孤獨癥譜系障礙實驗?zāi)Ｐ脱芯窟M展

方靖靖 ， 黃昆侖，2，3 ， 仝濤，2，3

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，精準營養(yǎng)與食品質(zhì)量重點實驗室；教育部功能乳品重點實驗室，北京 100083；

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；

3.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一組以社交溝通缺陷、語言溝通障礙和刻板行為為特征的異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新報告表明，大約每100 名兒童中就有1 人患有ASD，且男性的患病率高于女性［1］?，F(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)表明，環(huán)境、遺傳因素均能使兒童更容易罹患ASD。近年來，ASD患病率不斷上升，不僅嚴重影響患者及其家庭的正常生活，還給社會帶來巨大負擔。盡管早期行為和教育干預(yù)可以在一定程度上改善ASD 患者的表觀癥狀，但目前ASD 的發(fā)病機制尚不明確，針對ASD 核心癥狀的有效治療手段仍然非常有限。因此，迫切需要深入探究ASD 的病因及病理生理過程，以期為開發(fā)ASD的臨床診療措施提供理論依據(jù)。

在過去的十年中，ASD的診斷體系不斷發(fā)展，目前ASD 的診斷主要依賴于臨床觀察和行為特征?！毒裾系K診斷與統(tǒng)計手冊（第五版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，5th Edition，DSM5）定義了ASD 診斷標準的2 個核心領(lǐng)域，包括在多種情境下持續(xù)的社會溝通和社會互動障礙以及限制性、重復(fù)的行為、興趣或活動模式。這些癥狀自患者幼兒期開始出現(xiàn)，并在當前的社會、職業(yè)或其他重要功能領(lǐng)域造成有臨床意義的損害。此外，DSM5 定義的這些障礙與智力障礙或全面發(fā)育遲緩無關(guān)［2］。

目前對ASD的研究主要依賴于動物模型和細胞模型。成功可靠的實驗?zāi)Ｐ褪茄芯緼SD的基石。截至目前，國內(nèi)外各實驗室成功構(gòu)建的ASD細胞模型包括PC12細胞、SH-SY5Y細胞、人誘導(dǎo)多能干細胞、淋巴母細胞系和原代神經(jīng)元等。成功構(gòu)建的ASD 動物模型包括非哺乳動物模型、產(chǎn)前丙戊酸（valproic acid，VPA）暴露模型、BTBR 特發(fā)性小鼠模型、母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型、基于ASD 易感基因構(gòu)建的嚙齒類動物模型和非人靈長類動物模型等。文章重點介紹了上述細胞模型和動物模型的特點和構(gòu)建方法，并總結(jié)了各模型的優(yōu)缺點，以期為ASD 相關(guān)研究提供線索和基礎(chǔ)。

1 細胞模型

近年來，細胞模型越來越多地應(yīng)用于ASD 的基礎(chǔ)研究中。PC12 細胞、SH-SY5Y 細胞、hiPSCs、LCLs 和原代神經(jīng)元等是目前ASD 研究中常用的細胞模型。ASD細胞模型的建立和應(yīng)用可以彌補動物模型造模周期長、干擾因素多等局限，對ASD候選藥物的研發(fā)和篩選具有重要意義。

1.1 PC12細胞

PC12細胞為單克隆細胞系，由Greene和Tisehler 從可移植大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤中提?。?］。PC12細胞是研究神經(jīng)發(fā)育的標準細胞模型，常用于ASD、帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究中。

在ASD研究中，可以利用PC12細胞探索ASD易感基因的功能，包括神經(jīng)連接蛋白-3（neuroligin-3，NLGN-3）、人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（human phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）、Rab3 相互作用分子3 等基因。例如，He 等［4］報道了PTEN與PC12 細胞的多巴胺功能障礙和異常行為相關(guān)。PTEN在ASD 的發(fā)展過程中可能通過抑制PI3K/CREB 通路降低酪氨酸羥化酶的表達水平，為ASD 的治療提供了潛在的治療靶點。此外，PC12 細胞還被用于探索相關(guān)環(huán)境因素誘發(fā)ASD 的分子機制。孕期暴露于丙戊酸（valproic acid，VPA）、沙利度胺和酒精是ASD 的環(huán)境誘發(fā)因素，這些致畸物可能通過改變基因表達從而干擾大腦發(fā)育。Rout 等［5］研究了這3 種化合物對PC12 細胞模型中50 種不同轉(zhuǎn)錄因子的影響，研究結(jié)果表明GATA 結(jié)合蛋白3 基因表達的改變可能與ASD的發(fā)生有關(guān)。

然而，PC12 細胞也有其局限性。例如，在使用PC12 細胞研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和藥物作用機制時，應(yīng)考慮到PC12細胞是一種腫瘤細胞，其形態(tài)和特征在多次傳代后會發(fā)生變化。

1.2 SH-SY5Y細胞

SH-SY5Y 細胞來源于人神經(jīng)母細胞瘤細胞系，具有神經(jīng)元樣形態(tài)和生理特性。此外，SHSY5Y細胞可以分化為皮質(zhì)樣神經(jīng)元，是研究神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)表型和神經(jīng)退行性疾病的良好細胞模型。

在ASD 的相關(guān)研究中，常利用SH-SY5Y 細胞探索ASD 易感基因的功能，篩選新的ASD 易感基因。例如，據(jù)Unsicker 等［6］報道，SHANK2中一個或兩個等位基因的移碼突變可導(dǎo)致SH-SY5Y 細胞中神經(jīng)元分化的改變，主要表現(xiàn)為細胞生長和突觸前/突觸后蛋白表達的變化。SHANK2突變還影響細胞酪氨酸激酶受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和淀粉樣前體的表達。此外，有研究者利用SH-SY5Y 細胞探索ASD 發(fā)病的分子機制。Kalkan 等［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α 可通過激活Caspase-3 凋亡級聯(lián)誘導(dǎo)神經(jīng)變性。對SH-SY5Y 細胞中甲基化區(qū)域的分析表明，SH-SY5Y 細胞中高度甲基化區(qū)域的基因顯著富集于鈣離子信號、突觸傳遞和神經(jīng)元分化以及ASD 候選基因，提示基因甲基化可能是ASD的病因之一［8］。

SH-SY5Y 細胞模型也存在一定的局限性。例如，與hiPSCs 等其他細胞模型相比，SH-SY5Y細胞不能用于觀察神經(jīng)發(fā)育過程。與原代神經(jīng)元相比，未分化的SH-SY5Y 細胞對神經(jīng)毒素和神經(jīng)保護藥物的敏感性較低。

