CRISPR/Cas系統(tǒng)在斑馬魚中的研究進(jìn)展

王阿利 ， 劉江東

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072

與哺乳動(dòng)物不同，斑馬魚通過(guò)體外受精繁殖，可以方便地對(duì)其胚胎發(fā)育的各個(gè)階段進(jìn)行研究觀察。斑馬魚的光學(xué)透明特性，使其易于結(jié)合熒光報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)育相關(guān)研究［1］。此外，斑馬魚的快速繁殖能力和胚胎便于基因操作特性，使其與基因組DNA 編輯技術(shù)的結(jié)合成為必然［2］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)相較于其他編輯系統(tǒng)，在斑馬魚中表現(xiàn)出更高的基因編輯效率和相對(duì)較低的細(xì)胞毒性［3］，還具有可靶向編輯甲基化序列［4］以及進(jìn)行多重基因編輯的優(yōu)勢(shì)［5］。因此，近年來(lái)CRISPR/Cas系統(tǒng)在斑馬魚基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，并取得了一系列新突破。本文根據(jù)已有的相關(guān)報(bào)道，總結(jié)了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在斑馬魚基因敲除或敲入、活細(xì)胞成像、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多重靶向、疾病模型建立中的研究進(jìn)展，以期從CRISPR/Cas 系統(tǒng)在斑馬魚中應(yīng)用的角度為人類疾病機(jī)制的探索提供新的思路。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本作用原理

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一個(gè)在古細(xì)菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切酶工具，作用是抵抗入侵的外源遺傳物質(zhì)，例如噬菌體病毒、外源質(zhì)粒等。同時(shí)，類似于哺乳動(dòng)物的二次免疫，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以為細(xì)菌提供獲得性免疫，當(dāng)病毒或者外源質(zhì)粒入侵細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌會(huì)形成相應(yīng)的“記憶”，從而保護(hù)細(xì)菌免受外源遺傳物質(zhì)的二次入侵［2，6］。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識(shí)別并切斷外源DNA 或RNA，使外源遺傳物質(zhì)的表達(dá)沉默，此原理與真核生物中RNA 干擾（RNA interference，RNAi）非常相似。正是因?yàn)榫哂芯珳?zhǔn)靶向功能，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被開發(fā)為一種高效的基因編輯工具并被廣泛應(yīng)用于工程動(dòng)物基因組［6-7］。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的種類

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為2類，分別為Class1和Class2，Class1系統(tǒng)中包含4～7種Cas蛋白，共同作用干擾靶基因表達(dá)，目前在斑馬魚基因編輯中應(yīng)用較少；Class2 系統(tǒng)中只有1 種Cas 蛋白，可單獨(dú)行使多種功能，這類Cas 蛋白通常具有多個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)域，例如Cas9、Cas12 等。而根據(jù)其剪切元件序列和功能特征，以及輔助元件的組成，Class1分為TypeⅠ、Ⅲ、Ⅳ 3 種類型，Class2 分為TypeⅡ、Ⅴ、Ⅵ 3 種類型［8］。用于斑馬魚基因編輯的主要是Class2系統(tǒng)，TypeⅡ、Ⅴ、Ⅵ中的Cas蛋白分別為Cas9、Cas12、Cas13（表1）。其中Cas9 和Cas12 具有基因編輯功能，由crRNA 和tracrRNA 人工組合成單一指導(dǎo)RNA（single guidence RNA，sgRNA），引導(dǎo)Cas9和Cas12定點(diǎn)切割目標(biāo)序列。二者具有通過(guò)改變sgRNA 序列即可任意改變切割位點(diǎn)的可控性以及便利性，因此廣泛應(yīng)用于斑馬魚基因組編輯。

表1 CRISPR/Cas Class2系統(tǒng)的種類及其特征Table 1 Types and characteristics of CRISPR/Cas Class 2 systems

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在斑馬魚中的技術(shù)革新

雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯中廣泛應(yīng)用，但是由于細(xì)胞內(nèi)修復(fù)結(jié)果的不確定性，研究者對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的編輯精度有更高的追求。在提高CRISPR/Cas 系統(tǒng)編輯精度上的研究有以下幾方面進(jìn)展。

1.3.1改造Cas 蛋白 Cas 蛋白是CRISPR/Cas 系統(tǒng)的核心組件。在斑馬魚中，通過(guò)改變核苷酸堿基從而遵循斑馬魚密碼子規(guī)律，并調(diào)節(jié)GC 含量和二級(jí)mRNA 結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了斑馬魚密碼子優(yōu)化的Cas9（zCas9）cDNA。再經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，利用顯微注射到斑馬魚胚胎中，能夠特異性地提高zCas9對(duì)斑馬魚基因編輯的效率［17］。

