三七總皂苷基于PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控自噬和泛素蛋白積累對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

王 華,譚 超,2,3,王子焱,張 濤,李鑫成

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007;2. 國(guó)醫(yī)大師熊繼柏教授傳承工作室,湖南 長(zhǎng)沙 410007;3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國(guó)內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科,湖南 長(zhǎng)沙 410208;4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,湖南 長(zhǎng)沙 410036;5. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410036)

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是急性腎損傷的主要原因,在泌尿外科和腎移植手術(shù)中經(jīng)常發(fā)生。IRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)胞死亡(凋亡和程序性壞死)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、能量耗竭等均參與了IRI的發(fā)生發(fā)展[1-3]。近年來發(fā)現(xiàn)自噬在IRI所致的急性腎損傷中被激活并發(fā)揮保護(hù)作用[4],且自噬與凋亡在急性腎損傷發(fā)病中存在密切聯(lián)系,并共享諸多分子信號(hào)通路,其中磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路介導(dǎo)自噬與凋亡的交互作用,激活該信號(hào)通路能抑制凋亡,增強(qiáng)自噬[4-6]。除自噬外,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細(xì)胞的另一種重要的降解機(jī)制。UPS主要負(fù)責(zé)降解短壽命和可溶性錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì),而自噬則主要降解長(zhǎng)壽命、不溶性蛋白質(zhì)聚集體甚至整個(gè)功能失調(diào)或多余的細(xì)胞器。盡管它們的工作模式和對(duì)底物識(shí)別的要求不同,但UPS和自噬均可通過泛素化作為降解信號(hào)來識(shí)別并消除錯(cuò)誤折疊/未折疊的蛋白質(zhì)[7]。此外,UPS和自噬代謝過程中的重要組成蛋白可互為彼此的降解底物[8],而抑制UPS時(shí)自噬會(huì)代償性增加[9],但目前關(guān)于UPS在急性腎損傷中的研究較少。三七總皂苷是三七的主要活性成分,具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用[10],其可通過自噬途徑缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)/B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)減輕心肌缺血再灌注損傷[11],但其對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討三七總皂苷是否可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控自噬和UPS相關(guān)蛋白保護(hù)IRI所致急性腎損傷。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠30只,8周齡,體重(200±25)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(湘)2020-0010。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在無特定病原體的設(shè)施中,保持溫度22 ℃,濕度55%左右,12 h晝夜節(jié)律并自由進(jìn)食和飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、儀器與試劑 三七總皂苷(云南云科藥業(yè)有限公司),Experion全自動(dòng)電泳系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國(guó)),蘇木精-伊紅染色試劑盒(上海碧云天公司),小鼠抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠半胱氨酸天門冬氨酸酶3(Caspase-3)單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠Bcl-2關(guān)聯(lián)蛋白X(Bax)單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠mTOR單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠p-mTOR單克隆抗體(美國(guó)),小鼠抗大鼠Akt單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),小鼠抗大鼠p-Akt(Ser473)單克隆抗體(Sigma,美國(guó)),白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-18(IL-18) ELISA試劑盒(BD生物科學(xué)公司,美國(guó)),丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(中國(guó)南京建城生物工程研究所),Rotor-Gene SYBR?Green PCR Kit試劑盒(Qiagen公司,美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將30只大鼠隨機(jī)分為模型組、三七總皂苷低劑量組、三七總皂苷高劑量組,每組10只。3組大鼠均進(jìn)行IRI造模:腹腔注射氯胺酮(120 mg/kg)麻醉大鼠,游離出雙側(cè)腎臟,切除右腎,鈍性分離左側(cè)腎蒂血管,應(yīng)用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈和靜脈誘導(dǎo)缺血(腎臟由紅色逐漸均勻變暗呈紫黑色代表腎血流阻斷成功)。缺血45 min后松開并取出無創(chuàng)動(dòng)脈夾,以腎臟顏色從紫黑色變?yōu)轷r紅色為再灌注成功。在應(yīng)用無創(chuàng)動(dòng)脈夾前1 h,模型組大鼠尾靜脈注射1 mL等滲鹽水,三七總皂苷低劑量組大鼠尾靜脈注射三七總皂苷10mg/kg(溶于1 mL等滲鹽水中),三七總皂苷高劑量組尾靜脈注射三七總皂苷20 mg/kg(溶于1 mL等滲鹽水中)。術(shù)后模型組每天尾靜脈注射1次等滲鹽水,三七總皂苷低、高劑量組每天尾靜脈注射1次相應(yīng)劑量三七總皂苷,均連續(xù)3 d。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1腎功能指標(biāo)和炎癥因子水平 術(shù)后第4天,尾靜脈取血,以1 000 ×g離心10 min分離血漿,采用生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平,使用ELISA試劑盒說明檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-18水平。

1.4.2腎組織病理形態(tài) 取各組大鼠腎臟,在低溫預(yù)冷的生理鹽水中小心去除腎臟包膜,取一半腎臟組織在4%多聚甲醛中固定24h,石蠟包埋,制備4 μm厚切片,蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)形態(tài)。