1.3 人誘導(dǎo)多能干細胞

人誘導(dǎo)多能干細胞（human induced pluripotent stem cells， HiPSCs）是一種類似于胚胎干細胞的細胞類型，由日本科學(xué)家Takahashi 等［9］通過在分化的體細胞中引入Oct-4、Sox-2、Klf4 和c-Myc 4 種轉(zhuǎn)錄因子來重編程體細胞而獲得。近年來，HiPSCs 的發(fā)展為單基因突變或特發(fā)性突變ASD 患者的神經(jīng)發(fā)育或精神疾病建模，以及開發(fā)針對特定ASD患者的個體化醫(yī)療提供了全新的機會。

HiPSCs 常用于探索ASD 易感基因的功能及相關(guān)基因突變誘發(fā)ASD 的分子機制。許多ASD患者存在唐氏綜合征細胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecules，DSCAM）基因突變，Lim 等［10］利用來自ASD 患者的HiPSCs 細胞模型發(fā)現(xiàn)，DSCAM 突變可能通過損害NMDA 受體功能導(dǎo)致ASD 的相關(guān)表型。此外，HiPSCs 還可用于開發(fā)ASD 的潛在治療方法。例如，Marchetto 等［11］發(fā)現(xiàn)來自ASD患者的HiPSCs細胞增殖增加，表現(xiàn)出異常的神經(jīng)發(fā)生和突觸功能，而胰島素生長因子1處理可以改善這些神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)缺陷。Chiola 等［12］提出HiPSCs 本身也可以作為修復(fù)ASD 患者受損腦回路的工具。Jong等［13］利用來自接觸蛋白關(guān)聯(lián)蛋白樣蛋白2（contactin associated protein-like 2，CNTNAP2）突變的ASD 患者的HiPSCs 產(chǎn)生了前腦類器官，并研究了CNTNAP2突變對胚胎皮質(zhì)發(fā)育的影響。上述結(jié)果提示，HiPSCs 和腦類器官技術(shù)的發(fā)展為研究ASD 的潛在機制和探索治療途徑提供了新思路。

HiPSCs 也存在一定的局限性，如不能觀察到典型的病理表型。此外，在HiPSCs 制備中使用的核心轉(zhuǎn)錄因子之一c-Myc 已被證明是一種癌基因，可能導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變，應(yīng)用HiPSCs 進行ASD相關(guān)研究時，應(yīng)嚴格控制其致瘤風險。

1.4 淋巴母細胞系

淋巴母細胞系（lymphoblastic cell lines， LCLs）亞群分析是檢測細胞免疫和體液免疫的重要指標，可總體反映機體當前的免疫功能和狀態(tài)。此外，LCLs 還可輔助診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對研究ASD發(fā)病機制和觀察藥物療效具有重要意義。

已有多項研究利用LCLs 探討了ASD 的相關(guān)分子機制，并為ASD 的藥物開發(fā)提供了新的研究工具。Nayan 等［14］利用LCLs 發(fā)現(xiàn)ASD 患者來源的LCLs超氧化物歧化酶活性較低，丙二醛和細胞內(nèi)DNA 損傷水平較高，而無刺蜂蜜處理可以扭轉(zhuǎn)這一變化。丁酸可顯著改善ASD 患者來源的LCLs 線粒體功能障礙，還可激活免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，改善ASD疾病狀態(tài)的能量代謝［15］。

盡管LCLs 是細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的主要研究材料，但也存在一些局限性。例如，LCLs在采集后難以保存，不能傳代培養(yǎng)，患者的LCLs樣本往往需要反復(fù)采集。

1.5 原代神經(jīng)元

原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)時間短，其遺傳性狀與體內(nèi)細胞相似，適用于神經(jīng)元形態(tài)、功能及分化的相關(guān)研究。與多次傳代的細胞相比，原代神經(jīng)元更接近于神經(jīng)元在體內(nèi)的正常發(fā)育狀態(tài)，具有簡便、快速、條件易控制、藥理靶點明確、干擾因素少、結(jié)果易觀察等優(yōu)點。

研究發(fā)現(xiàn)VPA 預(yù)處理原代神經(jīng)元后，Wnt/β-catenin 信號通路中關(guān)鍵信號分子β-catenin 和磷酸化糖原合成酶激酶3 的表達增加，提示VPA處理激活原代神經(jīng)元中Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。VPA干預(yù)的原代神經(jīng)元可以很好地模擬ASD 患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的異常狀態(tài)。VPA 還可抑制原代細胞樹突和軸突的生長，從而影響神經(jīng)元的發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的成熟［16］。此外，NLGN 表達異常與ASD的發(fā)生有關(guān)，使用原代神經(jīng)元進行研究發(fā)現(xiàn)，NLGN并不影響突觸數(shù)量，而是影響突觸的抑制和興奮功能，從而導(dǎo)致社交障礙等ASD相關(guān)的行為異常［17］。

原代神經(jīng)元還存在不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境等缺點，限制了原代神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究中更廣泛的應(yīng)用。表1總結(jié)了各種細胞模型在ASD研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點。

2 非哺乳動物模型

非哺乳動物模式生物如果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚等也被用于ASD 的相關(guān)研究中。非哺乳動物模型不僅具有高通量、短壽命、短生殖周期、加速代際研究等與細胞模型相似的優(yōu)勢，而且具有較高的基因保守性，可用于ASD 相關(guān)的病理特征探索以及社會行為變化觀察。此外，這些非哺乳動物模型還被用于ASD 候選基因、環(huán)境因素及候選藥物的高通量分析和快速篩選。但非哺乳動物模型在生理、解剖和行為特征等方面與人類差異均較大。

2.1 果蠅

果蠅具有繁殖周期短、產(chǎn)量高、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點。此外，果蠅基因組相對簡單和保守。因此，果蠅可廣泛用于包括ASD 在內(nèi)的精神疾病的分子機制研究。

果蠅脆性X 智力低下1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1）基因與人類該基因同源性達35%，相似性達56%。Kanellopoulos 等［18］進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1的缺失增加了突觸代謝型谷氨酸受體的表達，降低了環(huán)磷酸腺苷的表達，導(dǎo)致果蠅的學(xué)習(xí)記憶缺陷。利用果蠅構(gòu)建雙酚A誘導(dǎo)的ASD 模型，表現(xiàn)出類似ASD 的行為特征，如重復(fù)行為和異常的社會行為［19］。這些研究結(jié)果證實了果蠅作為研究ASD 動物模型的可行性，為探索相關(guān)易感基因和環(huán)境因素誘發(fā)ASD 的分子機制奠定了研究基礎(chǔ)。

