光標(biāo)測技術(shù)在心臟電生理和心律失常研究中的應(yīng)用

李陽鵬，鄭雨晴，李劍鴻，陳唐葶，譚曉秋，2

1.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)學(xué)電生理四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（瀘州 646000）

心律失常（cardiac arrhythmia）是一種臨床上常見的心血管疾病，可單發(fā)也可與其他心血管疾病伴發(fā)，嚴(yán)重的心律失?？蓪?dǎo)致心源性猝死。因此，深入探究心臟電生理和心律失常機(jī)制尤為重要[1-2]。心律失常發(fā)生機(jī)制復(fù)雜[3-7]，研究心律失常的方法也多種多樣[8-9]，包括從單細(xì)胞水平的膜片鉗到組織層面的多通道電標(biāo)測和整體水平的電生理記錄。隨著心臟電生理研究技術(shù)不斷更新，越來越多心律失常的發(fā)病機(jī)制被揭示[10-11]。但是，作為一個(gè)功能合胞體，心臟在發(fā)生心律失常時(shí)其整體電活動表現(xiàn)、局部傳導(dǎo)異常機(jī)制、以及心臟各區(qū)域之間的聯(lián)系無法直觀的研究和顯示[12]，這使得心臟電生理研究的發(fā)展在相當(dāng)長一段時(shí)間都停滯不前。20 世紀(jì)末，隨著熒光探針技術(shù)和高分辨率采集技術(shù)的出現(xiàn)，光標(biāo)測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并被用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究。由于心臟與神經(jīng)系統(tǒng)的相似性，光標(biāo)測技術(shù)被應(yīng)用到心臟組織并逐漸成為研究心臟電生理功能的主要技術(shù)之一，對心臟電生理研究發(fā)揮了重要作用。此后，心臟電生理的研究不再局限于孤立的細(xì)胞或整體水平，器官水平的心律失常機(jī)制研究更為深入。通過心臟光標(biāo)測技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對心臟心肌細(xì)胞膜電位和胞內(nèi)鈣瞬變的同步記錄[13]，研究者可以直觀地觀察到心律失常發(fā)生前后心臟電信號和鈣信號的整體變化，如異位激動、折返形成的位置和異常傳導(dǎo)過程，從而加深對心律失常的認(rèn)識，促進(jìn)心臟電生理研究的深入[12]。本文就光標(biāo)測技術(shù)及其在常見疾病模型下的應(yīng)用進(jìn)行了評述，并為抗心律失常藥物的研究提供技術(shù)參考。

1 心臟光標(biāo)測技術(shù)原理

電壓敏感染料是一種雙極性分子，可以穩(wěn)定結(jié)合到細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，它們可以感受細(xì)胞膜內(nèi)外的電場力變化而做出適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)改變，在激發(fā)光的作用下，這種結(jié)構(gòu)改變會導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，從而準(zhǔn)確地反映膜電位的實(shí)時(shí)變化，因此，染料的熒光強(qiáng)度可以間接地反映膜電位的變化[12,14-16]。同樣的，胞內(nèi)鈣活動與動作電位呈現(xiàn)類似的規(guī)律變化，因此，使用鈣敏感染料可對胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行標(biāo)記，鈣染料熒光強(qiáng)度的變化可以反映胞內(nèi)鈣濃度或鈣瞬變的變化[17-18]。具體的光學(xué)原理為：在染色結(jié)束后，熒光染料分子與細(xì)胞膜或胞內(nèi)鈣離子有效結(jié)合，使用530 nm 的激發(fā)光照射心臟，電壓染料和鈣染料的發(fā)射光（電壓染料RH237發(fā)射光波峰為670 nm，鈣染料Rhod-2AM 發(fā)射光波峰為580 nm）被相機(jī)鏡頭收集（圖1A），通過幾種濾光片將兩種不同波長的熒光信號分離，采用EMCCD高速相機(jī)采集熒光信號，即可在采集系統(tǒng)上同時(shí)獲得瞬時(shí)膜電位（動作電位）和鈣瞬變的信號[19-20]（圖1B）。光標(biāo)測技術(shù)是一種將熒光探針技術(shù)與高分辨率采集技術(shù)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)豐富，運(yùn)用特定的軟件可完成對心臟整體或區(qū)域性電生理行為的分析和研究[21-22]。

