敲除hdac11基因?qū)Π唏R魚脂代謝的影響

熊茂蘭 ， 蔚思言 ， 羅軍濤 ， 韓兵社 ， 張俊芳 *

1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學國家級實驗教學師范中心，上海 201306；

2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306

甘油三酯是機體內(nèi)儲存能量的主要形式之一，對維持正常的生命活動起著重要作用［1］。哺乳動物的甘油三酯主要在肝臟中合成并儲存在脂肪組織中，而魚類的甘油三酯主要在肝臟中合成與儲存［2-3］，其肝細胞同時具有合成和分泌甘油三酯的能力。甘油三酯的合成主要包括活化和酯化2 個過程，該過程始于甘油-3-磷酸的酰化反應(yīng)生成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acids，LPA），這是一個由甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT1）催化的限速步驟［4］。甘油三酯水解為脂肪酸和甘油需要3個連續(xù)的步驟，至少涉及3 種不同的酶：脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）與單酰基甘油脂肪酶（monoglyceride lipase，MGL）。在脂肪組織中，ATGL 和HSL 在甘油三酯的水解過程中起主要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，長期大量喂養(yǎng)高脂飼料會導(dǎo)致魚體內(nèi)甘油三酯含量增加，造成脂質(zhì)代謝紊亂。魚類脂代謝紊亂不僅會影響魚肉的口感和營養(yǎng)價值［6］，還會引起魚類肝臟發(fā)生病變，如脂肪肝?。?］，對魚類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的市場價值產(chǎn)生了較大的負面影響［8］。

越來越多的研究證明，表觀遺傳修飾對脂代謝起著重要的調(diào)控作用［9］。組蛋白去乙?；?1（histone deacetylase 11，HDAC11）是一種鋅離子依賴性去乙?；福?0］。HDAC11 除了在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及癌癥中起作用外［11］，還在哺乳動物中參與了新陳代謝和肥胖的調(diào)節(jié)過程［9］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠中敲除hdac11不僅能降低肝臟甘油三酯的含量，影響肝臟脂肪變性，還能刺激棕色脂肪的形成，誘導(dǎo)白色脂肪發(fā)生褐變，增強機體的產(chǎn)熱能力［12-13］。值得注意的是，斑馬魚是變溫動物，不存在棕色脂肪［14］，其代謝調(diào)節(jié)與哺乳動物有一定差異，hdac11在魚類中是否發(fā)揮相同的作用有待進一步研究。

本研究利用CRISPR/Cas9 構(gòu)建了缺失5 bp 的斑馬魚hdac11-/-突變體，并檢測了野生型與hdac11突變體在正常和高脂飲食條件下的體重、體長、甘油三酯的含量及其相關(guān)基因的表達量，以期為探討hdac11在魚類脂代謝中的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物及其飼養(yǎng) 野生型AB 品系斑馬魚和hdac11突變體斑馬魚，在溫度為28.0±0.5 ℃，pH 6.8～7.8的斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中（Aquaneering公司）養(yǎng)殖，每日光照14 h，黑暗10 h。斑馬魚胚胎由一雌一雄自然交配產(chǎn)卵獲得，收集的斑馬魚受精卵于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑及儀器 2×TaqMaster Mix（Vazyme，P111-01），Cas9 蛋白GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease （Z03389-100，金斯瑞公司），MAXIscript?T7 Transcription Kit 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（AM1314，Invitrogen 公司），ClarityTMWestern ECL Substrate 顯影液（#1705060，Bio-Rad 公司），Immun-Blot?PVDF Membrane for Protein Blotting（#1620177，Bio-Rad公司），HDAC11 抗體（orb578601，Biorbty 公司），甘油三酯檢測試劑盒（A110-1-1，南京建成公司），油紅O粉末（O0625，Sigma公司），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（E607318，上海生工公司），4%多聚甲醛（E672002，上海生工公司），Trizol 試劑（#15596026，Ambion 公司），TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（AU341，北京全式金公司），PerfectStart?Green qPCR SuperMix（AQ601，北京全式金公司）。

