真菌Stilbella sp. CGMCC 40422的萜類產(chǎn)物研究

宋開南 ， 艾羽桐 ， 徐玉泉

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所， 北京 100081

萜類化合物是由多個異戊二烯單元構成的烴類含氧衍生物，在自然界中分布廣泛，是天然產(chǎn)物中占比最高的一類次級代謝產(chǎn)物。萜類化合物因其復雜的骨架結構與優(yōu)良的藥理、生理活性，在食品、化工、醫(yī)藥和能源等領域應用廣泛，常見的萜類化合物有倍半萜青蒿素、二萜銀杏內(nèi)酯和三萜甘草次酸等［1-2］。

目前，萜類化合物的獲取方式主要有植物提取法、化學合成法與細胞工廠合成法。傳統(tǒng)的植物提取法具有產(chǎn)物含量低、分離純化難度大、植物種植周期長等局限性；化學合成法也存在著能耗高、效率低、環(huán)境不友好等缺點；細胞工廠合成法則具有周期短、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢［3-4］。近年來，科學家們利用微生物細胞工廠高效合成萜類化合物取得了突破性進展。如李春等［5］在釀酒酵母中過表達MVA 途徑限速酶，偶聯(lián)半乳糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡，并經(jīng)過發(fā)酵調(diào)控優(yōu)化，使得五環(huán)三萜齊墩果酸的產(chǎn)量達到606.9 mg·L-1。張學禮等［6］從山楂中鑒定出細胞色素P450酶CYP716C49，利用工程化釀酒酵母對其異源表達，合成了熊果酸和科羅索酸，其中科羅索酸的產(chǎn)量達到141 mg·L-1。然而，利用微生物細胞工廠合成萜類化合物的產(chǎn)量仍不能滿足市場日益增長的需求［7］，并且常用的底盤細胞釀酒酵母并不能準確地識別其他真核生物基因的內(nèi)含子和外顯子，P450 酶在釀酒酵母中的功能性表達難度很大，故而尋找新的底盤細胞勢在必行［8］。

本研究從土壤中分離得到一株高產(chǎn)萜類化合物的絲狀直菌Stilbellasp. CGMCC 40422，通過核磁共振與高效液相色譜等方法對萜類產(chǎn)物的結構與產(chǎn)量進行研究，以期為進一步開發(fā)萜類化合物生產(chǎn)的底盤細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 Agilent 核磁共振波譜儀（600 MHz DD2 型）；Agilent 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290 ⅡUHPLC，G6125B單四極質(zhì)譜）；Agilent制備型高效液相色譜儀（1260 Ⅱ型）；Agilent 半制備Eclipse XDB-C18 反相柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-300 型）；TOMY 高壓蒸汽滅菌鍋（SX-500型）；CRYSTAL恒溫振蕩器（IS-RDS3）；默克milli-Q 超純水系統(tǒng)；BUCHI 中壓制備液相色譜（C-605型）；Eppendorf高速冷凍離心機（5425型）。

1.1.2試劑 青島海洋化工廠柱層析用硅膠（200～300 目）；YMC 公司反相硅膠基C18 填料；天津致遠化學試劑有限公司二氯甲烷、無水甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（分析純）；美國TEDIA 公司甲醇、乙腈（色譜純）；上海吉至DNA 提取液（25∶24∶1）；上海吉至核酸提取液（24∶1）；索萊寶3 mol·L-1乙酸鈉（pH 5.2）；諾唯贊2×Phanta Max Master Mix；Biowest瓊脂糖；索萊寶50×TAE緩沖液。