2.2 秀麗隱桿線蟲

秀麗隱桿線蟲具有保守、簡單的神經(jīng)元通路，為篩選ASD 易感基因和探索相關(guān)分子機制提供了強有力的工具。Helena 等［20］利用SFARI Gene數(shù)據(jù)庫（http：//gene-archive.sfari.org，version3.0）鑒定了秀麗隱線蟲中人類ASD 相關(guān)易感基因的同源基因，并篩選出在社會行為中起作用的新的候選基因，這些基因突出了突觸在ASD 中的重要貢獻，主要涉及細胞信號傳導(dǎo)、表觀遺傳學(xué)和磷脂代謝等功能。Troy 等［21］利用秀麗隱桿線蟲表征了ASD 相關(guān)基因的功能，并量化了135 個突變的26種表型，涵蓋形態(tài)、運動、觸覺敏感性和學(xué)習(xí)習(xí)慣。還有研究利用秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)了以CHD8·CHD7和NLGN-3·NLGN-1為中心的感覺反應(yīng)和學(xué)習(xí)的基本網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)NLGN-1的R433C錯義突變可導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的社會功能障礙，NLGN-1的重新表達可以恢復(fù)NLGN-1突變秀麗隱桿線蟲的感覺和學(xué)習(xí)障礙［22］。此外，一些研究利用秀麗隱桿線蟲探索治療ASD 的候選藥物。例如，Kathrin 等［23］通過秀麗隱桿線蟲篩選出具有ASD 相關(guān)運動缺陷表型的突變體，并對超過3 900種化合物進行了全面的藥物篩選。

2.3 斑馬魚

斑馬魚作為新興模型，具有繁殖快、交配行為受光控制、產(chǎn)卵多、體外受精、早期胚胎整體透明、易于使用藥物等優(yōu)點。在行為學(xué)方面，斑馬魚模型表現(xiàn)出相對簡單和定義明確的感覺運動行為。此外，斑馬魚具有同質(zhì)性偏好和群落聚集的特征，可用于社會行為研究。近年來，斑馬魚因其較高的遺傳操作效率和顯著的行為表型，成為研究ASD極具吸引力的模式生物。

目前，一些研究利用斑馬魚模型探索VPA 等環(huán)境因素引發(fā)ASD樣行為的分子機制。例如，VPA處理的斑馬魚表現(xiàn)出類似ASD的癥狀，如細胞增殖降低、顏色偏好降低、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神經(jīng)元分化受損［24］。在斑馬魚中對神經(jīng)分子機制的研究為未來ASD的靶向治療提供了重要線索。此外，還有研究利用斑馬魚探索了ASD易感基因?qū)ι窠?jīng)發(fā)育和自主行為的影響。Gauthier等［25］發(fā)現(xiàn)下調(diào)SHANK3同源基因的表達可以降低斑馬魚的頭圍和游泳時對觸摸的反應(yīng)能力。

2.4 鳴禽類

除上述ASD 動物模型外，斑胸草雀等鳴禽動物模型也可用于ASD 的相關(guān)研究。斑胸草雀具有良好的發(fā)聲學(xué)習(xí)能力，可用于模擬語言交流障礙，研究ASD 易感基因和語言相關(guān)基因在鳴禽學(xué)習(xí)發(fā)聲環(huán)路中的作用。例如，在鳴禽類ASD 動物模型中發(fā)現(xiàn)CNTNAP2與ASD 相關(guān)，并廣泛存在于人類語言相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路中［26］。

非哺乳動物模型在生理、解剖和行為特征等方面與人類差異均較大，表2 總結(jié)了該類模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點。

表2 非哺乳動物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點Table 2 The application, advantages, and disadvantages of non-mammalian models in ASD study

3 嚙齒類動物模型

嚙齒類動物的基因與人類具有高度同源性，針對已知的ASD 風險基因和環(huán)境風險因素，目前已經(jīng)建立了多種嚙齒類動物模型。嚙齒類動物模型成本低、妊娠期短、產(chǎn)仔數(shù)高，研究嚙齒類動物模型的行為和生理特性的方法也相對詳盡。此外，嚙齒類動物的基因操作工具豐富，單基因嚙齒類動物模型可以用來解釋特定基因的功能，但并不能代表大多數(shù)人類的ASD 疾病。然而，嚙齒類動物和人類在許多方面存在著較大差異，如大腦解剖和行為特征。這些差異使得嚙齒類動物模型在ASD 研究中的轉(zhuǎn)化價值成為一個有爭議的問題。小鼠和大鼠都被廣泛用于構(gòu)建與ASD 相關(guān)的嚙齒動物模型，而大鼠具有更廣泛的社會行為和更復(fù)雜的聲學(xué)交流系統(tǒng)，其中特定的超聲發(fā)聲（ultrasound vocalization，USV）是其情境依賴性情緒信號，具有重要的交流功能。常用的ASD 嚙齒類動物模型包括產(chǎn)前VPA 暴露模型、BTBR 特發(fā)性小鼠模型、MIA 模型以及基于ASD 易感基因構(gòu)建的嚙齒類動物模型等（表3）。

表3 常用的嚙齒類動物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點Table 3 The application, advantages and disadvantages of commonly used rodent models in ASD study

3.1 產(chǎn)前丙戊酸暴露模型

VPA 在臨床上被用作抗癲癇藥或情緒穩(wěn)定劑，可以治療癲癇、雙相情感障礙和神經(jīng)病理性疼痛。Bromley 等［27］報道了孕期VPA 暴露會增加子代患ASD 的風險。此外，研究發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)前VPA 暴露史的兒童神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的患病率增加了6～10 倍，其中ASD 是產(chǎn)前VPA 暴露兒童在6 歲時最常見的神經(jīng)發(fā)育障礙［28］表征。