主要儀器：凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司），超高靈敏度化學發(fā)光成像儀（Amersham Imager 680 RGB），熒光定量PCR 儀器（LightCycler?480Ⅱ），尼康體視顯微鏡（SMZ1500）。

1.2 實驗方法

1.2.1敲除靶點及檢測引物設(shè)計 在Ensembl 網(wǎng)站（https：//asia.ensembl.org/index.htmL）上獲取斑馬魚hdac11基因序列，并在http：//crispor.tefor.net/網(wǎng)站搜索Cas9 靶點，選擇靶點時評估其效率、脫靶和特異性，最終確定最優(yōu)靶點位于第4 外顯子上，靶點序列為：5′-GGCTCGGGAAGCCAGCGAGG-3′。通過NCBI 網(wǎng)站設(shè)計檢測靶點引物（hdac11-F 和hdac11-R），Blast 檢測引物特異性。本實驗所用引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.2體外轉(zhuǎn)錄gRNA 及純化 gRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板的上游引物前端含有T7 啟動子，其序列為：5′-TAATACGACTCACTATAGGCTCGGGAAGCCAG CGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，gRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板的下游引物序列為：5′-AAAAGCACC GACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGAC TAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAA AC-3′。gRNA 模板PCR 擴增的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；12 ℃保存。純化后的體外轉(zhuǎn)錄模板按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（MAXIscript?T7 Transcription Kit）步驟進行體外轉(zhuǎn)錄gRNA，并用LiCl沉淀法純化gRNA。

1.2.3顯微注射 按照Cas9蛋白濃度800 ng·μL-1，gRNA 濃度100 ng·μL-1混合后，注射至斑馬魚受精卵中。將未注射的同一批受精卵作為對照組，在對照組和注射組中隨機挑選10 枚受精后48 h（4 hour post fertilization）胚胎，用堿裂解法提取基因組DNA。用2×TaqMaster Mix 進行PCR 擴增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；12 ℃保存。最后將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.4hdac11純合突變體篩選 F0代性成熟斑馬魚與WT 斑馬魚雜交，獲得F1代雜合子斑馬魚。用堿裂解法提取F1代斑馬魚尾部基因組DNA，用PCR 擴增目的序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測，再將PCR 產(chǎn)物純化后進行TA 克隆，TA 單克隆測序確定突變類型。將性成熟的F1代雌雄斑馬魚進行自交產(chǎn)生F2代，F(xiàn)2代剪尾鑒定即可篩出hdac11-/-斑馬魚。

1.2.5Western blot檢測HDAC11蛋白的表達 取1 月齡的WT 和hdac11-/-斑馬魚全魚檢測HDAC11蛋白的表達，具體實驗步驟為：在各樣品中加入RIPA 細胞裂解液，超聲破碎組織提取總蛋白，隨后進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用PVDF 膜進行Western blot。5%脫脂牛奶稀釋抗體，Biorbty公司（orb578601）HDAC11抗體（1∶2 000）4 ℃孵育過夜；山羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h。TBST 清洗PVDF 膜后，使用化學發(fā)光顯影液試劑盒顯色，拍照。

1.2.6斑馬魚體重、體長測量 用200 mg·L-1三卡因?qū)?5、30、60 和90 dpf 斑馬魚麻醉，用吸水紙吸干魚體表面水分，在電子天平中稱重量（mg）。用直尺測量魚頭部最前端到尾鰭基部的距離，記為斑馬魚體長（cm）。

1.2.7石蠟切片制作 取90 dpf 斑馬魚肝臟組織，4%多聚甲醛固定24 h。將組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋。蠟塊切成5 μm 薄片，37 ℃烘烤過夜。經(jīng)過脫蠟、染色等步驟后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8冰凍切片油紅O 染色 取90 dpf 斑馬魚肝臟組織，液氮冷凍30 s，浸泡在包埋劑中，-80 ℃冷凍，切片（10 μm）。4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水浸洗掉包埋劑，60%異丙醇浸洗2 min，油紅O染液（3 g·L-1）避光染色15 min，60%異丙醇清洗2次，蒸餾水浸洗1 min，蘇木素3 min，蒸餾水清洗干凈，甘油明膠封片。

