棉花萌發(fā)期抗旱指標(biāo)篩選及種質(zhì)資源抗旱性綜合評價

陳金萍 ， 陳全家 ， 鄭凱 ， 浦元春 ， 徐江淋 ， 周婷 ， 楊椰珺 ，孫國清

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教育部棉花工程研究中心，烏魯木齊 830052；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；

3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801

除去冰川，地球上可用的淡水資源僅為總水量的0.26%［1］。當(dāng)前，世界上農(nóng)業(yè)用水量超過了總用水量的70%（發(fā)展中國家占86%），隨著全球氣候的變化，這個比例還在增長［2］。種子萌發(fā)期是作物對干旱的敏感時期，也是體現(xiàn)作物抗旱能力的重要時期，作物萌發(fā)期的生長情況直接關(guān)系到后期出苗率以及最終的產(chǎn)量形成。萌發(fā)期的抗旱評價是篩選抗旱作物品種的重要途徑之一，抗旱性指標(biāo)可以反映農(nóng)作物抗旱性強弱。發(fā)芽勢、發(fā)芽率則作為種子發(fā)芽能力的重要指標(biāo)，分別反映了種子的發(fā)芽速度和發(fā)芽能力。因此選擇與農(nóng)作物抗旱顯著相關(guān)的鑒定指標(biāo)是抗旱鑒定過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。

棉花（Gossypiumspp.）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時，棉籽的含油量僅次于大豆，也是重要的油料作物。干旱是影響棉花生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的主要非生物脅迫之一［4］。目前，關(guān)于棉花田間種植從苗期到花鈴期的抗旱性評價指標(biāo)的研究很多［5-11］，在室內(nèi)針對棉花萌發(fā)期的抗旱性指標(biāo)研究較少［12-14］，且大多采用隸屬函數(shù)分析法評價作物抗旱性指標(biāo)［12，15-17］，而采用多種分析方法相結(jié)合對棉花抗旱性進(jìn)行綜合評價的研究未見報道。鑒于分析單一指標(biāo)易造成結(jié)果上的片面性和不穩(wěn)定性，本試驗將相關(guān)性分析和隸屬函數(shù)分析方法相結(jié)合，進(jìn)行綜合評價，以期有效提高評價標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 供試棉花材料

供試40 個棉花種質(zhì)材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，材料詳情如表1所示。

表1 供試40個棉花品種Table 1 40 cotton varieties for testing

1.2 試驗設(shè)計

本試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所開展。利用PEG 模擬干旱脅迫，采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法：選用15%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，以蒸餾水為對照。每個處理重復(fù)3 次。在試驗開始前1 天將試驗所用到的所有培養(yǎng)皿和培養(yǎng)箱用70%酒精消毒處理，并將處理后的培養(yǎng)皿用蒸餾水清洗，置于培養(yǎng)箱內(nèi)晾干。將棉籽脫絨，挑選籽粒飽滿、大小均一的種子，75%酒精浸泡3 min，蒸餾水沖洗3 次，然后試驗組和對照組分別用15%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的PEG-6000溶液和等量且適量的蒸餾水浸泡種子24 h，待種子充分吸漲后，放入直徑為9 cm培養(yǎng)皿中，鋪2層濾紙，每皿放50粒棉花種子（每個棉花品種300粒種子）。每皿中加入10 mL 液體，保持種子濕潤，置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，16 h/8 h 光照/黑暗培養(yǎng)7 d。每天更換濾紙和處理液，以防止種子萌發(fā)過程霉變，保證滲透勢恒定。