1.3.2拓展PAM 序列多樣性 Cas9 能夠識(shí)別的序列范圍受到特定PAM的限制［18-21］。SpCas9是迄今為止使用最廣泛的Cas9，主要識(shí)別NGG PAMs。由于僅限于包含該基序的位點(diǎn)可以被CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯，SpCas9 很難精確靶向各種基因組序列并引發(fā)基因編輯所必需的雙鏈斷裂（double strain breaks，DSBs）［22］。拓展PAM 序列的多樣性成為擴(kuò)大CRISPR/Cas9 應(yīng)用范圍的研究重點(diǎn)。如今在NGG PAMs 之外，還發(fā)現(xiàn)了多種能夠靶向其他PAM 序列的Cas9。例如，被修飾過(guò)的化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）可以在斑馬魚細(xì)胞中特異地區(qū)分非典型NAG 和NGA PAMs［23］；SaCas9 和其KKH SaCas9 變體，可以高效率靶向編輯斑馬魚基因組中PAM 為5′-NNNRRT-3′的DNA 序列［24］；ScCas9作為一種新發(fā)現(xiàn)的Cas 蛋白，可以靶向基因組序列中更多的NNG PAMs［25］。PAM 的多樣性擴(kuò)大了可用靶位點(diǎn)的選擇范圍，增加了Cas9 的適用性，進(jìn)一步激發(fā)了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在斑馬魚基因組編輯中的潛力。

1.3.3優(yōu)化系統(tǒng)存在形式 引導(dǎo)RNA 和靶位點(diǎn)的互補(bǔ)配對(duì)，使得Cas9 或Cas12 能夠在指定位點(diǎn)進(jìn)行雙鏈切割，引導(dǎo)RNA 的不穩(wěn)定靶向，大大降低了CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cas12 的基因編輯效率。研究表明，sgRNA 5′端多余的鳥嘌呤核苷酸會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎內(nèi)CRISPR/Cas9 編輯能力降低［26］。在Cpf1（更名為Cas12a）蛋白缺失的情況下，crRNA（Cpf1 的向?qū)NA）在體內(nèi)不穩(wěn)定并發(fā)生降解［14］。以上2 種情況都可以通過(guò)將CRISPR/Cas 系統(tǒng)組裝成核糖核蛋白復(fù)合物以提高其對(duì)基因組編輯的穩(wěn)定性和有效性［26-27］。

1.3.4改變載體組分 不同的CRISPR/Cas 系統(tǒng)載體構(gòu)成具有不同的編輯效果。在質(zhì)粒載體的CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，以組織特異性的啟動(dòng)子啟動(dòng)系統(tǒng)表達(dá)，就可以獲得針對(duì)特定組織結(jié)構(gòu)的基因編輯工具，進(jìn)而對(duì)不同的組織進(jìn)行特異性基因編輯操作［28］。

1.3.5選擇合適的溫度 環(huán)境也會(huì)影響CRISPR/Cas 系統(tǒng)在斑馬魚中的使用效果。有研究表明，降低溫度有利于延緩斑馬魚胚胎早期發(fā)育，提高CRISPR/Cas9的編輯效率［29］。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在斑馬魚基因編輯中的應(yīng)用

2.1 利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因敲除或敲入

Cas9 和Cas12 蛋白都可以用作基因敲除或敲入，通過(guò)引入雙鏈斷裂、非同源端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)或同源定向修復(fù)（homologous directed repair，HDR）均可以誘導(dǎo)目的基因的插入或缺失（indels）［30］。但由于供體和斷點(diǎn)之間的連接是不可預(yù)測(cè)的，修復(fù)后突變的結(jié)果通常并不理想，特別是HDR 介導(dǎo)的基因組編輯敲入方法在斑馬魚中效率更低［31］。因此，研究者提出了很多辦法來(lái)提高插入/缺失效率。