在動物實驗中，產(chǎn)前暴露于VPA 的大鼠或小鼠是研究ASD 的經(jīng)典動物模型，被廣泛用于探索ASD的潛在治療藥物相關(guān)研究中。例如，母鼠在妊娠11.5～13.5 d 皮下或腹腔注射400～600 mg·kg-1VPA，會普遍導(dǎo)致子代小鼠超聲發(fā)聲頻率降低，持續(xù)時間縮短。在社會交往實驗中，產(chǎn)前暴露VPA仔鼠的社會能力普遍受損，但當VPA 劑量低于350 mg·kg-1時，仔鼠的社會損害表型不明顯。在社會偏好實驗中，產(chǎn)前暴露VPA 子代的社會偏好普遍降低。在重復(fù)行為檢測方面，雌性小鼠在妊娠11.5～13.5 d 腹腔或皮下注射400～600 mg·kg-1VPA 所產(chǎn)生的子代小鼠在曠場實驗和理毛實驗中表現(xiàn)出理毛、挖掘等重復(fù)行為增加的總體趨勢。在埋珠實驗中，母鼠妊娠第10～13 d 暴露于300～600 mg·kg-1VPA 可增加子代小鼠的埋珠數(shù)量。在探索行為方面，大多數(shù)研究顯示產(chǎn)前暴露VPA 子代的探索行為減少。對于產(chǎn)前暴露VPA子代在曠場實驗中活動是否減少也存在爭議。在一些研究中，產(chǎn)前暴露VPA 的后代小鼠表現(xiàn)出高活躍性，而在其他研究中，產(chǎn)前暴露VPA 的后代小鼠表現(xiàn)出活動量減少［29］。此外，VPA 暴露大鼠模型也可用于ASD 候選藥物的篩選。Juybari等［30］研究表明，VPA 暴露（妊娠第12.5 d，腹腔注射600 mg·kg-1）會誘導(dǎo)雄性子代大鼠產(chǎn)生ASD 樣行為，增加痛閾，而白藜蘆醇可以部分改善這些行為缺陷。

在分子機制方面，研究者對VPA 在胚胎發(fā)育早期誘發(fā)ASD 的分子機制進行了初步探究，發(fā)現(xiàn)VPA 暴露通過調(diào)節(jié)一些信號通路，如組蛋白高乙?；?、Wnt 信號通路、ERK-p21 通路和腦內(nèi)γ-氨基丁酸水平，從而影響大腦發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成熟，最終導(dǎo)致后代出現(xiàn)ASD 樣行為表型。VPA 嚙齒類動物模型除了與ASD 患者在行為學(xué)和解剖學(xué)上具有一定的相似性外，還表現(xiàn)出與ASD 患者相似的腸道菌群失調(diào)，這使得VPA 嚙齒類動物模型成為研究ASD的最佳模型之一［31］。

妊娠期注射高劑量VPA（400～600 mg·kg-1）可誘導(dǎo)子代小鼠或大鼠出現(xiàn)社交和認知障礙，重復(fù)性行為增加等ASD 核心癥狀。然而，高劑量VPA可能導(dǎo)致小鼠產(chǎn)前死亡或子代數(shù)量減少。已有研究發(fā)現(xiàn)，低、中劑量VPA 暴露也被用于構(gòu)建ASD的嚙齒動物模型。例如，Wei 等［32］報道在妊娠第17 d單次皮下注射100或200 mg·kg-1VPA 會導(dǎo)致小鼠的新物體識別能力受損和恐懼條件反射行為異常。因此，產(chǎn)前低或中等劑量的VPA 暴露可能與高劑量VPA 暴露誘發(fā)不同的行為改變。此外，鼠齡也會影響VPA 的造模效果，例如，Chaliha等［29］報道，與VPA 暴露的年輕嚙齒動物相比，老年嚙齒動物暴露于VPA 表現(xiàn)出更少的社交和探索行為。因此，建議研究者在進行行為學(xué)測試時應(yīng)確保受試動物處于幼年年齡范圍內(nèi)，并同時使用雄性和雌性動物進行實驗，以反映實驗因素對ASD患者兩性的影響。

3.2 BTBR特發(fā)性小鼠模型

BTBR T+/tpr3tf/J（BTBR）小鼠品系來源于攜帶Discldel、T+、Itpr3tf和Cox7a2ll4種基因突變的近交系小鼠，BTBR 小鼠最初由哥倫比亞大學(xué)的Dunn 將攜帶短尾基因的小鼠與攜帶簇狀基因突變的小鼠雜交，使其連續(xù)近交獲得［33］。BTBR 小鼠的異常行為主要由編碼犬尿氨酸3-單加氧酶的Kmo基因的3 個單核苷酸多態(tài)性引起。BTBR 小鼠能夠很好地模擬臨床ASD 患者的核心癥狀，因此被廣泛用于ASD 的病理機制和篩選候選藥物的相關(guān)研究中。

BTBR 小鼠是目前公認的特發(fā)性ASD 動物模型，其核心癥狀與ASD 患者的臨床癥狀最為相似，并可穩(wěn)定地遺傳給后代。BTBR 小鼠在三箱社交能力實驗中表現(xiàn)出明顯的社交動機和社交能力缺乏等社交功能障礙。在直接社會互動實驗中，BTBR 小鼠嗅探、跟隨等探索性社會行為明顯減少。在USV 測試中，當BTBR 小鼠離開母鼠的籠子時，BTBR 小鼠發(fā)出異常高頻、高振幅的超聲波。研究人員認為這種行為類似于ASD 兒童在被迫與母親分離時的大聲哭泣。相比之下，成年BTBR 小鼠面對陌生小鼠的氣味時，發(fā)出的超聲波數(shù)量減少，這與人類ASD 患者的語言溝通障礙相似。此外，研究還表明，BTBR 小鼠的重復(fù)行為增加，如獨居、挖掘、理毛和埋珠等［34］。

BTBR 小鼠的解剖特征也與ASD 患者存在一定一致性。例如，在BTBR 小鼠中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的器質(zhì)性病變主要集中在皮質(zhì)、胼胝體和海馬發(fā)育不良方面，最顯著的神經(jīng)解剖學(xué)特征是胼胝體100%丟失和海馬關(guān)聯(lián)嚴重減少，這些特征與ASD患者的臨床表現(xiàn)相似［33］。截至目前，研究發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致BTBR 小鼠ASD 相關(guān)行為的分子機制主要包括大腦膠質(zhì)細胞突觸投射異常、興奮/抑制失衡、多種神經(jīng)遞質(zhì)失衡如單胺能遞質(zhì)（5-HT 和多巴胺）失衡和膽堿能遞質(zhì)傳遞系統(tǒng)失衡、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)發(fā)生障礙或異常、細胞內(nèi)信號選擇性中斷等［35］。