光標(biāo)測技術(shù)較其它電生理技術(shù)的優(yōu)勢：①高時(shí)空分辨率（時(shí)間分辨率——采樣頻率可達(dá)1 000 Hz，空間分辨率——最小像素點(diǎn)可達(dá)32 μm）；②廣闊的采樣面積——可達(dá)10 000 個(gè)像素點(diǎn)以上[19-20]，意味著可以標(biāo)測哺乳動物心臟，如小鼠、大鼠、豚鼠等；③可以直接計(jì)算各個(gè)電生理參數(shù)在不同部位分布的差異；④可以從心臟整體層面觀察心臟電信號和鈣信號的傳導(dǎo)，了解心律失常發(fā)生時(shí)的起點(diǎn)和傳導(dǎo)路徑；⑤對心臟損傷小，信號不會受電磁場的干擾[14]。

2 光標(biāo)測技術(shù)各參數(shù)在電生理研究中的應(yīng)用

光標(biāo)測技術(shù)發(fā)展迅速，在20世紀(jì)末出現(xiàn)后已逐漸成為心臟電生理研究的主要技術(shù)之一，多用于心臟電生理和多種心血管疾病模型的電生理變化研究及藥物的有效性評價(jià)。然而，要研究疾病模型下的心律失常機(jī)制，需對光標(biāo)測的各個(gè)電生理參數(shù)有足夠的了解，并將其有序整理、分析，從而明確該疾病模型下或藥物干預(yù)后的電生理機(jī)制[22]。

2.1 動作電位

2.1.1 動作電位時(shí)程 動作電位時(shí)程（action potential duration，APD）不同時(shí)期的研究：工作心肌細(xì)胞動作電位分為0、1、2、3、4期，不同時(shí)期參與的離子通道不同，通過分析APD 的不同時(shí)間段，可以大致了解對應(yīng)時(shí)段的離子通道的功能狀態(tài)[23-25]。動作電位時(shí)程與心律失常密切相關(guān)，動作電位延長被認(rèn)為是造成心律失常易感性增加的一種機(jī)制，可能與復(fù)極化延長導(dǎo)致的延遲后去極（delayed after depolarization，DAD）或早后去極（early after depolarization，EAD）的發(fā)生率增加有關(guān)；同時(shí)結(jié)合動作電位有效不應(yīng)期（effective refractory period，ERP）的測量，我們可以分析ERP與APD的比值來大致評價(jià)心律失常風(fēng)險(xiǎn)[26]。

2.1.2 動作電位異質(zhì)性 不同心肌細(xì)胞電生理特性不盡相同,各個(gè)細(xì)胞間除極和復(fù)極時(shí)間可能存在差異，這種差異被稱為心肌動作電位異質(zhì)性。在整體心臟中，光標(biāo)測APD 熱圖可以直觀地觀察到，心房動作電位時(shí)程明顯短于心室，這是由不同功能區(qū)域心肌細(xì)胞離子通道的種類和數(shù)量決定的[27]，動作電位異質(zhì)性的增加被認(rèn)為是造成折返性心律失常的一種重要機(jī)制[25]。同樣的，活體心肌切片心內(nèi)膜與心外膜的APD差異[19]，竇房結(jié)細(xì)胞與心房肌細(xì)胞APD的差異都是結(jié)構(gòu)和功能的差異決定的。因此，可以將實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行對比分析，明確實(shí)驗(yàn)處理對于動作電位的影響，再分析具體影響的時(shí)段，從而更加深入的研究其中的分子機(jī)制，如某種離體通道是否存在數(shù)量和活性的改變[28]，或某些藥物通過影響離子通道活性影響動作電位時(shí)程。