1.3 指標(biāo)測定

為了測定種子萌發(fā)期的形態(tài)指標(biāo)，在種子浸泡20 h 時測定種子吸水率。從第2 天開始每天19∶00調(diào)查一次發(fā)芽數(shù)，以胚根突破種皮2 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計7 d 內(nèi)的種子萌發(fā)數(shù)量。以第2天的種子發(fā)芽數(shù)計算發(fā)芽勢，第7 天的種子發(fā)芽數(shù)計算發(fā)芽率。第7 天時從每個培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取5株長勢一致且具有代表性的幼苗，測定幼苗的胚根鮮重、胚根干重、胚芽鮮重、胚芽干重、下胚軸長、胚根長。105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后稱量干重。按照公式（1）～（10）計算種子吸水率、相對種子吸水率、發(fā)芽勢(ger min ation energy， GE)、相對發(fā)芽勢(relative ger min ation energy，RGE)、發(fā)芽率（germin ation rate， GR）、相對發(fā)芽率（relative germination rate，RGR）、萌發(fā)指數(shù)、相對胚根長(relative radicle length， RRL)、相對下胚軸長（relative hypocotyls length， RHL）、胚根/下胚軸指數(shù)(index of RRL/RHL)。

式中：GR2、GR4和GR7分別為第2、4 和7 天的種子發(fā)芽率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及隸屬函數(shù)分析，SPSS 26.0 軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。

1.4.1抗旱性綜合評價 采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗旱綜合評價。隸屬函數(shù)值參照溫蕊等［16］的計算方法。

（11）～（14）式中，Xij為i品種第j項指標(biāo)測定值；Xjmin為全部品種第j項指標(biāo)的最小值；Xjmax為全部品種第j項指標(biāo)的最大值；μ（Xij）為i品種第j項指標(biāo)的隸屬函數(shù)值表示全部品種第j項指標(biāo)的平均值；Vj表示第j項指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)；Wj表示第j項指標(biāo)權(quán)重；D表示各品種的抗旱性綜合評價，D值越大，抗旱性越強［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對棉花種子萌發(fā)特性的影響

40個棉花材料在15% PEG模擬的干旱條件和正常條件下48 h的萌發(fā)情況及7 d的生長狀態(tài)分別如圖1和圖2所示。從圖中可以看出，相比于對照，干旱處理下棉花種子的發(fā)芽及生長均受到抑制。

圖1 40個棉花材料在干旱與正常條件下48 h的萌發(fā)情況Fig. 1 48 hours germination of 40 cotton materials under drought resistance and control condition

圖2 40個棉花材料在干旱與正常條件下7 d的生長狀態(tài)Fig. 2 7 days growth state of 40 cotton materials under drought resistance and control condition

如表2所示，15% PEG 模擬干旱脅迫下，40個供試棉花材料相對吸水率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對萌發(fā)指數(shù)、相對胚根長、相對下胚軸長、相對胚根干重及相對胚芽干重的均值均低于1，表明干旱脅迫抑制了種子萌發(fā)。

表2 干旱脅迫下棉花種子萌發(fā)特性相對值Table 2 Relative values of cotton seed germination characteristics under drought stress

2.2 相關(guān)性分析

7 個測定指標(biāo)相對值的相關(guān)分析（表3）表明，相對吸水率與相對發(fā)芽勢之間，相對發(fā)芽率、相對萌發(fā)指數(shù)與相對發(fā)芽勢兩兩之間，相對胚芽干/鮮重與相對發(fā)芽率之間，相對胚根干/鮮重、相對胚芽干/鮮重與胚根/下胚軸指數(shù)兩兩之間，均呈極顯著正相關(guān)；相對吸水率與相對萌發(fā)指數(shù)之間，相對發(fā)芽率與相對胚芽干/鮮重之間，均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)；相對萌發(fā)指數(shù)與相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率之間，相對胚芽干/鮮重與胚根/下胚軸指數(shù)之間，表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系。雖然相對胚芽干/鮮重與胚根/下胚軸指數(shù)組合的相關(guān)系數(shù)較高（R2=0.794），但相對萌發(fā)指數(shù)與相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)都更接近1，因此選擇相對萌發(fā)指數(shù)、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率這3 個指標(biāo)更能體現(xiàn)出供試40個棉花材料萌發(fā)期的抗旱能力。

表3 不同品種的7個指標(biāo)之間相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)系數(shù)）Table 3 Correlation analysis between seven indicators of different varieties (Pearson correlation coefficient)