3.3 母體免疫激活模型

母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型的研究來源于對ASD 致病因素的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，母親孕期尤其是前3 個月的感染與子代患ASD 的風險密切相關(guān)。在動物實驗中，將妊娠雌性小鼠或大鼠暴露于聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、模擬病毒、細菌等環(huán)境中可以成功構(gòu)建MIA 模型，這些因素通過誘導(dǎo)母體免疫反應(yīng)來激活免疫系統(tǒng)，其中孕期母體暴露于Poly I：C是最常用的MIA模型。

Poly I：C 是一種人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，具有類似于病毒的雙鏈RNA 結(jié)構(gòu)，用于模擬人類病毒感染。在雌鼠妊娠第10.5、12.5、14.5 d 注射5 mg·kg-1Poly I： C 可成功建立MIA 小鼠模型，子代小鼠會出現(xiàn)ASD 的核心癥狀［36］。在USV 測試中，MIA 子代小鼠在面對不同社會刺激時超聲發(fā)聲頻率降低，提示MIA 子代小鼠存在語言交流障礙。在三室社交能力測試中，MIA 子代小鼠的社會偏好顯著降低，提示MIA 子代小鼠存在社會交往障礙。在埋珠和理毛實驗中，MIA 子代小鼠的重復(fù)刻板行為增加。這些結(jié)果表明，Poly I：C 免疫激活模型的子代小鼠表現(xiàn)出與ASD 患者非常相似的行為學(xué)特征，如社會交往障礙、理毛、重復(fù)筑巢和刻板行為等。此外，在妊娠第12.5 d 注射20 mg·kg-1Poly I：C 也可以成功構(gòu)建ASD 小鼠模型，子代小鼠出現(xiàn)胃腸道屏障缺陷、腸道菌群紊亂和血清代謝物變化等現(xiàn)象，口服脆弱擬桿菌可改善MIA 小鼠的腸道通透性和腸道微生物組成，同時可以改善言語溝通、刻板印象、焦慮和感覺運動行為等缺陷［37］。但由于母體的免疫反應(yīng)不同和MIA 子代行為差異，嚙齒動物MIA 模型構(gòu)建中的注射劑量、注射時間和注射次數(shù)均不一致，因此目前尚無統(tǒng)一的Poly I： C誘導(dǎo)MIA模型構(gòu)建方法。

LPS誘導(dǎo)的MIA 模型也是相對常見的ASD 動物模型。Kirsten 等［38］在妊娠第9.5 d 通過向母鼠腹腔注射100 μg·mg-1LPS 構(gòu)建ASD 模型，子代表現(xiàn)出語言交流障礙、學(xué)習(xí)記憶能力下降、重復(fù)刻板行為增加等行為特征，但子代的社交能力未受影響。此外，用LPS 構(gòu)建的ASD 模型大鼠紋狀體中多巴胺、5-HT及其代謝物也有所減少［39］。

3.4 基于ASD易感基因構(gòu)建的嚙齒動物模型

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員通過基因測序技術(shù)篩選了大量ASD 相關(guān)易感基因。與此同時，Cre-lox、歸巢核酸內(nèi)切酶、鋅指核酸內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，使遺傳動物模型近年來廣泛應(yīng)用于ASD 的研究中。通過在嚙齒類動物中突變ASD 相關(guān)易感基因，構(gòu)建了多種ASD遺傳動物模型。目前，用于構(gòu)建ASD 嚙齒動物模型的常見ASD 易感基因（表4）主要包括NLGN基因家族、NRXN基因家族、SHANK基因家族、甲基化CpG 結(jié)合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MECP2）、FMR1、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）、PTEN和泛素蛋白E3連接酶A（ubiquitin-protein ligase E3A，UBE3A）等。

3.4.1NLGN基因家族NLGN家族是一類存在于突觸后膜的細胞黏附分子，由5 個家族成員（NLGN-1、NLGN-2、NLGN-3、NLGN-4X、NLGN-4Y）組成，這些細胞黏附分子是介導(dǎo)突觸發(fā)育和成熟的關(guān)鍵蛋白。此外，它們還可以調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸和谷氨酸能突觸，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮/抑制平衡，大量研究表明NLGN與ASD 等神經(jīng)發(fā)育疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

不同的NLGN基因在神經(jīng)元發(fā)育過程中可能發(fā)揮不同的功能，NLGN-1在突觸形成和突觸可塑性的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，并能影響實驗動物的社交和記憶能力。NLGN-1基因敲除小鼠表現(xiàn)出理毛行為顯著增加，空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷，這與海馬長時程增強受損相似［40］。NLGN-2存在于抑制性突觸中，NLGN-2基因敲除小鼠表現(xiàn)出探索活動減少，超聲發(fā)聲減少且時間短等異常行為，但同時NLGN-2敲除小鼠表現(xiàn)出正常的社會行為，并未檢測到刻板或重復(fù)行為增加的行為學(xué)特征［41］。NLGN-3是一種編碼突觸后蛋白的基因，對突觸的成熟和傳遞具有重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)NLGN-3是誘導(dǎo)或促進ASD 發(fā)生的基因之一，NLGN-3R451C 基因敲入小鼠的社交能力受損，空間學(xué)習(xí)能力增強，這些行為改變伴隨著抑制性突觸傳遞的增加，而興奮性突觸沒有明顯變化［42］。人類遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NLGN-4基因與ASD相關(guān)，腦內(nèi)NLGN-4缺失可能導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，對語言交流過程和認知發(fā)育產(chǎn)生顯著影響。此外，NLGN-4基因敲除小鼠在社會交往和交流方面表現(xiàn)出選擇性缺陷［43］。