針對(duì)HDR 導(dǎo)致的突變效率低的問(wèn)題，在斑馬魚胚胎中引入斑馬魚長(zhǎng)單鏈DNA 模板（zebrafish long single-stranded DNA template，zLOST），利用HDR 和長(zhǎng)單鏈DNA（long single stranded DNA，lssDNA）作為修復(fù)模板可以在斑馬魚中產(chǎn)生更有效、更精確的突變［32］。最近出現(xiàn)的先導(dǎo)編輯（prime editing，PE）系統(tǒng)也是提高修復(fù)后插入成功率的有效途徑。PE 系統(tǒng)包含1 個(gè)pegRNA 和1 個(gè)PE2 蛋白，PE2 蛋白由1 個(gè)nCas9 和1 個(gè)改造的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）融合組成。與常規(guī)sgRNA 不同的是，pegRNA 不僅具有靶向作用，自身還帶有“逆轉(zhuǎn)錄模板”，PE2 蛋白會(huì)在pegRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到目標(biāo)序列上，然后啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄酶功能，以pegRNA 上的一段序列為逆轉(zhuǎn)錄模板，合成一段DNA 序列，隨后細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制就會(huì)將新合成的序列整合到基因組中［33］。體外純化的PE 核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物被證實(shí)可以高效地誘導(dǎo)斑馬魚體細(xì)胞突變并進(jìn)行種系傳遞［9］。

除了進(jìn)行系統(tǒng)構(gòu)成改良之外，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也能提高基因插入/缺失效率。例如，在基因組中插入熒光蛋白標(biāo)記時(shí)，利用RNA 剪接過(guò)程中非編碼序列會(huì)從轉(zhuǎn)錄本中移除的特性，在非編碼區(qū)域（如內(nèi)含子和5′非翻譯區(qū)）整合熒光蛋白，這樣即使出現(xiàn)不精確的整合事件也不會(huì)影響標(biāo)記蛋白的表達(dá)，從而提高了熒光蛋白精確插入的成功率［34］。除此之外，利用斑馬魚胚胎基因分型（zebrafish embryo genotyping，ZEG）裝置，在受精后72 h 的胚胎中提取少量的基因組DNA，選出敲入率最高的斑馬魚胚胎，再和下一代測(cè)序相結(jié)合，可以使CRISPR/Cas系統(tǒng)獲得17倍的體細(xì)胞編輯能力，大大提高了斑馬魚CRISPR編輯的選擇能力［35］。

2.2 dCas9 作用于斑馬魚活細(xì)胞成像與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

CRISPR/dCas9 活細(xì)胞成像技術(shù)的基本原理是將dCas9 與熒光基團(tuán)偶聯(lián)，在細(xì)胞核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）的引導(dǎo)下穿過(guò)細(xì)胞器膜，通過(guò)sgRNA 的靶向作用特異性地標(biāo)記染色體基因序列。一般情況下，dCas9 在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，為了提高信噪比及靶位點(diǎn)的數(shù)量，sgRNA一般靶向重復(fù)序列［36］。利用CRISPR/dCas9活細(xì)胞成像技術(shù)，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因?qū)崿F(xiàn)精確定位，并利用熒光基團(tuán)使其可視化。例如，屬于調(diào)節(jié)母體mRNA清除的microRNA家族中的miR-430，是一個(gè)有54 個(gè)拷貝的重復(fù)基因，將dCas9-3xGFP與定位在內(nèi)源性miR-430 上的gRNAs 共注射入單細(xì)胞中，可以尋找到miR-430 位點(diǎn)在胚胎中最早的轉(zhuǎn)錄時(shí)間點(diǎn)［10］。

基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸可以被啟動(dòng)子和外顯子中的sgRNA 復(fù)合物干擾，如dCas9（dead Cas9，Cas9 的無(wú)外切酶活性形式）。如果克虜伯相關(guān)盒（krüppel associated box，KRAB）結(jié)構(gòu)域與dCas9 融合，則會(huì)抑制靶基因的表達(dá)。同樣，轉(zhuǎn)錄激活因子如VP16 的融合則可以增加靶基因的表達(dá)［37］。將體外合成dCas9-KRAB 的mRNA 和靶特異性sgRNAs注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，則發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)基因的表達(dá)水平降低［11］。

2.3 利用CRISPR/Cas系統(tǒng)靶向斑馬魚RNA

自發(fā)現(xiàn)C2c2（現(xiàn)被稱為Cas13a）是一種單組分可編程RNA 引導(dǎo)的靶向RNA CRISPR 效應(yīng)器之后［38］，研究人員開始運(yùn)用CRISPR/Cas13a 進(jìn)行RNA 示蹤的研究。2023 年1 月，陳玲玲團(tuán)隊(duì)在斑馬魚合子中注射純化的CRISPR/dCas13 熒光蛋白和修飾后的引導(dǎo)RNA，在沒(méi)有其他基因工程操作的前提下，從合子基因組激活（zygotic genome activation，ZGA）到早期分節(jié)期（early segmentation period），對(duì)表達(dá)的mRNA進(jìn)行單色和雙色跟蹤，揭示了轉(zhuǎn)錄和mRNP 運(yùn)動(dòng)的特征，為多細(xì)胞生物內(nèi)源性RNA的可視化提供了強(qiáng)大工具［15］。