1.2.9肝臟甘油三酯含量測定 分別取3尾90 dpf WT 與hdac11突變體斑馬魚的肝臟混合為一組并稱量肝臟重量，每組設(shè)置3個重復(fù)，共計9尾魚，按照重量（g）：體積（mL）=1∶9比例，加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液，冰水浴條件下電動研磨器研磨1 min，4 ℃條件下2 500 r·min-1離心10 min，按照南京建成公司的甘油三酯試劑盒（A110-1-1）說明書取上清液，測量甘油三酯含量。另取少量上清液勻漿稀釋40倍檢測組織的總蛋白量，用于生化指標的標準化。

1.2.10斑馬魚高脂模型的建立 將5 dpf 的WT和hdac11-/-斑馬魚均分成2 組，每組各120 尾，一組進行正常飲食喂養(yǎng)（standard diet，SD），一組進行高脂喂養(yǎng)（high fat diet，HFD）。在5～15 dpf階段SD 組每日投喂1 次草履蟲，HFD 組每日投喂3 次草履蟲以及10 mL 蛋黃溶液；16～90 dpf 階段SD組每日投喂5 mg 豐年蟲·尾-1，HFD 組每日投喂60 mg豐年蟲·尾-1以及10 mL蛋黃液。

1.2.11實時熒光定量PCR Trizol 法提取WT 和hdac11-/-斑馬魚肝臟的總RNA，使用北京全式金（AU341）TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （One-Step gDNA Removal）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行第一鏈合成，使用PerfectStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒進行qPCR 擴增。在NCBI 網(wǎng)站上設(shè)計qPCR 引物（表1），以斑馬魚β-actin為內(nèi)參，檢測甘油三酯合成與分解相關(guān)基因在WT 和hdac11-/-斑馬魚中的表達水平，每個樣品重復(fù)3次實驗，基因表達水平采用相對定量方法2-ΔΔCt計算。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.12數(shù)據(jù)分析 所有實驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0進行處理，采用t檢驗對不同樣品之間的差異進行統(tǒng)計學分析（ns：P＞0.05；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.000 1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 hdac11-/-斑馬魚的構(gòu)建

將靶點設(shè)計在hdac11基因第4外顯子的反義鏈上（圖1A），gRNA與Cas9蛋白混合注入斑馬魚胚胎細胞，待胚胎發(fā)育至48 hpf提取DNA，將F0代斑馬魚經(jīng)傳代得到F2代雜合和純合斑馬魚（圖1B）。生物信息學分析表明，突變型斑馬魚序列在79 個氨基酸后提前出現(xiàn)終止密碼子（圖1C）。Western blot結(jié)果顯示，hdac11-/-斑馬魚中檢測不到HDAC11蛋白的表達，證明成功獲得缺失5 bp 的hdac11-/-斑馬魚突變體（圖1D）。

圖1 利用CRISPR/Cas9構(gòu)建hdac11突變體Fig. 1 Generation of hdac11 mutant using CRISPR/Cas9 system

2.2 正常飲食喂養(yǎng)hdac11-/-斑馬魚表型觀察

為了觀察hdac11-/-斑馬魚（KO）表型，我們檢測了正常喂養(yǎng)條件下15、30、60 和90 dpf 的野生型和突變體的體重和體長。結(jié)果顯示：與WT 相比，hdac11-/-斑馬魚的體重和體長均無顯著性差異（圖2A～B）。然而，3 月齡hdac11-/-斑馬魚雌性和雄性的體表顏色更深（圖2C）。

圖2 hdac11-/-斑馬魚表型特征Fig. 2 Phenotypic characterization of zebrafish WT and hdac11-/-

