恩格列凈通過劑量依賴性調(diào)控自噬對(duì)心肌梗死大鼠室性心律失常的影響

葉 強(qiáng)，丁艷玲，敬玉玲，李 濤,2

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省醫(yī)學(xué)電生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種死亡率和致殘率極高的心血管疾病。隨著發(fā)病率的快速上升，使其成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。室性心律失常（ventricular arrhythmias，VAs）是MI 后心臟驟停的主要原因，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[2]，減少M(fèi)I后VAs對(duì)改善患者預(yù)后非常重要?？剐穆墒СＫ幬锸侵委烿As的基礎(chǔ)，但目前抗心律失常藥物缺乏特異性，且部分藥物本身具有潛在致VAs 發(fā)生的作用，所以臨床使用受限[3]。故探索抗VAs 藥物的相關(guān)機(jī)制是預(yù)防MI后VAs發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。自噬在維持體內(nèi)平衡中起著重要作用。心肌缺血時(shí)，自噬通過清除受損細(xì)胞器，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、ROS 積累和線粒體通透性增加[4]，從而增加心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑（sodium-glucose co-transporter 2 inhibitor，SGLT2i）是新型降糖藥，通過抑制腎小管鈉-葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)體2 主動(dòng)重吸收葡萄糖，降低腎糖閾，增加尿葡萄糖的排出，從而降低血糖。其在安全有效降糖的同時(shí)還發(fā)揮著顯著的心血管保護(hù)效應(yīng)[6]，改善心衰作用顯著，目前已被寫入心衰指南[7]。有研究證實(shí)SGLT2i 可改善心律失常的發(fā)生和發(fā)展[8]。DECLARE-TIMI 58 試驗(yàn)顯示，2 型糖尿病患者可被達(dá)格列凈（dapagliflozin，DAPA）降低19%發(fā)生房顫/房撲的風(fēng)險(xiǎn)[6]。在二尖瓣反流小鼠中，DAPA 降低了房顫的誘導(dǎo)率和持續(xù)時(shí)間[9]。恩格列凈（empagliflozin，EMPA）可縮短糖尿病大鼠Q-T 間期（QTc:190±4 msVS.160±3 ms,P ＜0.005），縮短動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間[10]。SATO等研究發(fā)現(xiàn)DAPA 不改變2 型糖尿病患者的心率或QTc間期，但QTc離散度可顯著降低[11]。在糖尿病小鼠中，EMPA 可影響心房傳導(dǎo)時(shí)間，高劑量（30 mg/kg）可將房顫發(fā)生率從85%降低至36.8%[12]。目前關(guān)于SGLT2i 改善心律失常的報(bào)道幾乎均是針對(duì)糖尿病患者，SGLT2i 是否通過降糖作用達(dá)到改善心律失常的作用仍不清楚，且目前關(guān)于SGLT2i改善心律失常及探索相關(guān)機(jī)制的報(bào)道仍較缺乏，尤其是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)更為缺乏。故本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建非糖尿病大鼠MI模型探討EMPA是否可通過劑量依賴性調(diào)控自噬改善MI 大鼠VAs 的發(fā)生，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索，旨在為臨床上MI 后VAs 的預(yù)防和藥物治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，對(duì)SGLT2i心血管保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索，對(duì)MI后VAs藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只健康雄性SD大鼠，約200 g/只，SPF級(jí)。由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物程序均符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（2011年第8版），并經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（編號(hào)：20211115-019）。大鼠造模前進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室保持安靜，飼養(yǎng)溫度控制在25 ℃左右，濕度控制在40%左右，晝夜交替飼養(yǎng)12 h，不限制攝食飲水，定期更換墊料。

1.2 主要試劑

恩格列凈（歐唐靜10 mg/片，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司）、兔P62 抗體（cell signaling technology，CST,5114S）、兔Beclin-1 抗體（cell signaling technology，CST，3738）、兔LC3 抗體（cell signaling technology，CST，4108）、GAPDH抗體（ELK biotechnology,EA015）、Omni-ECL?超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（EpiZyme/雅酶，SQ201-100ml）、羊抗兔二抗（ASPEN,AS1107）。

1.3 主要儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟）、BL-420F 生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)（上海康為）、Vevo 2100 小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖機(jī)（FUJIFILM）、電刺激儀（NIHON KOHDEN）、電泳儀（Biorad 公司）、WB 顯影儀（Biorad 公司）、恒溫烘箱（山東博科醫(yī)療有限公司）、石蠟包埋機(jī)（孝感亞光有限公司）、切片機(jī)（Leica 公司）、攤烤片機(jī)（孝感亞光有限公司）、攤烤片機(jī)（孝感亞光有限公司）、全自動(dòng)數(shù)字切片掃描儀（KFBIO）。