2.1.3 動作電位的傳導(dǎo) 心臟正常的傳導(dǎo)方向?yàn)楦]房結(jié)、左右心房、房室結(jié)、希氏束、左右束支及浦肯野纖維網(wǎng)[29]。通過對心臟的動作電位標(biāo)記，可以研究在竇性節(jié)律下心臟電活動的起源和傳導(dǎo)路徑。因此，精準(zhǔn)識別動作電位的傳導(dǎo)在研究心律失常中非常重要[30-31]。竇房結(jié)細(xì)胞是心臟中自律性最高的起搏細(xì)胞，因而作為心臟整體電沖動發(fā)放的領(lǐng)導(dǎo)者。2010 年，華盛頓大學(xué)EFIMOV團(tuán)隊(duì)首次使用光標(biāo)測技術(shù)解釋人竇房結(jié)起搏點(diǎn)和傳導(dǎo)路徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與經(jīng)典理論相匹配，顯示出光標(biāo)測技術(shù)在組織器官水平電生理研究的優(yōu)越性[32]。而部分實(shí)驗(yàn)需除去自身節(jié)律影響，采用額外刺激，此時(shí)心臟動作電位的傳導(dǎo)則為刺激點(diǎn)向遠(yuǎn)處傳播，后續(xù)的數(shù)據(jù)分析可以定量計(jì)算動作電位傳導(dǎo)速度，而動作電位激活圖可直觀顯示傳導(dǎo)方向和傳導(dǎo)時(shí)間（圖1C）。通過對比傳導(dǎo)速度可以明確實(shí)驗(yàn)組和對照組的傳導(dǎo)功能是否存在差異，再結(jié)合相關(guān)的分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如縫隙連接蛋白的豐度變化等，可以深入進(jìn)行心臟電生理和心律失常機(jī)制研究[33-34]。此外，心律失常期間也存在動作電位傳導(dǎo)的異常，可以分析激活圖或相位圖大致了解心律失常的起點(diǎn)和異常傳導(dǎo)路徑[34]。因此，光標(biāo)測技術(shù)對于研究異位起搏點(diǎn)、折返、轉(zhuǎn)子等異常傳導(dǎo)方面體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

2.2 鈣瞬變的研究

動作電位產(chǎn)生過程中，0期大量內(nèi)流的鈉離子導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，從而激活L型鈣通道，鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)激活肌漿網(wǎng)的雷諾定受體（ryanodine receptor，RyR2），誘導(dǎo)鈣促鈣釋放過程，造成大量鈣離子從肌漿網(wǎng)進(jìn)入胞漿，隨后肌漿網(wǎng)鈣離子ATP 酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）將鈣離子回收到肌漿網(wǎng)，整個(gè)過程即鈣瞬變過程[35-36]。與動作電位一樣，心臟不同區(qū)域或同區(qū)域不同類型組織的鈣瞬變也存在差異（圖1D）；鈣瞬變時(shí)程的延長或縮短一定程度說明肌漿網(wǎng)RyR2或SERCA活性的改變[37-38]，這在病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)在整個(gè)心臟，也可能存在于局部病變部位及周邊區(qū)域。而且，鈣活動的紊亂與膜電位的異常密切相關(guān)，如舒張期異常的鈣釋放可能導(dǎo)致DAD 的形成，可能造成觸發(fā)活動進(jìn)而誘發(fā)快速室性心律失常[39]。