CRISPR/Cas13 系統(tǒng)已被用于沉默酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的RNA，比起RNAi，該系統(tǒng)有更廣泛的適用性和更高的沉默效率［39-41］。研究證實(shí)，CRISPR-RfxCas13d（CasRx）是一個(gè)有效且精確的RNA 沉默系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有效靶向斑馬魚合子表達(dá)和母體提供的轉(zhuǎn)錄本，使轉(zhuǎn)錄本水平平均下降76%［16］。

2.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)多重靶向斑馬魚基因組

有些性狀是由多個(gè)基因共同控制的，單位點(diǎn)編輯可能無(wú)法改變性狀。而單基因控制的性狀由于受RNA剪接、RNA無(wú)意義的衰減、mRNA失調(diào)等因素影響［42-45］，編輯效果并不理想。CRISPR/Cas系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是可操作性靈活，它可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行高效編輯。

利用Cas 蛋白和sgRNA 的多樣性，可實(shí)現(xiàn)斑馬魚的多重靶向基因編輯。研究表明，化膿性鏈球菌、金黃色鏈球菌、毛螺科細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)在斑馬魚體內(nèi)能夠同時(shí)運(yùn)行，且編輯效果可疊加［46］。另外，同時(shí)遞送一種Cas 蛋白和多條sgRNA 到斑馬魚胚胎中，也可以達(dá)到多位點(diǎn)共同編輯的目的［47］。在此基礎(chǔ)上，使用來(lái)自斑馬魚的內(nèi)源性tRNA 基因，可以構(gòu)建tRNA-多重sgRNA 載體。利用tRNA的轉(zhuǎn)錄本內(nèi)源性加工，單個(gè)載體的轉(zhuǎn)錄本即可在斑馬魚胚胎中加工出多個(gè)sgRNA，既能為多重sgRNA 的內(nèi)源性加工工具提供更多選擇，又能降低多重靶向系統(tǒng)對(duì)斑馬魚的毒性［48］。除此之外，向斑馬魚胚胎同時(shí)注射4 種靶向單個(gè)基因的CRISPR/Cas9 核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9 RNP），也能夠顯著提高對(duì)功能基因的破壞效率［49］。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)的多重靶向功能增加了靶位點(diǎn)數(shù)量，不僅可以同時(shí)完成多基因編輯，還可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段和多片段的突變，對(duì)研究相關(guān)的基因或者同一通路的基因功能有重要意義。

2.5 CRISPR/Cas 系統(tǒng)應(yīng)用于建立斑馬魚疾病模型

斑馬魚與人類具有很高的遺傳相似性，是人類疾病基因研究的理想模型。特別是其胚胎透明等特點(diǎn)，使得斑馬魚在建立疾病模型上具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，在探索器官發(fā)育、神經(jīng)調(diào)控、譜系追蹤等方面作出了較大貢獻(xiàn)［50-51］。

除了胚胎透明特性外，斑馬魚還能夠在心血管系統(tǒng)失去功能的情況下通過(guò)氧擴(kuò)散生存，允許在發(fā)育后期研究致命的心臟缺陷，以此闡明心臟疾病相關(guān)機(jī)制。在斑馬魚的心臟發(fā)育研究中，通過(guò)CRISPR 敲除斑馬魚的WAVE2 復(fù)合物蛋白基因brk1、nckap1 和wasf2 以及小GTPase 信號(hào)中的cul3a 和racgap1 調(diào)控因子，建立了斑馬魚先天性心臟病模型，發(fā)現(xiàn)WAVE2 復(fù)合物蛋白的缺失會(huì)引發(fā)冠心病等先天性心臟病，證明其對(duì)心臟正常發(fā)育具有重要作用［52］。另一項(xiàng)研究表明，斑馬魚缺乏與人類左心發(fā)育不全綜合征（hypoplastic left heart syndrome，HLHS）相關(guān)的RNA 結(jié)合蛋白R(shí)BFOX2，會(huì)顯示出與HLHS患者一致的心血管缺陷重疊，且繼發(fā)于泵功能受損，該研究利用斑馬魚進(jìn)一步闡明了人類HLHS的發(fā)病機(jī)制［53］。