1.1.3培養(yǎng)基配制 孟加拉紅固體培養(yǎng)基：在1 L蒸餾水中加入36.7 g 索萊寶公司孟加拉紅培養(yǎng)基，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。PDB培養(yǎng)基：在1 L 蒸餾水中加入35 g 馬鈴薯葡萄糖粉末，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。大米培養(yǎng)基：將50 g 大米與50 mL 蒸餾水加入500 mL 錐形瓶中，靜置2 h 后120 ℃高壓滅菌20 min。YES 固體培養(yǎng)基：酵母提取物20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蔗糖150 g，ZnSO4·7H2O 10 mg，CuSO4·5H2O 5 mg，瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1 L，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1菌種分離與鑒定 實驗所用菌株Stilbellasp.分離自海南高山土壤，采用稀釋平板法［11］對真菌進行分離。取200 mg土樣置于裝有小鋼珠的1.5 mL EP 管中，加入800 μL 無菌水稀釋破碎混勻，隨后用無菌水稀釋1 000倍，土壤濁液涂布在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上。當觀察到有新菌落形成時，立即將其轉(zhuǎn)接到PDA 固體培養(yǎng)基上，之后繼續(xù)純化以獲得單一菌落。最后用20%甘油于-80 ℃保存菌株。菌株Stilbellasp.現(xiàn)保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號CGMCC 40422。

將真菌接種在YES 固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d，總DNA 提取采用CTAB 法［12］。采用真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）作為上下游引物擴增ITS序列，引物由金唯智生物科技有限公司合成。每個PCR反應體系為（30 μL）：上下游引物各1.2 μL，稀釋50 倍的總DNA 模板0.6 μL，2×Phanta Max Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。取3 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，成功擴增的PCR 產(chǎn)物送至金唯智生物技術有限公司測序，再用Vector NTI 軟件將序列進行雙向拼接。將獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行Blast 比對，選取同源性較高的菌株序列，用MEGA 11.0 中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，再用Bootstrap 對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，重復1 000次。

1.2.2發(fā)酵條件 用無菌接種環(huán)從Stilbellasp.菌株凍存管中挑取菌絲，接種到2 瓶裝有250 mL PDB 錐形瓶中，28 ℃恒溫振蕩（120 r·min-1）培養(yǎng)3 d 作為種子液。將種子液接種至大米固體培養(yǎng)基中（每瓶50 g 大米，50 mL 純水，120 ℃高壓滅菌，共接種100瓶），室溫下靜置培養(yǎng)10 d。

1.2.3提取分離 將大米培養(yǎng)基發(fā)酵物干燥后進行機械粉碎，乙酸乙酯浸泡提取3次，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏?？偨嘟?jīng)硅膠（200～300 目）柱層析（石油醚—乙酸乙酯，體積比1∶0→0∶1）梯度洗脫，運用薄層色譜法與高效液相分析（high performance liquid chromatography，HPLC）合并后得到9 個主流分Fr.1～Fr.9。其中Fr.2 經(jīng)反相ODS柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比68∶32）純化得到化合物3（2.1 mg）、化合物4（7.0 mg）、化合物5（4.8 mg）、化合物6（5.4 mg）和化合物8（7.3 mg）。Fr.5 經(jīng)反相ODS 柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比57∶43）純化得到化合物1（47.3 mg）和化合物2（5.9 mg）。Fr.7經(jīng)反相ODS 柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比33∶67）純化得到化合物7（4.6 mg）。

1.2.4煙曲霉酸含量測定 采用HPLC 對真菌發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯粗提物中主成分煙曲霉酸的含量進行測定，以純化的煙曲霉酸作為對照品。HPLC條件：以60%色譜乙腈/水作為流動相，采用Eclipse Plus C18分析型色譜柱（100 mm×2.1 mm×3.5 μm），柱溫25 ℃，流速0.35 mL·min-1，檢測波長為230 nm，進樣量2 μL。

儀器精密度實驗。精密稱取10 mg煙曲霉酸純品于EP 管中，加入10 mL 色譜甲醇溶解，超聲處理20 min，溶解為1 mg·mL-1。取該溶液300 μL，加色譜甲醇至1 mL，稀釋至0.3 mg·mL-1，連續(xù)使用HPLC檢測5次，統(tǒng)計各次化合物峰面積并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，以確認儀器精密度是否良好。