2.3 動作電位和鈣瞬變耦聯(lián)關(guān)系的研究

正常心臟電活動功能的實(shí)現(xiàn)依賴于膜電位和鈣瞬變的協(xié)調(diào)配合，這是一個(gè)動態(tài)的、復(fù)雜的平衡關(guān)系。只有這樣，心臟的興奮才能正常傳導(dǎo)，心臟舒縮活動才可能有效進(jìn)行。一旦這種平衡被打破，心臟的興奮傳導(dǎo)可能加快、延遲或阻滯，嚴(yán)重時(shí)會造成快速室性心律失導(dǎo)致心源性猝死[40]。2019 年，牛津大學(xué)雷鳴教授在Cardiovascular Research期刊的一篇綜述中指出膜鐘和鈣鐘與心律失常的關(guān)系，膜鐘和鈣鐘分別反映動作電位和鈣瞬變過程。作者指出，膜鐘激活產(chǎn)生鈣鐘，鈣鐘回饋膜鐘，二者相互協(xié)調(diào)配合，穩(wěn)定膜電位正常傳導(dǎo)并維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。不論是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常還是離子通道功能改變，都會造成二者穩(wěn)態(tài)的失衡引發(fā)心臟電活動的異常，即心律失常。二者的耦合關(guān)系被稱為latency（圖1E），即鈣鐘落后于膜鐘的時(shí)間，對于功能正常的心臟來說，這個(gè)時(shí)間是基本固定的，但心臟心功能異常時(shí)，這種耦合關(guān)系可能出現(xiàn)改變[41]。光標(biāo)測在整體心臟水平同時(shí)記錄膜電位和鈣離子濃度變化，可分析動作電位和鈣瞬變之間的耦合關(guān)系并計(jì)算latency評價(jià)其心律失常易感性。本課題組利用光標(biāo)測對老年鼠心臟檢測后發(fā)現(xiàn)，其latency較青年鼠顯著縮短，并且老年鼠心律失常發(fā)生率明顯增加，這提示鈣鐘的提前激活可能是造成老年鼠心律失常易感性增加的機(jī)制之一[42]。研究者在兒茶酚胺敏感的多形性室性心動過速模型的研究中發(fā)現(xiàn)，鈣異常釋放導(dǎo)致的胞內(nèi)鈣超載引發(fā)鈉鈣交換體（sodium-calcium exchange，NCX）過度活化，引起DAD 誘發(fā)觸發(fā)活動，導(dǎo)致膜電位異常引發(fā)快速室性心律失常，這便是鈣鐘異常引起膜鐘異常的經(jīng)典示例[39]。

3 光標(biāo)測技術(shù)在心臟病理生理研究中的應(yīng)用

心臟電生理研究的目的是為了深入了解疾病的電生理機(jī)制從而選擇更好的治療手段，通常的研究方法是用小鼠構(gòu)建相關(guān)疾病動物模型。常見的心臟疾病動物模型有主動脈弓縮窄術(shù)誘導(dǎo)的左室肥厚伴心力衰竭（TAC）模型、心肌梗死模型（MI）、心臟缺血再灌注（IR）模型和遺傳性心律失?；蛐呐K病模型[43]。不同的疾病模型，其電生理功能及發(fā)病機(jī)制不盡相同，但也存在聯(lián)系。通過分析這些模型的光標(biāo)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，在TAC模型中，動作電位的激活時(shí)間明顯延遲，提示心臟電傳導(dǎo)功能降低[44]。通過心臟光標(biāo)測明確了表型后可以分析影響心肌細(xì)胞動作電位傳導(dǎo)的相關(guān)因素，如心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白含量或活性的下降，或者傳導(dǎo)系統(tǒng)功能的異常都可能造成心臟整體傳導(dǎo)功能的降低；同樣的結(jié)果可以在IR模型和MI模型中重復(fù)發(fā)現(xiàn)[45-48]，這可能與心肌細(xì)胞的損傷直接相關(guān)?？偟膩碚f，器質(zhì)性心臟疾病的小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下即出現(xiàn)鈣處理明顯異常（圖2A）和動作電位時(shí)程延長與傳導(dǎo)速度減慢（圖2B），并且區(qū)域間分布差異明顯，這可能是造成其心律失常易感性增加的原因。而非器質(zhì)性病變的遺傳性心律失常和心臟病模型中，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，這些小鼠心臟的血流動力學(xué)和電生理功能是基本正常的，但在應(yīng)激條件，如兒茶酚胺干預(yù)、活動或情緒激動等刺激下，其動作電位傳導(dǎo)、鈣處理等電生理功能則發(fā)生明顯異常，常導(dǎo)致心律失常的發(fā)生[33-34]。