2.3 正常飲食喂養(yǎng)下hdac11-/-斑馬魚幼魚與成魚甘油三酯檢測

為了研究敲除hdac11對斑馬魚甘油三酯的影響，本實驗選取25 dpf 的WT 和hdac11-/-斑馬魚幼魚，通過油紅O 染色觀察幼魚體內(nèi)的脂滴分布情況，并檢測幼魚甘油三酯含量；用90 dpf WT 和hdac11-/-斑馬魚雄魚肝臟進行蘇木素伊紅染色、油紅O染色以及甘油三酯含量檢測。實驗結(jié)果顯示（圖3A），WT 和hdac11-/-幼魚內(nèi)臟均存在脂滴，但與WT相比，hdac11-/-脂滴更小，并且hdac11-/-肝臟位置油紅著色較淺。全魚甘油三酯含量檢測顯示（圖3B），與WT 全魚甘油三酯含量（0.004 2±0.000 5 mmol·gprot-1）相比，hdac11-/-全魚甘油三酯含量（0.001 9±0.000 3 mmol·gprot-1）顯著降低（P＜0.01）。

圖3 斑馬魚幼魚甘油三酯檢測Fig. 3 Triglyceride detection in larval zebrafish

如圖4所示，與WT相比，hdac11-/-肝臟細胞形態(tài)無明顯差異，但脂滴數(shù)量更少且變小，hdac11-/-肝臟甘油三酯含量（0.207 4±0.004 mmol·gprot-1）顯著低于WT（0.236 5±0.01 mmol·gprot-1，P＜0.05）。

圖4 斑馬魚成魚甘油三酯檢測Fig. 4 Triglyceride detection in adult zebrafish.

2.4 高脂誘導(dǎo)下hdac11-/-斑馬魚表型檢測

為了進一步研究敲除hdac11基因?qū)Π唏R魚脂代謝的影響，我們檢測了正常飲食（SD）和高脂飲食（HFD）后15、30、60 和90 dpf 斑馬魚的體重和體長，90 dpf 時雄魚肝臟的蘇木素伊紅染色、油紅O 染色以及肝臟甘油三酯含量。結(jié)果顯示：與SD 相比，HFD 組喂養(yǎng)60 d 后出現(xiàn)體重和體長的顯著變化（P＜0.000 1），但WT-HFD 與KO-HFD之間無顯著性差異（圖5A～B）。高脂誘導(dǎo)后，相比于野生型，KO-HFD 組肝臟細胞質(zhì)著色較淺，脂滴變?。▓D5C）；相應(yīng)的，如圖5D，KO-HFD 組甘油三酯含量（0.234 4±0.010 0 mmol·gprot-1）也顯著低于WT-HFD 組（0.422 8±0.020 0 mmol·gprot-1，P＜0.05）。

圖5 高脂誘導(dǎo)下hdac11-/-斑馬魚表型檢測Fig. 5 Phenotypic characterization in WT and hdac11-/- zebrafish under high fat diet

2.5 hdac11-/-斑馬魚甘油三酯相關(guān)基因表達水平檢測

為了進一步探究hdac11-/-斑馬魚甘油三酯降低的原因，我們檢測了甘油三酯分解途徑中關(guān)鍵基因pnpla2和lipeb的表達水平，這2 個基因在斑馬魚中分別編碼甘油三酯脂肪酶ATGL和激素敏感性脂肪酶HSL。同時，我們也檢測了甘油三酯合成途徑基因gpam的表達水平，該基因在斑馬魚中編碼甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（GPAT1）。RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖6），正常飲食和高脂飲食條件下，hdac11-/-肝臟中pnpla2、lipeb基因表達水平均顯著上調(diào)，gpam基因表達水平均顯著下調(diào)。

圖6 不同飲食條件下肝臟甘油三酯相關(guān)基因表達檢測Fig. 6 Expression of genes related to triglyceride under different dietary conditions