標準曲線的繪制。依次吸取上述1 mg·mL-1煙曲霉酸溶液100、200、300、400、500 μL于EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 mL，超聲處理20 min，得到主成分化合物對照品系列溶液。使用HPLC對上述系列對照品溶液檢測并統(tǒng)計對應色譜峰的峰面積，然后將對照品的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）作為橫坐標，對應的峰面積作為縱坐標，得出標準曲線方程。

穩(wěn)定性實驗。稱取粗提物浸膏20 mg 于EP管中，加入色譜甲醇4 mL，超聲處理20 min，溶解為5 mg·mL-1。吸取該溶液100 μL，加入色譜甲醇至1 mL，稀釋至0.5 mg·mL-1。然后將該溶液于0、2、4、6、8 h重復進樣。分別統(tǒng)計這5次測量的峰面積并計算RSD值，以確認樣品溶液在8 h內(nèi)是否穩(wěn)定。

重現(xiàn)性實驗。分別制備5份濃度為0.5 mg·mL-1供試品溶液，制備方法同穩(wěn)定性實驗。將5份溶液進行HPLC 檢測。統(tǒng)計這5 次測量的峰面積并計算RSD值，以確認該測定方法是否具有良好的重現(xiàn)性。

加樣回收試驗。依次吸取上述1 mg·mL-1對照品溶液200、400、600 μL至EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 mL，配制成0.2、0.4、0.6 mg·mL-1的對照品溶液。分別取對照品溶液各200μL至3個EP管中，再各自加入200 μL已知主成分含量的0.5 mg·mL-1粗提物供試品溶液，超聲處理20 min。將3 份混合樣品依次進行HPLC 測定，計算加入對照品的回收率。

煙曲霉酸含量測定。分別稱取50 g大米制作21 瓶大米培養(yǎng)基，于菌株發(fā)酵第3、6、9、12、15、18、21 d各取3瓶，用1.2.3的方法提取濃縮后，溶解于100 mL 甲醇中。使用HPLC 檢測各溶液，統(tǒng)計峰面積并得出煙曲霉酸與發(fā)酵時間的關系。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

將菌株CGMCC 40422 經(jīng)18S rDNA-ITS 基因測序后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用Blast進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株ITS序列與Stilbella fimetaria（登錄號FJ430712）和S. fimetaria（登錄號為KX446764）相似性均為99%。進一步從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇S. fimetaria及其近緣種的rDNA-ITS序列，與菌株CGMCC 40422 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，菌株CGMCC 40422與S. fimetaria（登錄號FJ430712）和S. fimetaria（登錄號KX446764）處于同一分支上，可信度為62%，與其他近緣種有遺傳距離（圖1）。綜合分析，將菌株CGMCC 40422初步鑒定為Stilbellasp.。

圖1 菌株CGMCC 40422與近緣種的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain CGMCC 40422 and related varieties

2.2 化合物的結構鑒定

本研究從Stilbellasp. CGMCC 40422 的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共分離共得到8 個萜類化合物（圖2），具體結構解析如下。