圖2 心臟異常事件分析Figure 2 Analysis of abnormal cardiac events

4 光標(biāo)測技術(shù)在心血管相關(guān)藥物研究中的應(yīng)用

目前心血管藥物的研究越來越多，新型藥物不斷出現(xiàn)，許多經(jīng)典藥物的其它心血管作用不斷被發(fā)現(xiàn)，非心血管藥物在心血管疾病中的作用也逐漸被挖掘，光標(biāo)測技術(shù)在評價(jià)這些藥物的電生理功能中發(fā)揮了重要作用。比如恩格列凈作為降糖藥被廣泛用于臨床，近年來有研究表明其在心血管疾病中具有保護(hù)作用。離體心臟光標(biāo)測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心梗小鼠使用了恩格列凈后，其惡性心律失常和DAD 發(fā)生率明顯降低，在發(fā)生快速室性心律失常時(shí)其主導(dǎo)頻率也相應(yīng)降低，提示藥物干預(yù)后即使發(fā)生心律失常，其惡性程度也是明顯降低的；在鈣處理方面，恩格列凈明顯縮短了心梗小鼠的鈣處理時(shí)間和鈣衰減常數(shù)，提示恩格列凈通過對電生理調(diào)控改善心臟功能[49]。另外，急性心肌梗死和PCI術(shù)后的缺血再灌注在臨床中極為常見，二者通常出現(xiàn)心律失常易感性的增加，通過構(gòu)建兩種疾病小鼠模型，進(jìn)行光標(biāo)測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺血或梗死區(qū)，其傳導(dǎo)速度明顯減慢，且傳導(dǎo)方向發(fā)生偏移（圖2B），病變組織局部發(fā)生傳導(dǎo)阻滯，通過雷諾嗪干預(yù)，傳導(dǎo)速度有所恢復(fù)，傳導(dǎo)阻滯現(xiàn)象明顯減輕，且心律失常發(fā)生率明顯降低，這提示藥物通過改善心臟電傳導(dǎo)功能降低了心律失常易感性，直接證明了藥物的有效性。在大鼠無菌性心包炎模型中，作者使用白介素6（IL-6）抑制劑后發(fā)現(xiàn)，鈣交替（圖2A）程度明顯減弱，空間不均一交替發(fā)生率顯著降低，且雷諾定受體不應(yīng)性明顯恢復(fù)，心律失常發(fā)生率明顯降低，提示藥物通過改善鈣處理減輕了大鼠心包炎致房顫的發(fā)作[50]。TAC術(shù)后小鼠心律失常易感性明顯增加，在高頻刺激后，其出現(xiàn)快速室性心律失常，光標(biāo)測相位圖分析發(fā)現(xiàn)，在快速室性心律失常時(shí)，異位激動和折返形成是介導(dǎo)室性心律失常的主要表現(xiàn)（圖2C）。疾病狀態(tài)下，心臟病理性改變勢必導(dǎo)致心臟電生理重塑，光標(biāo)測技術(shù)通過分析疾病狀態(tài)下的高通量電生理數(shù)據(jù)，通過差異性分析，從各個(gè)層面評價(jià)藥物對各電生理參數(shù)的影響，如動作電位時(shí)程的變化，動作電位傳導(dǎo)的異常，鈣處理的動力學(xué)改變等。因此，光標(biāo)測技術(shù)逐漸在國內(nèi)外心血管藥物研究發(fā)揮了重要作用。

5 小結(jié)與展望

光標(biāo)測技術(shù)作為目前研究心臟電生理的新興技術(shù)，提供了高時(shí)空分辨率，同時(shí)獲得高通量的跨膜電位和胞內(nèi)鈣處理的光學(xué)信號，在理解和研究心臟電生理及復(fù)雜心律失常時(shí)電傳導(dǎo)和鈣處理動力學(xué)中的作用尤為重要。然而，熒光染料和興奮收縮解偶聯(lián)劑對心臟的毒性作用，以及心臟離體后神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的缺失，難以獲得完全生理狀態(tài)下的電生理數(shù)據(jù)，且由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身的限制，光標(biāo)測技術(shù)目前無法直接應(yīng)用于臨床，僅在研究領(lǐng)域或臨床前階段使用，這是光標(biāo)測技術(shù)目前的主要限制。隨著藥物研發(fā)技術(shù)的革新，不同靶分子的熒光探針被逐漸研發(fā)（如肌漿網(wǎng)鈣指示劑Fluo-5N AM、線粒體膜電位指示劑TMRE[51-52]），高分辨率采集技術(shù)和熒光探針技術(shù)的改進(jìn)，以及近幾年全景光標(biāo)測的提出[21，53]，心臟光標(biāo)測技術(shù)勢必會取得日新月異的發(fā)展。相信在未來數(shù)十年，隨著技術(shù)的改進(jìn)，我們對心血管疾病的研究會進(jìn)一步深入，對心律失常發(fā)生機(jī)制的理解和干預(yù)也會更加全面。