3.4.2NRXN基因家族NRXN家族是一類與精神分裂癥和ASD 相關(guān)的突觸前細胞黏附分子。NRXN家族包含NRXN-1、NRXN-2、NRXN-3和NRXN-44 個基因，每個基因都可以通過上游和下游啟動子產(chǎn)生α 和β 蛋白亞型，它們分別在鈣依賴性突觸傳遞、誘導(dǎo)和分化中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NRXN-1和NRXN-2是ASD 易感基因，NRXN-1α和NRXN-2α敲除小鼠均表現(xiàn)出社交障礙和焦慮相關(guān)行為缺陷等ASD 樣行為表型。此外，NRXN-1α基因敲除小鼠在行為測試中也表現(xiàn)出更高的攻擊性［44］。盡管關(guān)于NRXN-3基因敲除小鼠與ASD 癥狀的關(guān)聯(lián)研究非常有限，但在亞臨床ASD 患者的父親體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了NRXN-3基因缺失［45］。NRXN-4又稱CNTNAP2，是首批被證實參與ASD 發(fā)生和發(fā)展的基因之一。CNTNAP2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高表達，可直接與語言發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P2（forkhead box P2，F(xiàn)oxp2）結(jié)合。多項研究表明，敲除CNTNAP2基因的大鼠和小鼠表現(xiàn)出ASD 樣行為缺陷，如重復(fù)行為增加、社會行為障礙和異常感覺行為，利培酮治療可以逆轉(zhuǎn)CNTNAP2敲除小鼠的重復(fù)行為，這一結(jié)果提示CNTNAP2敲除小鼠有望成為ASD 藥理學(xué)研究的模型［46］。

3.4.3SHANK基因家族SHANK家族是一類突觸后支架蛋白，可與離子型或代謝型谷氨酸受體相互作用，也可通過錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白細胞骨架、鈣蛋白酶介導(dǎo)的鈣信號通路以及多種重要的突觸后蛋白相互作用。SHANK家族由SHANK1、SHANK2和SHANK33 個基因組成，其中SHANK3是SHANK家族中與ASD相關(guān)性最緊密的基因。SHANK3在大腦皮層、海馬和小腦的顆粒細胞中高表達，是促進樹突棘和功能性突觸形成和成熟的必需基因。目前已經(jīng)構(gòu)建了多種靶向SHANK3突變的動物模型。SHANK3基因敲除小鼠表現(xiàn)出ASD 樣行為，如重復(fù)行為增加、學(xué)習(xí)記憶能力受損、社會交往障礙。靶向SHANK3的ANK 結(jié)構(gòu)域基因序列可以消除SHANK3最長亞型SHANK3α，這類基因敲除小鼠表現(xiàn)出更喜歡在籠子里活動、探索新事物的興趣降低、空間記憶能力和可塑性受損等ASD 樣行為特征，但并未出現(xiàn)重復(fù)行為和焦慮樣行為的增加［47］。靶向SHANK3的PDZ 域基因序列可以消除SHANK3α、SHANK3β和部分SHANK3γ，這些PDZ 敲除小鼠表現(xiàn)出重復(fù)行為增加、社會交往障礙和過度焦慮等行為表型［48］。

3.4.4MECP2基因MECP2作為轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達調(diào)控中起著重要作用。MECP2是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵基因。例如，MECP2基因的突變或增殖可導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)發(fā)育障礙，MECP2蛋白的增加或減少可導(dǎo)致ASD 樣表型。將人類MECP2基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，小鼠表現(xiàn)出類似ASD 的表型，如社交行為缺陷［49］。Lu 等［50］報道MECP2轉(zhuǎn)錄起點特異性甲基化可降低小鼠MECP2的表達，這類小鼠表現(xiàn)出一系列行為變化，如社交行為減少，重復(fù)行為增加，焦慮/抑郁增加，學(xué)習(xí)和記憶能力下降。海馬中MECP2啟動子甲基化的特異性增加足以誘導(dǎo)大多數(shù)行為變化。目前，通過刪除3 號外顯子以及MECP2基因308X 點突變建立的小鼠模型是比較經(jīng)典的MECP2突變小鼠模型。

3.4.5FMR1基因 脆性X 染色體綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是由X 染色體上的FMR1基因突變引起的，是最常見的遺傳形式上的智力障礙疾病。FMR1基因突變可導(dǎo)致類似ASD 的癥狀，以及其他精神發(fā)育障礙，如多動癥和癲癇。同時，F(xiàn)XS 也是ASD 最常見的單基因疾病，可以很好地代表ASD 的遺傳基礎(chǔ)和臨床表現(xiàn)。目前，絕大多數(shù)FXS 相關(guān)研究使用的動物模型為FMR1敲除小鼠，其行為表型與FXS 患者在重復(fù)行為增加、超興奮、焦慮、易怒、社交障礙、空間學(xué)習(xí)能力障礙、海馬突觸發(fā)育障礙等多方面是一致的，這些特征主要是由腦回路的興奮和抑制不平衡引起的。通過酵母人工染色體將人FMR1基因轉(zhuǎn)移到FMR1敲除小鼠中，可以逆轉(zhuǎn)FMR1敲除小鼠的行為異常，表現(xiàn)為焦慮行為減少和探索行為增加［51］。然而，也有研究表明，F(xiàn)MR1突變小鼠模型不能完全表達FXS 的一些臨床表型，例如，F(xiàn)MR1敲除小鼠在Morris水迷宮測試和八臂迷宮測試中表現(xiàn)出正常的記憶能力和學(xué)習(xí)認知能力，未表現(xiàn)出全面認知障礙［52］。

3.4.6TCS1/2基因 結(jié)節(jié)性硬化癥是一種與ASD相關(guān)的罕見疾病，主要涉及基因為TSC1/2。小腦浦肯野細胞中TSC1的缺失可導(dǎo)致小鼠的社交障礙、認知障礙、發(fā)聲異常和重復(fù)行為增加等ASD 樣行為。浦肯野細胞中TSC2基因的敲除也會導(dǎo)致小鼠社交障礙和重復(fù)行為的增加［53］。此外，Normand等［54］報道了妊娠第12.5天小鼠丘腦中TSC1的缺失會導(dǎo)致成年小鼠出現(xiàn)諸如強迫性梳理和癲癇發(fā)作等ASD樣行為特征，而mTOR抑制劑處理可以改善TSC模型中的突觸可塑性和相關(guān)行為障礙。

3.4.7PTEN基因PTEN是一種編碼磷酸酶和緊張素同源物的基因，已在高達20%的ASD 和頭大畸形兒童中鑒定出PTEN突變。如今，PTENcKO 小鼠模型已經(jīng)成為了解PTEN在發(fā)育過程中的作用，以及PTEN對包括ASD 在內(nèi)的人類神經(jīng)發(fā)育障礙疾病影響的有價值工具。例如，Cupolillo 等［55］證明小腦浦肯野細胞中PTEN的缺失會導(dǎo)致ASD 樣行為特征，包括社交能力受損、重復(fù)行為和運動學(xué)習(xí)障礙。