圖2 化合物1～8的結構式Fig. 2 Structures of compounds 1～8

化合物1 為無色晶體，ESI-MSm/z： 567.2［MH］-，分子式為C33H44O8；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.30（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.84（1H， m， H-2），2.76（1H， m， H-4），2.25（1H， m， H-5），5.22（1H，m， H-6），2.60（1H， m， H-9），1.56～1.95（2H， m，H-11），1.80～2.40（2H， m， H-12），2.56（1H， m， H-13），1.89～2.22（2H， m， H-15），5.85（1H， m， H-16），0.91（3H， s， H-18），1.43（3H， s， H-19），2.47（2H， m， H-22），2.06～2.13（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=7.0 Hz， H-24），1.59（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.26（3H， d，J=6.8 Hz， H-28），1.17（3H， s， H-29），2.10（3H， s， H-2'），1.92（3H， s， H-4'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：157.6（C-1），127.9（C-2），201.6（C-3），40.5（C-4），47.3（C-5），73.9（C-6），208.9（C-7），52.8（C-8），41.8（C-9），38.3（C-10，24.0（C-11），26.0（C-12），49.5（C-13），46.7（C-14），40.7（C-15），73.6（C-16），147.9（C-17），18.1（C-18），27.6（C-19），130.5（C-20），174.8（C-21），28.6（C-22），28.5（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.8（C-27），13.2（C-28），18.4（C-29），169.0（C-1'），20.8（C-2'），170.3（C-3'），20.6（C-4'）。上述數(shù)據(jù)與Fujimoto等［13］報道基本一致，故確定化合物1為煙曲霉酸。

化合物2：無色晶體，ESI-MSm/z：525.2［M-H］-，分子式為C31H42O7；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.31（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.85（1H， m， H-2），2.68（1H， m， H-4），2.23（1H， m， H-5），4.00（1H， m，H-6），2.56（1H， m， H-9），1.53～1.92（2H， m，H-11），1.74～2.41（2H， m， H-12，2.56（1H， m，H-13），1.84～2.21（2H， m， H-15），5.85（1H， m，H-16），0.94（3H， s， H-18），1.54（3H， s， H-19），2.42（2H， m， H-22），2.01～2.15（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=6.9 Hz， H-24），1.60（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.21（3H， d，J=6.7 Hz， H-28），1.12（3H， s， H-29），1.95（3H， s， H-2'）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：158.4（C-1），127.7（C-2），202.4（C-3），40.1（C-4），47.2（C-5），73.9（C-6），215.7（C-7），52.5（C-8），41.5（C-9），38.4（C-10），24.2（C-11），26.1（C-12），49.7（C-13），46.6（C-14），41.0（C-15），73.9（C-16），148.6（C-17），18.0（C-18），28.3（C-19），130.5（C-20），174.0（C-21），28.6（C-22），28.6（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.9（C-27），12.5（C-28），18.3（C-29），170.7（C-1'），20.5（C-2'）。上述數(shù)據(jù)與Zhu 等［14］報道基本一致，故鑒定化合物2為helvolinic acid。

化合物3：無色晶體，ESI-MSm/z：223.2［M+H］+，分子式為C15H26O；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.29～1.71（2H， m， H-2），4.24（1H， t，J=7.7 Hz，H-3），5.46（1H， m， H-5），1.83（1H， m， H-6），1.31（1H， m， H-7），1.45～1.73（2H， m， H-8），1.07～1.71（2H， m， H-9），1.61（1H， m， H-10）， 1.71（1H，m， H-11）， 0.89（3H， d，J=6.5 Hz， H-12），0.95（3H， d，J=6.5 Hz， H-13），0.87（3H， d，J=7.1 Hz，H-14），1.75（3H， s， H-15）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：46.2（C-1），32.8（C-2）， 69.1（C-3），137.6（C-4），125.6（C-5），36.5（C-6），61.4（C-7），27.5（C-8），30.0（C-9），48.0（C-10）， 31.6（C-11），23.5（C-12），24.0（C-13），14.5（C-14），19.4（C-15）。上述數(shù)據(jù)與Zhu 等［14］報道基本一致，故鑒定化合物3為tricho-acorenol。