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了hdac11-/-斑馬魚模型，研究了hdac11對斑馬魚脂代謝的影響。首先，我們發(fā)現(xiàn)了正常飲食和高脂飲食下15、30、60、90 dpf的野生型與hdac11-/-斑馬魚之間體重和體長均沒有顯著差異，說明hdac11敲除對于斑馬魚的體重和體長沒有顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除hdac11后小鼠在正常飲食下沒有表現(xiàn)出體重的差異［13］，但高脂飲食誘導(dǎo)后，hdac11-/-小鼠體重相對于野生型小鼠顯著降低［12］。上述結(jié)果說明hdac11在斑馬魚和小鼠脂代謝中的作用有一定差異，可能是由于斑馬魚和小鼠的脂代謝過程有所不同。例如，研究發(fā)現(xiàn)小鼠中敲除hdac11能刺激棕色脂肪的形成，誘導(dǎo)白色脂肪褐變，促進了棕色脂肪中解偶聯(lián)蛋白-1 的表達，使脂代謝能力增強，最終導(dǎo)致高脂誘導(dǎo)下hdac11-/-小鼠體重顯著降低［12］。而魚類屬于變溫動物，體內(nèi)不存在棕色脂肪［14］，因此斑馬魚和小鼠之間脂肪組織類型與脂代謝過程的差異均可能是造成表型差異的重要原因。有趣地是，其他HDAC 家族成員也參與脂代謝的調(diào)控，例如Chatterjee 等［15］發(fā)現(xiàn)hdac9-/-小鼠在高脂飲食下體重也顯著降低。HDAC 家族成員在脂代謝調(diào)節(jié)中的作用仍有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)正常飲食和高脂飲食下hdac11-/-斑馬魚肝臟中脂滴數(shù)量均變少變小，肝臟甘油三酯含量均顯著降低，說明hdac11敲除后斑馬魚肝臟甘油三酯含量顯著下降。在小鼠中，高脂飲食條件下hdac11-/-小鼠肝臟甘油三酯、血漿甘油三酯含量均顯著降低，肝臟脂肪變性亦得以改善［12］。高脂飲食下HDAC11抑制劑能降低小鼠血清中甘油三酯的含量，而過表達HDAC11 能增加血清中甘油三酯的含量［16］。盡管目前對于正常飲食下hdac11-/-小鼠肝臟甘油三酯含量的研究尚無報道，上述結(jié)果仍提示在斑馬魚和小鼠中hdac11可以上調(diào)肝臟甘油三酯含量。同時有研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除肝臟中hdac3的小鼠正常飲食下會導(dǎo)致肝臟甘油三酯的積累［17］。這些結(jié)果說明多個HDAC 成員可能以不同的方式參與肝臟脂代謝調(diào)控。

為進一步探究hdac11調(diào)節(jié)脂代謝涉及的分子機制，我們研究了甘油三酯代謝途徑中pnpla2、lipeb和gpam基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常飲食與高脂飲食條件下突變體中pnpla2和lipeb基因表達水平均顯著上調(diào)，gpam基因表達水平均顯著下調(diào)。pnpla2基因編碼的ATGL 參與甘油三酯分解的第一步［18］，lipeb基因編碼的HSL 是甘油三酯分解的限速酶［19］，gpam基因編碼GPAT1，該酶催化甘油三酯合成的第一步反應(yīng)。已有研究報道，斑馬魚中敲除pnpla2會導(dǎo)致脂滴體積增大，引起嚴重的甘油三酯沉積［20］；lipeb-/-小鼠在許多組織中存在大量甘油三酯的積累［21］，GPAT1-/-小鼠體重、肝臟甘油三酯含量降低；高脂飲食后，與野生型相比，GPAT1-/-小鼠肝臟甘油三酯積累較少［22-23］。這些研究結(jié)果支持了我們在hdac11敲除的斑馬魚中檢測到的基因表達水平變化和甘油三酯含量降低的現(xiàn)象。這提示斑馬魚中敲除hdac11可能通過影響pnpla2、lipeb和gpam基因的表達水平，增加對甘油三酯的分解，減少甘油三酯的合成，導(dǎo)致甘油三酯含量降低。

綜上所述，本研究構(gòu)建了hdac11斑馬魚敲除模型，初步研究了hdac11在斑馬魚脂代謝中的作用，為魚類脂代謝過程中的表觀調(diào)控機制提供了新的研究方向。