3.4.8UBE3A基因UBE3A基因編碼1個100 kD的蛋白質(zhì)，其功能是泛素連接酶和轉(zhuǎn)錄輔激活劑。目前，有研究表明UBE3A在突觸功能和調(diào)節(jié)突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用。Xu 等［57］發(fā)現(xiàn)UBE3A過表達小鼠表現(xiàn)出類似ASD 的癥狀，如重復(fù)行為增加和社交缺陷，而維A 酸補充劑可以顯著緩解小鼠的ASD樣表型。

3.4.9其他ASD 易感基因 目前，越來越多的ASD 相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，基于這些熱點基因構(gòu)建的ASD嚙齒類動物模型包括多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白T356M突變小鼠、EPHB6基因缺失小鼠、Foxp2基因敲除小鼠和KCTD13基因缺失小鼠。此外，近年來出現(xiàn)了新的ASD 風險基因，包括電壓門控性鈉通道二型α亞單位、Ras GTP酶激活蛋白1、ARID1B、谷氨酸離子型受體NMDA2B、DSCAM和T-brain-1，通過突變這些特定的ASD 風險基因，也可以構(gòu)建潛在的ASD嚙齒類動物模型［33］。

3.5 ASD的其他嚙齒類動物模型

除了上述3類常用的ASD 嚙齒動物模型和基于ASD 易感基因構(gòu)建的各種嚙齒動物模型外，研究人員還基于各種疑似致病因素開發(fā)了其他ASD嚙齒動物模型，包括丙酸暴露模型、內(nèi)側(cè)前額葉皮層破壞模型、母體自身抗體模型等。

3.5.1丙酸暴露模型 通過向成年大鼠大腦注射丙酸，可以成功構(gòu)建ASD 大鼠模型，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙、重復(fù)刻板樣行為、感覺運動異常等ASD樣行為。丙酸暴露大鼠模型大腦中的小膠質(zhì)細胞被激活，引起神經(jīng)炎癥，氧化應(yīng)激標志物水平增加，谷胱甘肽水平降低［58］。這些研究為丙酸誘導(dǎo)的ASD 嚙齒動物模型的研究提供了基礎(chǔ)，但丙酸暴露與人ASD的相關(guān)性有待進一步研究。

3.5.2內(nèi)側(cè)前額葉皮層破壞模型 來源于ASD患者的尸檢結(jié)果顯示，內(nèi)側(cè)前額葉皮層異常生長。大鼠出生后前額葉皮層的破壞會導(dǎo)致發(fā)育后期社交行為減少等類似ASD 的行為障礙，但成年大鼠沒有表現(xiàn)出這種行為異常，目前利用該方法構(gòu)建ASD模型還存在許多技術(shù)難點和不確定性［59］。

3.5.3母體自身抗體模型 研究發(fā)現(xiàn)，部分ASD患者母親的血清中存在一種特異性抗體，如免疫球蛋白E13-E18、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）等，可影響胎兒大腦發(fā)育，導(dǎo)致后代出現(xiàn)ASD 樣癥狀。動物實驗研究表明，母鼠在孕期暴露于IgG 可增加后代幼鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞增殖，增加成年雄性小鼠神經(jīng)元大小及后代腦容量，同時在行為實驗中會導(dǎo)致后代小鼠的感覺發(fā)育受損、焦慮行為增加和其他類似ASD的行為表現(xiàn)［60］。

綜上，嚙齒類動物的基因操作工具豐富，單基因嚙齒類動物模型可以用來解釋特定基因的功能，但并不能代表大多數(shù)人類的ASD 疾病。表3和表4總結(jié)了常用的嚙齒類動物模型在ASD 研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點。

4 非人靈長類動物模型

雖然嚙齒動物已被廣泛用于ASD 的相關(guān)研究中，但嚙齒動物與人在大腦解剖、分子途徑、社會行為等方面存在一定的差異，而非人類靈長類動物在社會行為、解剖特征、藥物動力學(xué)等方面與人類非常相似。眼睛注視異常和視覺接觸減少是ASD患者的共同特征。非人類靈長類動物可以像人類一樣通過眼睛處理社會刺激，有能力從照片或視頻中識別個人，且眼睛注視的焦點可以定量分析，而嚙齒動物主要依靠嗅覺來處理信息。因此，非人靈長類動物模型使得獲得類似人類血液和組織樣本以及組織活檢成為可能。這些社會行為和認知功能方面的差異可能限制了在ASD 嚙齒類動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)對人類ASD 患者的適用性，而非人靈長類模型可以提供比嚙齒動物模型更有價值的信息。綜合來看，在ASD 相關(guān)研究中，非人靈長類動物被認為是比嚙齒動物更好的動物模型。然而，維持非人靈長類動物模型需要特殊的設(shè)備，成本很高，而且該模型生命周期較長，導(dǎo)致實驗周期較長。此外，進行此類動物實驗之前，倫理制度非常嚴格。

目前，一些研究人員已在非人靈長類動物中開展了ASD 相關(guān)研究。例如，在非人靈長類動物中對ASD 相關(guān)基因SHANK3和MECP2進行了突變，以構(gòu)建ASD 的非人靈長類動物模型。Zhou等［61］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在食蟹猴及其后代構(gòu)建SHANK3突變食蟹猴，表現(xiàn)出重復(fù)行為增加、社交缺陷以及學(xué)習(xí)缺陷等ASD 樣行為。隨后，Zhang 等［62］利用獨特的靈長類眼球追蹤檢測技術(shù)結(jié)合磁共振成像分析對MECP2突變食蟹猴的相關(guān)表型進行了探索，觀察到MECP2突變食蟹猴的生理、行為和結(jié)構(gòu)異常與ASD 患者相似。這些研究證明了利用基因工程方法構(gòu)建非人靈長類動物模型研究腦部疾病的可行性和可靠性，同時非人靈長類動物模型對于ASD 相關(guān)神經(jīng)機制的研究和潛在的治療干預(yù)具有重要價值。

此外，非人靈長類動物孕期暴露于ASD 易感環(huán)境因素也可誘導(dǎo)子代發(fā)生ASD 樣行為。例如，Yasue 等［63］證明VPA 暴露會導(dǎo)致狨猴缺乏社交動機和社交興趣下降。懷孕期間注射Poly I：C 的恒河猴后代表現(xiàn)出ASD 樣核心癥狀，如異常的刻板行為、重復(fù)行為增加和社會交往受損［64］。此外，臨床研究證實，高頻輻射可能導(dǎo)致ASD 發(fā)病率增加，當恒河猴在懷孕前3 個月暴露于過量的X 射線下時，成年猴也會表現(xiàn)出更多的刻板行為和認知行為障礙［65］。恒河猴在孕期暴露于與ASD 相關(guān)的特異性母體抗體，其后代表現(xiàn)出一定的社交障礙和腦容量增加，這與母親攜帶自身抗體的ASD兒童的臨床癥狀非常相似［66］。