化合物4：黃色油狀液體，ESI-MSm/z：419.1［M-H］-，分子式為C23H29ClO5；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.12（1H， s， H-8），3.33（2H， d，J=7.4 Hz， H-9），5.17（1H， t，J=7.4 Hz，H-10），2.00（2H， m， H-12），2.16（2H， m， H-13），5.44（1H， t，J=7.3 Hz， H-14），4.46 （1H， dd，J=10.3， 6.1 Hz， H-16），2.31～2.45（2H， m， H-17），1.79（3H， s， H-20），1.57（3H， s， H-21），1.16（3H，s， H-22），1.19（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1）， 139.6（C-2），114.8（C-3），159.4（C-4），116.0（C-5），162.9（C-6），14.6（C-7），195.3（C-8），22.8（C-9），123.4（C-10），135.5（C-11），40.1（C-12），26.7（C-13），128.8（C-14），134.5（C-15），79.1（C-16），40.8（C-17），219.1（C-18），81.8（C-19），16.2（C-20），11.4（C-21），22.2（C-22），24.6（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Zhang 等［15］報道基本一致，故鑒定化合物4為ascofuranone。

化合物5：無色無定形粉末，ESI-MSm/z：405.2［M-H］-，分子式為C23H31ClO4；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.60（3H， s， H-7）， 10.14（1H， s， H-8），3.36 （2H， d，J=7.2 Hz， H-9）， 5.26 （1H， t，J=7.2 Hz， H-10），1.84～1.98（2H， m， H-12），1.35～1.42（2H， m， H-13），1.97（1H， m， H-15），1.60～1.83（2H， m， H-16），2.33（2H， m， H-17），2.40（1H， m，H-19），0.56（3H， s， H-20）， 0.86（3H， d，J=6.7 Hz，H-21）， 0.88（3H， d，J= 6.7 Hz， H-22），1.83（3H，s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.3（C-1），139.6（C-2），113.4（C-3），159.2（C-4），115.9（C-5），163.0（C-6），14.6（C-7），195.2（C-8），22.9（C-9），122.9（C-10），136.8（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），42.4（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），216.9（C-18），51.4（C-19），15.6（C-20），15.3（C-21），7.9（C-22），16.6（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Singh 等［16］報道基本一致，故鑒定化合物5為ilicicolin C。

化合物6：黃色無定形粉末，ESI-MSm/z：371.2［M-H］-，分子式為C23H32O4；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.22（1H， s， H-3），2.46（3H， s， H-7），10.03（1H， s， H-8），3.85（2H， d，J=7.2 Hz， H-9），5.25（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），1.90～2.05（2H， m，H-12），1.37～1.45（2H， m， H-13），1.98 （1H， m，H-15），1.63～1.83（2H， m， H-16），2.35（2H， m， H-17），2.40（1H， m， H-19），0.53（3H， s， H-20），0.85（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.88（3H， d，J=6.8 Hz，H-22），1.79（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.1（C-1），141.9（C-2），111.1（C-3），164.6（C-4），113.9（C-5）， 164.9（C-6），18.0（C-7），194.5（C-8），20.6（C-9），123.6（C-10），136.1（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），44.7（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），217.0（C-18），51.4（C-19），15.3（C-20），15.7（C-21），7.9（C-22）16.5（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Singh等［16］報道基本一致，故鑒定化合物6為LL-Z1272?。

化合物7：黃色無定形粉末，ESI-MSm/z：421.2［M-H］-，分子式為C23H31ClO5；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.32（2H， d，J=6.5 Hz， H-9），5.61 （1H， t，J=6.5 Hz，H-10），4.25（1H， dd，J=7.3， 5.1 Hz， H-12），1.46～1.67（2H， m， H-13），2.30（1H， m， H-15），1.57～1.80（2H， m， H-16），2.25（2H， m， H-17），2.53（1H， q，J=6.6， H-19），0.51 （3H， s， H-20），0.98（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.70（3H， d，J=6.7 Hz，H-22），1.85（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），139.9（C-2），114.8（C-3），159.3（C-4），115.0（C-5），162.7（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.4（C-9），124.8（C-10），140.1（C-11），75.3（C-12），42.0（C-13），44.9（C-14），37.4（C-15），32.1（C-16），42.5（C-17），216.5（C-18），51.3（C-19），16.2（C-20），15.8（C-21），8.7（C-22），11.3（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Seephonkai 等［17］報道基本一致，故鑒定化合物7為deacetylchloronectrin。

