強化細胞的隔水黏附和局部穩(wěn)定性［15］。再次，MFP151 中多巴含量達5%以上，多巴具有獨特的兒茶酚功能單元，兒茶酚基團由于羥基的吸電子效應，具有很強的金屬螯合能力，在材料表面可以形成穩(wěn)定的有機金屬絡合物，還可以與蛋白質(zhì)等極性聚合物形成很強的氫鍵結(jié)合，并快速粘附到細胞或創(chuàng)口表面固化形成一層透氣、防水、有彈性的膜，該薄膜可使創(chuàng)口或手術(shù)切口免受水、細菌、微生物等侵害［16-17］。

貽貝粘蛋白具有良好的生物相容性和多功能性。天然提取的貽貝粘蛋白目前已在臨床中得到應用，如江陰貝瑞森公司研究開發(fā)的Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品貽貝粘蛋白創(chuàng)面修復敷料［18］、貽貝粘蛋白肛腸敷料［19］等，同時重組貽貝粘蛋白在醫(yī)學美容領(lǐng)域也開始嶄露頭角，如湖南科妍創(chuàng)美醫(yī)療公司研究開發(fā)的重組貽貝粘蛋白水凝膠敷料、湖南美研再生醫(yī)學公司的貽貝粘蛋白修護液均采用重組貽貝粘蛋白為原料。分析上述產(chǎn)品，其臨床適應癥主要針對皮膚創(chuàng)面或黏膜的護理、修復。

貽貝粘蛋白還具有止癢、抗氧化和抗炎作用，虞俊杰等［20］發(fā)現(xiàn)貽貝粘蛋白對于治療燒傷后的瘙癢有效。叢林等［21-22］發(fā)現(xiàn)貽貝粘蛋白對面部敏感性皮膚臨床癥狀有改善作用，對瘙癢癥狀有非常好的緩解作用。劉朝陽等［23］通過對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究證明了貽貝粘蛋白組炎癥細胞浸潤程度較模型組明顯減輕，具有良好的抗炎作用。

綜上所述，貽貝粘蛋白在醫(yī)藥、醫(yī)療器械、化妝品領(lǐng)域具有巨大的應用潛力，但因天然的貽貝粘蛋白提取量低，導致其價格昂貴。雖然學者們已經(jīng)開展了基因工程手段生產(chǎn)貽貝粘蛋白，但由于基因工程技術(shù)所得到的貽貝粘蛋白缺少在貽貝體內(nèi)嚴格而充分的修飾和加工過程，導致基因工程手段所得到的蛋白產(chǎn)物黏度弱于天然蛋白，這限制了重組貽貝粘蛋白的應用。因此，開發(fā)面向應用的蛋白質(zhì)材料精準裝配與后加工技術(shù)，獲得良好生物相容性與生物功效性的重組貽貝粘蛋白產(chǎn)品及衍生產(chǎn)品是未來需要重點關(guān)注的方向。