2.3 棉花萌發(fā)期抗旱性綜合性評價

用隸屬函數(shù)法對40 個棉花材料的種子吸水率、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)、胚根/下胚軸指數(shù)、胚根干/鮮重、胚芽干/鮮重的相對值進(jìn)行了綜合性評價，如表4所示，得到40個棉花材料萌發(fā)期的綜合抗旱能力D值。供試40 個棉花材料D值在0.02～0.90 范圍內(nèi)，其中NDLM289（中85271）抗旱性最強，D值為0.90，NDLM347（CF75 落6）抗旱性最弱，D值為0.02，NDLM071（邯284）、NDLM222（新陸中11）、NDLM287（中5765）抗旱性居中，D值分別為0.22、0.21、0.21。

2.4 7 個指標(biāo)與隸屬函數(shù)綜合評價值的相關(guān)性分析

本試驗分析了7 個種子萌發(fā)特性指標(biāo)與綜合指標(biāo)D值的相關(guān)性（表5），其中胚根/下胚軸指數(shù)與D值相對獨立，相對吸水率、胚根及胚芽干/鮮重與D值存在顯著弱正相關(guān)，可作為棉花萌發(fā)期抗旱性鑒定的參考指標(biāo)，相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率及萌發(fā)指數(shù)與D值存在極顯著強正相關(guān)，可作為棉花萌發(fā)期抗旱性鑒定的主要指標(biāo)。綜合表3 與表5數(shù)據(jù)，我們選取相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率及相對萌發(fā)指數(shù)這3個指標(biāo)作為供試40個棉花種質(zhì)材料萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)。

表5 棉花種子萌發(fā)期7個指標(biāo)與隸屬函數(shù)綜合評價值的相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)系數(shù)）Table 5 Correlation analysis between seven indexes at the germination stage of cotton seeds and the comprehensive evaluation value of membership function(Pearson correlation coefficient)

3 討論

棉花具有一定的耐旱能力，萌發(fā)期的種子對水分尤其敏感，干旱缺水嚴(yán)重影響了種子萌發(fā)。一般在室內(nèi)進(jìn)行作物萌發(fā)期的抗旱性鑒定，實驗室內(nèi)條件易控、可操作性強、試驗周期較短，現(xiàn)已在多種農(nóng)作物上開展了相關(guān)研究［17，19-23］。PEG 作為植物抗旱性選擇劑或水分脅迫劑［24-26］，常用于模擬土壤的自然水分脅迫狀況。常用的PEG 脅迫試劑種類有PEG-2000、PEG-6000 和PEG-8000，其中以PEG-6000的研究報道最多，在相同水勢下PEG-6000 對植物水分生理產(chǎn)生的影響和土壤干旱相似［27］。因此，本試驗采用PEG-6000模擬干旱脅迫，在人工氣候箱內(nèi)對40 個供試棉花品種進(jìn)行脅迫處理，每處理設(shè)置3次重復(fù)以減小誤差。

相關(guān)系數(shù)是衡量觀測數(shù)據(jù)之間相關(guān)程度的指標(biāo)，一般情況下，相關(guān)系數(shù)越大表明相關(guān)程度越高，相關(guān)系數(shù)在0.3～0.5 范圍內(nèi)為弱相關(guān)、在0.5～0.7 范圍內(nèi)為中度相關(guān)、在0.7～0.9 范圍內(nèi)為強相關(guān)。表3 中各指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明，雖然相對胚芽干/鮮重與胚根/下胚軸指數(shù)組合的相關(guān)系數(shù)較高（R2=0.794），但相對萌發(fā)指數(shù)與相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)都更接近1，因此選擇相對萌發(fā)指數(shù)、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率這3個指標(biāo)更能體現(xiàn)出供試40 個棉花材料萌發(fā)期的抗旱能力。

對7 個種子萌發(fā)特性指標(biāo)與綜合指標(biāo)D值的相關(guān)性分析表明，除胚根/下胚軸指數(shù)外，其他6個指標(biāo)與D值均有相關(guān)性，均可作為萌發(fā)期抗旱性的鑒定指標(biāo)，而相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率及萌發(fā)指數(shù)與D值存在極顯著的強正相關(guān)（0.7＜R2＜0.9，P＜0.01），因此，我們選取這3 個指標(biāo)作為供試40 個棉花種質(zhì)材料萌發(fā)期抗旱性的鑒定指標(biāo)。