化合物8：黃色無定形粉末，ESI-MSm/z：624.2［M-H］-，分子式為C31H43ClNO10；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.59（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.35（2H， m， H-9），5.65（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），4.31（1H， dd，J=7.9， 4.4 Hz， H-12），1.62～1.78（2H， m， H-13），2.14（1H， m， H-15），1.50～1.80（2H， m， H-16），2.00（2H， m， H-17），2.48（1H，q，J=6.6， H-19），0.52（3H， s， H-20），1.00（3H，d，J=6.6 Hz， H-21），0.68（3H， d，J= 6.5 Hz， H-22），1.76（3H， s， H-23），4.77 （1H， m， H-1'），3.87（1H， m， H-2'），3.68（1H， m， H-3'），3.55（1H， m，H-4'），3.69（1H， m， H-5'）， 3.70～3.80（2H， m， H-6'），2.02（3H， s， H-2″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），140.0 （C-2），114.5（C-3），159.4（C-4），114.9（C-5），162.6（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.5（C-9），129.8（C-10），135.6（C-11），78.7（C-12），40.5（C-13），44.8（C-14），37.2（C-15），32.0（C-16），42.4 （C-17），216.3（C-18），51.4（C-19），16.3（C-20），16.1（C-21），8.7（C-22），11.0（C-23），93.9（C-1'）， 55.2（C-2'），74.5（C-3'），72.5（C-4'），72.6（C-5'），62.8（C-6'），173.5（C-1''），22.6（C-2''）。上述數(shù)據(jù)與Subko 等［18］報道基本一致，故鑒定化合物8為ascochlorinN-acetylglucosamine。

2.3 煙曲霉酸的含量測定

2.3.1儀器精密度實驗 5次進樣測定0.3 mg·mL-1煙曲霉酸標準品（圖3A）的峰面積依次為2 158.7、2 171.9、2 153.5、2 169.2 和2 197.4。經(jīng)計算其RSD=0.8%，表明儀器精密度良好。

圖3 煙曲霉酸產(chǎn)量的測定Fig. 3 Determination of helvolic acid yield

2.3.2繪制標準曲線 標準品濃度X與標準品吸收峰面積Y之間的回歸方程：Y=6.528 8X+125.5，R2=0.998 4。煙曲霉酸質(zhì)量濃度在0.1～0.5 mg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系（圖3B）。

2.3.3穩(wěn)定性實驗 取0.5 mg·mL-1粗提物溶液（圖3C）在0、2、4、6、8 h 重復進樣測量的峰面積分別為2 723.2、2 746.3、2 753.3、2 761.3 和2 781.2。RSD 值為0.8%，確認樣品溶液在8 h 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。

2.3.4重現(xiàn)性實驗 取5 份0.5 mg·mL-1的粗提物溶液分別進樣，其吸收峰面積分別為2 715.2、2 724.9、2 714.7、2 771.1 和2 773.2。RSD 值為1.1%，確認此測定方法具有良好的重復性。

2.3.5加樣回收試驗 取質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1粗提物200 μL，分3批加入200 μL 0.2、0.4、0.6 mg·mL-1標準溶液，分別進樣檢測器峰面積，計算其回收率分別為99.2%、101.4%及102.1%，平均回收率為100.9%，RSD 值為1.5%，表明該測量方法的可信度較高。

2.3.6煙曲霉酸含量測定 將各組溶液的峰面積代入上述回歸方程，計算不同發(fā)酵時間的煙曲霉酸含量（圖3D）。結果表明，發(fā)酵6 d后，煙曲霉酸產(chǎn)量顯著升高；發(fā)酵時間15 d時，煙曲霉酸的產(chǎn)量已經(jīng)達到最大值2.98±0.09 g·kg-1。