綜上所述，食蟹猴和恒河猴等非人靈長類動物與人類的同源性最高，生活在復(fù)雜的社會群體中。他們可以通過面部表情、肢體語言和聲音來進行社會交流，在情感和社會方面與人類最為相似。非人靈長類ASD動物模型模擬了與ASD患者相似的行為缺陷，并且具有與人類相似的社會行為相關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)。此外，利用眼動跟蹤技術(shù)可以評估非人靈長類動物的社會注意力缺陷。綜上所述，這些非人靈長類ASD動物模型（表5）更接近于ASD 患者的表型和神經(jīng)特征，為嚙齒類動物ASD模型向人類ASD疾病過渡提供了橋梁。

表5 非人靈長類動物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點Table 5 The application, advantages and disadvantages of non-human primate models in ASD study

5 展望

本文系統(tǒng)總結(jié)了ASD 的細胞模型和動物模型及其構(gòu)建方法，以期為深入了解ASD 的發(fā)病機制、診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。在ASD研究中建立細胞模型和動物模型的必要性和優(yōu)勢在于：①在臨床研究中，腦組織和神經(jīng)細胞樣本難以獲得，但在這些ASD 模型中是可以獲得的；②豐富且可重復(fù)的樣本使得研究者可以通過控制變量來研究環(huán)境和遺傳因素在ASD 神經(jīng)病理中的作用；③通過基因工程技術(shù)篩選新的易感基因，探索相關(guān)易感基因的功能；④研究者可以利用大量的動物模型來觀察相關(guān)因素和候選藥物對ASD 核心行為的影響；⑤這些模型還可以用于研究和篩選ASD預(yù)防和干預(yù)措施。

目前，國內(nèi)外實驗室已經(jīng)成功構(gòu)建了多種細胞模型和動物模型，用于探究ASD 的發(fā)病機制，開發(fā)ASD 診斷措施以及防治手段等相關(guān)領(lǐng)域。例如，ASD 的多種動物模型為探究ASD 病理學(xué)與膽固醇代謝障礙之間存在重要關(guān)系提供了關(guān)鍵線索［67］。細胞因子IL-17 在不同ASD 模型中普遍增加，這些研究有助于闡明T 細胞活化和IL-17分泌在ASD 發(fā)病機制中的作用［68］。聽覺功能障礙是ASD 最常見的感知異常，而其潛在的神經(jīng)生物學(xué)機制尚不明確。在ASD 模型中多項研究表明，聽覺功能障礙可能是由中樞處理受損引起的，與E/I平衡失調(diào)以及GABA 能信號的改變有關(guān)，為治療ASD 患者的聽覺功能障礙提供了潛在的治療靶點［69］。此外，隨著基因編輯技術(shù)的逐步發(fā)展，基于易感基因構(gòu)建的ASD 細胞模型和動物模型已成為探索ASD 致病機制和開發(fā)ASD 基因療法的重要工具。

在ASD 細胞模型方面，PC12 細胞、SH-SY5Y細胞、hiPSCs、LCLs 和原代神經(jīng)元在應(yīng)用于ASD相關(guān)研究時各有優(yōu)缺點。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者可以利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立在形態(tài)和功能上更接近人類細胞的靈長類ASD 細胞模型，這將推動ASD 發(fā)病機制的研究進展。ASD患者細胞標本獲取困難，靈長類ASD 細胞模型的成功建立對闡明ASD 的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)特異性標志物和藥物靶點、篩選候選藥物以及評估新藥療效具有重要意義。

能夠高度還原ASD 臨床特征和發(fā)病機制的動物模型是研究ASD 的理想工具。目前越來越多的動物模型被成功構(gòu)建，ASD 動物模型的多樣化也導(dǎo)致了研究結(jié)果和表型的差異。結(jié)合國內(nèi)外動物模型評價標準，3 種驗證方法被廣泛用于評價動物模型與人類疾病的相似性。①構(gòu)建效度方面，要求動物模型的構(gòu)建方法和病理生理變化與疾病的假設(shè)或理論相一致。目前符合構(gòu)建效度的ASD 動物模型包括SHANK3、FMR1、CNTNAP2、MECP2等基于單基因突變的ASD 動物模型，以及VPA、MIA 等基于環(huán)境因素的ASD 動物模型。②表面效度方面，要求動物模型在許多方面能夠模擬疾病的典型特征。本文中提到的ASD 動物模型幾乎都不同程度地滿足了這一要求。BTBR小鼠模型和VPA 小鼠模型能較好地模擬ASD 患者的臨床表型，因此在這些動物模型中具有最好的表觀特征。③預(yù)測效度方面，要求動物模型的藥理學(xué)和非藥理學(xué)反應(yīng)與臨床治療表現(xiàn)一致，能夠為疾病的長期治療和發(fā)病機制研究提供預(yù)測。然而，由于目前還沒有批準用于治療ASD 患者核心癥狀的藥物上市，因此并不能很好地評估現(xiàn)有模型的預(yù)測效度。

除了上述提到的模式生物，還有一些其他的模式生物如狗和牛，正在被嘗試應(yīng)用于ASD 研究中。作為相對高級的哺乳動物，狗和牛與人類在核心臨床表型、大腦結(jié)構(gòu)、生理、營養(yǎng)代謝、致病因素等方面的相似性高于嚙齒類動物，但是這類動物的體積較大、實驗操作難度較大、維護費用昂貴。Tsilioni 等［70］報道了血清神經(jīng)降壓素和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素在ASD 患者和具有ASD表型的斗牛犬中均顯著升高，這種犬種可能有助于ASD的診斷、發(fā)病機制和治療的研究。

考慮到ASD 的上述特點和高度異質(zhì)性，究竟哪種細胞模型和動物模型是研究ASD 發(fā)病機制的最佳模型，目前尚未達成共識。研究者可嘗試從多個獨立的模型中尋找一致的ASD 致病因素，以探索ASD的致病機制、診斷方式和治療方法。