1.4 動(dòng)物模型建立及分組

SD 大鼠禁食禁飲12 h 后，腹腔注射戊巴比妥麻醉，經(jīng)口腔行氣管插管，插管成功后連接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣（潮氣量0.8 mL，呼吸頻率80 次/min，呼吸時(shí)間比5:4），用標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)I、II、aVF 記錄心電圖。50 只大鼠按照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行心肌梗死模型制作，左室心肌顏色由紅變白、心肌搏動(dòng)變?nèi)趸蛐碾妶D提示S-T 段抬高提示造模成功[14-15]，然后逐層縫合胸壁肌肉，關(guān)胸。術(shù)中死亡4只，取下呼吸機(jī)后死亡7只，其余39只心肌梗死大鼠隨機(jī)分為MI 組、low-EMPA 組（10 mg/kg·d）和high-EMPA 組（30 mg/kg·d），每組13只。Sham組10只大鼠，只開胸不結(jié)扎前降支。MI組和Sham組每天予以3 mL 生理鹽水灌胃，low-EMPA 組每天予以10 mg/kg EMPA灌胃，high-EMPA組每天予以30 mg/kg EMPA 灌胃，灌胃4周。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

大鼠灌胃4 周后，持續(xù)吸入異氟烷（維持濃度1.5%）保持麻醉狀態(tài)。備皮后行M 型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness，LVAWT）、室間隔厚度（interventricular septum thickness，IVST）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic diameter，lveds）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）等指標(biāo)。

1.6 Burst刺激

腹腔注射戊巴比妥進(jìn)行麻醉，開胸暴露心臟，將起搏器電極插入心肌梗死心肌周邊區(qū)域心肌1 mm深，兩電極之間間隔2 mm，電極距梗死邊緣3 mm 內(nèi)。使用電刺激儀行Burst刺激（周長(zhǎng)60 ms，脈寬10 ms，持續(xù)時(shí)間30 s）[16]，每?jī)纱坞姶碳らg隔時(shí)間為1 min，以12 V 為刺激電壓，每只大鼠刺激10 次。記錄室性早搏（ventricular premature beat，VPB）、室速（ventricular tachycardia，VT）、室顫（ventricular fibrillation，VF）發(fā)生次數(shù)以及心臟驟停（vudden cardiac death，SCD）。VT被定義為持續(xù)的心室節(jié)律超過1 s或連續(xù)3次以上的室性期前收縮。VF 被定義為持續(xù)性室顫，伴有快速、嚴(yán)重不規(guī)則的心律。實(shí)行加分制，VPB：1 分/次；VT：2 分/次；VF：4分/次；SCD：6分。

1.7 HE染色

離體心臟被固定在4%多聚甲醛中48 h，用二甲苯置換出組織中的乙醇，后置于石蠟中冷卻，再用切片機(jī)切成5～10 μm 的薄片，在攤片機(jī)上攤片后貼于玻片，放入62 ℃的烤箱中烤100 min 即可。將切片置于二甲苯中脫蠟10 min 后放入100%、95%、85%、70%酒精中各5 min，使用蒸餾水沖洗后進(jìn)行HE 染色。將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5 min、95%酒精I(xiàn)I 5 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明。將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片[17]。顯微鏡觀察，圖片采集分析。

1.8 Western Blot

從左室梗死邊緣心肌組織中提取蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，檢測(cè)方法遵照說明書。使用RIPA裂解液和6倍SDS-PAGE蛋白質(zhì)加載緩沖液將樣品中的蛋白質(zhì)濃度稀釋至5 mg/mL。樣品100 ℃下煮沸10 min 后，分裝于5 mL EP 管，分別置于-20 ℃及-80 ℃保存。然后制作10%凝膠，在running buffer中拔除梳子，每個(gè)樣品孔中加入10 μL樣品。先用80 V電壓進(jìn)行電泳，待蛋白質(zhì)進(jìn)入下層膠后，繼續(xù)以150 V 電壓電泳40 min。PVDF膜經(jīng)過甲醇激活后，根據(jù)正負(fù)極制作轉(zhuǎn)膜“三明治”,以250 mA 電流在tans-buffer 中轉(zhuǎn)膜90 min 后使用無蛋白快速封閉液封閉15 min。PVDF 膜分別與P62抗體（1：2 000）、Beclin-1抗體（1：2 000）、LC3 抗體（1：1 000）、GAPDH 抗體（1：10 000）在4℃下孵育過夜。PVDF 膜經(jīng)TBST 沖洗3 次后（10 min/次），室溫下在低速搖床上與羊抗兔二抗（1：10 000）孵育1.5 h。TBST再?zèng)_洗3次（10 min/次）。免疫反應(yīng)條帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況

Sham 組大鼠全部存活，MI 組大鼠死亡3 只，low-EMPA組死亡2只，high-EMPA組死亡1只。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

如圖1 所示，與Sham 組相比，MI 組大鼠LVAWT、IVST、EF 明顯降低（P ＜0.05），LVEDD、LVEDS 明顯升高（P ＜0.05），LVPWT 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與MI 組相比，low-EMPA 組和high-EMPA 組大鼠LVAWT、IVST、EF 顯著升高（P ＜0.05），LVEDD、LVEDS 顯著降低（P ＜0.05），LVPWT 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；low-EMPA 組和high-EMPA 組相比，LVAWT、LVPWT、EF 差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；low-EMPA組大鼠比high-EMPA組大鼠IVST明顯增加（P ＜0.05），LVEDS、LVEDD明顯降低（P ＜0.05）。