3 討論

本課題組篩選的真菌Stilbellasp. CGMCC 40422 具有較強的萜類化合物生產(chǎn)能力。使用大米培養(yǎng)基進行發(fā)酵后，獲得了8個萜類化合物，其中主產(chǎn)物為煙曲霉酸。其中化合物1 和2 為C29原萜烷型四環(huán)三萜，化合物3為倍半萜，化合物4～8為雜萜類化合物。

據(jù)文獻報道，1942年首次從煙曲霉菌分離得到煙曲霉酸，因其具有廣泛的生物學活性而備受關注。煙曲霉酸屬于梭鏈孢烷抗生素，來源于真菌，在原萜烯醇（protostadienol）的基礎上經(jīng)C-4β去甲基化、C-16β位乙酰氧化、C-20位甲基氧化成羧基等一系列修飾反應形成的四環(huán)三萜類化合物。作為梭鏈孢烷型抗生素的代表，煙曲霉酸具有顯著抑制革蘭氏陽性菌的活性［8］。2017年，姚新生等［19］系統(tǒng)地闡明了煙曲霉酸的生物合成途徑，并測試了煙曲霉酸及其衍生物helvolinic acid抑制金黃色葡萄球菌的能力，最小抑制濃度（minium inhibitory concentration，MIC）分別為2.0 與0.5 μg·mL-1。Sanmanoch等［20］測試了煙曲霉酸對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌等細菌的抑制活性，最小抑制濃度均在16～32 μg·mL-1。Xiao等［21］發(fā)現(xiàn)煙曲霉酸對胰腺、肺、肝臟等癌細胞具有顯著的抑制作用，在抗癌復合藥物中有顯著的協(xié)同增效作用。Xu 等［22］報道該化合物能通過抑制RANKL 誘導NFATc1 激活來減弱破骨細胞的形成和功能，從而抑制骨質(zhì)疏松與骨溶解等疾病。

化合物4～8是一類由苔色酸與15個碳單位的萜類衍生物法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）酯混合而成的真菌雜萜，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等藥理活性。2019年，日本Abe等［23］闡明了化合物4與5的生物合成途徑。研究表明ascofuranone（化合物4）是藥物開發(fā)中治療癌癥、泡球蚴病（Alveolar echinococcosis）和非洲錐蟲?。ˋfrican trypanosomiasis）的先導化合物。Gutiérrez等［24］報道ilicicolin C（化合物5）對豆薯細菌性葉斑病病原菌Pseudomonas syringae具有抑制作用，IC50值為28.5 mg·mL-1，與鏈霉素和青霉素的活性相當。

CGMCC 40422 粗提物的HPLC 分析圖譜顯示，煙曲霉酸的含量最高。通過高效液相色譜法測定煙曲霉酸含量，在培養(yǎng)15 d 后產(chǎn)量達最大值3 g·kg-1。徐帆等［25］對來源于海洋的煙曲霉菌CY018發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉酸的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，最終產(chǎn)量達54.81 mg·L-1。譚雁鴻等［26］選用軟珊瑚真菌Eupenicilliumsp. DX-SER3 經(jīng)大米培養(yǎng)基發(fā)酵后提取，最終煙曲霉酸的產(chǎn)量為156.25 mg·kg-1。本文研究菌株的煙曲霉酸生產(chǎn)能力遠高于其他菌株，展現(xiàn)出了強大的萜類化合物生產(chǎn)能力，推測其萜類天然產(chǎn)物合成的上游途徑（如MVA 途徑）合成能力強，萜類合成前體（如法尼基焦磷酸、2，3-環(huán)氧鯊烯）供應充足。此外，CGMCC 40422 能夠高效生產(chǎn)煙曲霉酸等萜類化合物，推測部分修飾萜類骨架的P450 酶在該菌中表達能力強。未來如果能建立穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)，則可進一步開發(fā)為底盤細胞，低成本發(fā)酵生產(chǎn)有價值的萜類化合物如靈芝酸、甘草次酸等。