孫瑤等［12］通過隸屬函數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率、下胚軸長度和48 h吸水率的相對值可作為棉花的抗旱性評價綜合指標(biāo)。而本研究通過相關(guān)性分析與隸屬函數(shù)法相結(jié)合的方法，證明相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率及萌發(fā)指數(shù)可作為試驗40 個棉花材料的抗旱性綜合評價指標(biāo)。這可能是由于分析方法不同，以及供試的棉花材料不同造成的。除了萌發(fā)期外，其他生育階段對棉花最終產(chǎn)量的形成也有較大影響。陳玉梁等［28］以白棉和彩棉為材料進(jìn)行干旱處理，分別在花鈴期和吐絮盛期測定了多個農(nóng)藝性狀指標(biāo)，最終認(rèn)為單株鈴數(shù)、單鈴重和花鈴期葉片數(shù)可作為棉花抗旱性鑒定的農(nóng)藝性狀指標(biāo)。水分虧缺對于棉花全生育期的影響可綜合不同發(fā)育時期的鑒定指標(biāo)來體現(xiàn)。對于其他植物，如苜蓿，主要以根長、發(fā)芽率和活力指數(shù)作為萌發(fā)期抗旱性鑒定的首選指標(biāo)［26］；模式植物狗尾草的萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)分為3個等級［29］，依次為鮮重、根長和芽長、發(fā)芽率；糧食作物水稻在萌發(fā)期以胚芽干重、發(fā)芽率、胚芽鞘長和根冠比作為水稻抗旱性鑒定的主要指標(biāo)［30］。這些結(jié)果都表明發(fā)芽率在作物萌發(fā)期的重要性。

隨著我國棉花主產(chǎn)區(qū)的“東退西進(jìn)”，2022 年新疆地區(qū)的棉花栽培面積占我國棉花總面積的83.22%。在新疆地區(qū)棉花生產(chǎn)過程中主要采用膜下水肥一體化的栽培措施，利用有限的水資源保證棉花穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)。尤其是棉花播種之后約2 個月不澆水，主要依賴播種前灌水和覆蓋地膜來保證棉花苗期免受干旱危害并且完成營養(yǎng)生長階段。因此，棉花品種的抗旱性狀決定著幼苗發(fā)育狀態(tài)和后期的產(chǎn)量形成。棉花抗旱材料的選育是推進(jìn)棉花產(chǎn)業(yè)的重要手段。盡管目前對棉花的抗旱性研究已有較多報道，尤其是通過基因工程手段鑒定抗旱基因［31-35］，是目前棉花研究領(lǐng)域的一大熱點，在此基礎(chǔ)上，如何評價棉花的抗旱性就顯得尤為重要，抗旱性指標(biāo)是鑒別作物抗旱能力的簡單、直觀方法，無論是篩選抗旱品種，還是驗證基因編輯材料的抗旱性，都需要這些具體評價指標(biāo)的支撐。本研究搜集了40 個棉花品種，利用PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫，通過搜集7 個指標(biāo)對不同品種的抗旱能力進(jìn)行綜合評價，發(fā)現(xiàn)相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率及相對萌發(fā)指數(shù)這3 個指標(biāo)可綜合評價供試40 個棉花材料萌發(fā)期的抗旱性，并且依據(jù)這3 個綜合評價指標(biāo)，從供試40 個棉花材料中篩選出了強抗旱性品種及弱抗旱性品種，分別是‘中85271’抗旱性最強，‘CF75 落6’抗旱性最弱。不同品種材料在萌發(fā)期的抗旱性不同，這為闡明棉花耐旱分子機(jī)制提供了較好的供體材料。對于棉花優(yōu)異新種質(zhì)的選育，可選用強干旱耐受品種為親本之一，利用傳統(tǒng)育種方法多年雜交，實現(xiàn)棉花耐逆與高產(chǎn)結(jié)合。本研究結(jié)果提供了棉花萌發(fā)期的抗旱性評價方法，并為抗旱棉花品種的選育提供了理論依據(jù)。