圖1 藥物干預(yù)4周后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Ultrasound of rats after 4 weeks of drug intervention

2.3 VAs得分情況

如圖2 所示，與Sham 組相比，MI 組大鼠VAs 得分明顯升高（P ＜0.05）；與MI 組大鼠相比，low-EMPA 組和high-EMPA組大鼠VAs得分明顯降低（P ＜0.05），其中high-EMPA 組得分降低更明顯，但low-EMPA 組和high-EMPA組VAs得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 VAs得分Figure 2 VAs scores

2.4 HE染色

如圖3所示，Sham組心肌細(xì)胞排列規(guī)律整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少；MI組心肌細(xì)胞排列紊亂，核固縮，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膠原纖維沉積。較MI 組，low-EMPA 組和high-EMPA 組大鼠心肌排列趨于整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且high-EMPA組浸潤(rùn)減少更明顯。

圖3 HE染色Figure 3 HE staining

2.5 Western Blot

如圖4 所示，與Sham 組相比，MI 組P62 表達(dá)增加（P ＜0.05），Beclin-1、LC3II 表達(dá)降低（P ＜0.05）；與MI組相比，low-EMPA 組和high-EMPA 組P62 表達(dá)降低（P ＜0.05），Beclin-1、LC3II 表達(dá)增加（P ＜0.05）；與low-EMPA 組相比，high-EMPA 組P62 表達(dá)降低（P ＜0.05），Beclin-1、LC3II表達(dá)增加（P ＜0.05）。

圖4 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of autophagy related proteins

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建非糖尿病大鼠MI模型探討EMPA是否可通過劑量依賴性調(diào)控自噬改善MI 大鼠VAs 的發(fā)生，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索。藥物干預(yù)4周后，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，EMPA 可顯著改善MI 大鼠心功能及心臟形態(tài)，這與目前大多數(shù)研究報(bào)告是一致的[7,18-20]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示low-EMPA 組較high-EMPA 組心功能及心臟形態(tài)改善更明顯，這與本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期稍有偏差。結(jié)合HE染色結(jié)果，EMPA治療后MI大鼠心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維沉積得到改善，猜想EMPA改善心功能及心臟形態(tài)與心肌炎癥及心肌纖維化相關(guān)，但是本文未對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行探索，這是本實(shí)驗(yàn)的局限性。

電刺激的結(jié)果顯示EMPA可顯著降低MI大鼠VAs得分，且high-EMPA組得分降低更明顯，表明EMPA可劑量依賴性地改善MI 大鼠VAs 的發(fā)生。WANG 等也發(fā)現(xiàn)DAPA 可顯著減少異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌病大鼠VAs 的誘導(dǎo)率（5/7 VS.0/8）[21]。這與本研究得出的SGLT2i 可改善VAs 發(fā)生的結(jié)論是一致的。然而，F(xiàn)ERNANDES 對(duì)14 項(xiàng)涉及49 963 例2 型糖尿病和（或）心衰患者的臨床試驗(yàn)進(jìn)行了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，VAs 的發(fā)生率并沒有顯著降低（OR 0.85；95%CI 0.66～1.11;P=5.23），但心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）發(fā)生率下降28%[22]。

心肌缺血時(shí)，自噬通過清除受損細(xì)胞器，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、ROS積累和線粒體通透性增加、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而加重心肌損害，導(dǎo)致VAs 的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)Western blot 結(jié)果顯示EMPA 可顯著降低P62 表達(dá)，增加Beclin-1、LC3II 表達(dá)，且此效應(yīng)high-EMPA 組更明顯，表明EMPA 可劑量依賴性的增加MI 大鼠心肌細(xì)胞自噬水平，與既往研究一致。有研究發(fā)現(xiàn)SGLT2i可通過上調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白Bnip3 mRNA 水平來改善糖尿病MI 模型小鼠的心肌細(xì)胞自噬，從而提高Bnip3蛋白水平，防止自噬小體數(shù)量減少[23]。此外，SGLT2i在肝臟中也有改善自噬反應(yīng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)EMPA通過增強(qiáng)AMPK/mTOR 信號(hào)通路，增強(qiáng)肝臟巨噬細(xì)胞自噬，從而抑制IL-17/IL-23炎癥軸，緩解炎癥，顯著改善T2DM 小鼠非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的肝損傷[24]。Nasiri-Ansari N 等報(bào)道EMPA 可調(diào)控NAFLD 小鼠AMPK/mTOR 信號(hào)通路，同時(shí)上調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B 和Bcl2/Bax 的表達(dá)水平，導(dǎo)致肝細(xì)胞自噬增加[25]。

4 結(jié)論

EMPA 可劑量依賴性改善心肌梗死大鼠VAs 的誘導(dǎo)率，其機(jī)制可能是改善心功能及心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)、激活心肌細(xì)胞自噬。