迄今為止，人類神經(jīng)疾病方面的研究進(jìn)展緩慢，斑馬魚因其遺傳可馴化性、強(qiáng)大的行為特征和易于高通量藥物篩選而成為研究神經(jīng)疾病有價(jià)值的模型。在斑馬魚中利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)疾病相關(guān)基因的敲除或敲低，可以揭示一系列神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制。例如，在斑馬魚中使用CRISPR/Cas9 來(lái)靶向CHD7 內(nèi)多個(gè)位置，構(gòu)建了CHARGE 綜合征相關(guān)的聽覺(jué)和視覺(jué)行為缺陷模型，發(fā)現(xiàn)CHD7 基因內(nèi)突變位置的改變會(huì)影響CHARGE 綜合征相關(guān)表型的外顯率［54］。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，構(gòu)建編碼PRC1 復(fù)合物酶成分Ring1b 的rnf2 基因突變體系，發(fā)現(xiàn)其編碼成年大腦中參與突觸結(jié)構(gòu)和功能的基因下調(diào)，神經(jīng)嵴和神經(jīng)前體細(xì)胞異常遷移和分化，說(shuō)明大腦連接不足可能是setd5 突變斑馬魚模型社會(huì)障礙的原因，這為人類自閉癥的研究奠定了基礎(chǔ)［55］。另外，通過(guò)斑馬魚模型的篩選等方法，發(fā)現(xiàn)了除草劑利奴隆會(huì)激活I(lǐng)RE1a-XBP1 信號(hào)從而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，并可能促進(jìn)多發(fā)性硬化，證實(shí)環(huán)境會(huì)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的致病活動(dòng)［56］。

多細(xì)胞生物是由單個(gè)細(xì)胞通過(guò)不同的譜系發(fā)展而來(lái)的。在此期間，有限的胚胎細(xì)胞產(chǎn)生人體內(nèi)的所有細(xì)胞。確定這些胚胎細(xì)胞在成人組織中的發(fā)育命運(yùn)，需要在單細(xì)胞水平同時(shí)獲取發(fā)育途徑和細(xì)胞身份信息，這一直是譜系追蹤的主要挑戰(zhàn)。CRISPR/Cas9 靶位點(diǎn)受到PAM 序列NGG 的限制，而由于GG 或CC 二核苷酸平均每8 個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)一次，因此偶然且緊湊的CRISPR/Cas9 靶點(diǎn)陣列存在于大多數(shù)基因組，并能夠提供足夠多的信息進(jìn)行譜系追蹤［57］。使用CRISPR/Cas9 技術(shù)，在目標(biāo)基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂，并在不同位置（疤痕）上引入突變，可以永久且可遺傳地特異性標(biāo)記斑馬魚胚胎中的細(xì)胞，并在多輪細(xì)胞分裂過(guò)程中，逐步引入和積累DNA 突變，通過(guò)細(xì)胞間共享的突變模式來(lái)闡明譜系關(guān)系，以此將斑馬魚胚胎中的細(xì)胞與成體組織中的克隆細(xì)胞對(duì)應(yīng)起來(lái)［57-60］。

3 展望

CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為基因組操作工具的出現(xiàn)，使斑馬魚的生物學(xué)研究發(fā)生了革命性變化。各種類型的核酸酶及其變體已被開發(fā)用于斑馬魚研究的多個(gè)方面，包括基因敲除或敲入、活細(xì)胞成像、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多重靶向、建立疾病模型等。

隨著對(duì)多種斑馬魚疾病模型的研究，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可能會(huì)被用于保護(hù)健康和預(yù)防疾病等領(lǐng)域，例如用來(lái)預(yù)防心血管疾病。然而CRISPR/Cas系統(tǒng)缺少直接靶向成體特定組織的能力，并且脫靶率也一直是需要改進(jìn)的問(wèn)題。因此，未來(lái)需要進(jìn)一步提高其成體適用性，建立高精度靶向的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，拓展相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床診療手段。同時(shí)，由于CRISPR/Cas 系統(tǒng)體積大且?guī)в胸?fù)電荷，Cas 蛋白和sgRNA 的傳遞仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，開發(fā)出能夠?qū)RISPR/Cas 系統(tǒng)高效傳遞到細(xì)胞內(nèi)的載體，是未來(lái)實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)理想效果的重要方向。

未來(lái)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的研究和應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)需與技術(shù)交叉，例如機(jī)器學(xué)習(xí)、活細(xì)胞成像和更快捷的DNA 測(cè)序等。毫無(wú)疑問(wèn)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)將不斷結(jié)合新的功能元件，成為基因組工程研究中一個(gè)持續(xù)擴(kuò)展的工具箱。