1.4.3腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量 取各組大鼠的腎臟,用10×(w/v)冰冷的PBS(50 mmol/L,pH 7.8)勻漿,4 ℃下13 000 ×g離心3 min,采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)MDA、ROS、SOD和LDH含量。

1.4.4腎組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 將大鼠腎臟組織稱重后加入含有cocktail及磷酸酶抑制劑的裂解液,利用組織研磨儀在冰上充分研磨,冰上裂解30 min,以10 000 r/min在4 ℃下離心10 min,取上清進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。吸取20～50 μg總蛋白樣品,按蛋白樣品:上樣緩沖液體積4∶1的比例加入5×上樣緩沖液并充分混勻,置于水浴鍋中100 ℃煮沸10 min,使蛋白質(zhì)充分變性。利用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分析,隨后200 mA恒流90 min將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,取出PVDF膜,封閉液孵育1 h,加入對(duì)應(yīng)的一抗[小鼠抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠Caspase-3單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠Bax單克隆抗體(1∶400),小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠mTOR單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠p-mTOR單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠Akt單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠p-Akt(Ser473)單克隆抗體(1∶400)],4 ℃搖床孵育過夜。次日,將PVDF膜取出,1×TBST清洗3次,每次10 min。隨后,將膜與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶5 000,上海碧云天公司)室溫孵育1 h,1×TBST清洗3次,每次10 min。利用ECL顯影液避光孵育PVDF膜,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影成像,采用Image J軟件計(jì)算分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5腎組織中自噬相關(guān)蛋白和泛素化蛋白mRNA表達(dá)情況 使用TRIzol?和氯仿方法從腎臟組織中提取總RNA,用NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。在200 μL無酶EP管中,依次加入相應(yīng)體積的5×gDNA Eraser Buffer、gDNA Eraser以及腎組織RNA,無酶水補(bǔ)齊體積至10 μL。渦旋混勻并離心后,放入PCR 儀中以42 ℃,2 min,4 ℃程序反應(yīng)以去除全基因組DNA。將PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ、PT Primer Mix、5×PrimeScript Buffer加入去基因組DNA樣品中,配制20 μL反轉(zhuǎn)錄體系。渦旋混勻并離心后,放入PCR儀中37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃反應(yīng)以完成反轉(zhuǎn)錄。使用Rotor-Gene SYBR?Green PCR Kit對(duì)Beclin-1、自噬相關(guān)蛋白8(ATG8)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、腫瘤壞死因子相關(guān)因子6(TRAF6)、 Beclin-1調(diào)節(jié)自噬蛋白-1(AMBRA1)、神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)因子4(NEDD4) 進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。配制熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:5 μL SYBR premix Ex TaqⅡ、0.4 μL Forward primer、0.4 μL Reverse primer、0.2 μL ROX、3 μL無RNA 酶水,1 μL cDNA,配制為10 μL反應(yīng)體系。分別加入到八排管中,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物反應(yīng)條件:預(yù)變性,95℃ 30s,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);95 ℃ 1 min,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s結(jié)束,4 ℃保存。記錄各個(gè)孔的CT值,采用2-ΔΔCT定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎功能指標(biāo)和炎癥因子水平比較三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組BUN、Cr、IL-1β、IL-6和IL-18水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且三七總皂苷高劑量組BUN、Cr、IL-1β、IL-6和IL-18水平均明顯低于三七總皂苷低劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能指標(biāo)和炎癥因子水平比較

2.2各組大鼠腎臟組織HE染色病理形態(tài) 模型組大鼠腎臟組織血管周圍擴(kuò)張充血,腎小管擴(kuò)張,細(xì)胞水腫,管腔內(nèi)蛋白質(zhì)聚集,三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組病理?yè)p傷明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織HE染色病理形態(tài)(×100)

2.3各組大鼠腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量 三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組MDA、ROS、LDH含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且三七總皂苷高劑量組均明顯低于三七總皂苷低劑量組(P均<0.05);三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組SOD含量均明顯高于模型組(P均<0.05),且三七總皂苷高劑量組明顯高于三七總皂苷低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量比較

2.4各組大鼠腎組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況 與模型組比較,三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組p-Akt、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與三七總皂苷低劑量組比較,三七總皂苷高劑量組p-Akt、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量均更高(P均<0.05),p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量更低(P<0.05)。見圖2及表4。

圖2 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)情況

表4 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5各組大鼠腎組織中凋亡蛋白表達(dá)情況 與模型組比較,三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組Caspase-3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與三七總皂苷低劑量組比較,三七總皂苷高劑量組Caspase-3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均更低(P均<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(P<0.05)。 見圖3及表5。

圖3 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中凋亡蛋白表達(dá)情況

表5 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.6各組大鼠腎組織中自噬相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況 三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組Beclin-1、ATG8和LC3 Ⅱ/Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05),且三七總皂苷高劑量組Beclin-1、ATG8和LC3 Ⅱ/Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于三七總皂苷低劑量組(P均<0.05)。見表6。

表6 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中自噬相關(guān)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.7各組大鼠腎組織中泛素化蛋白mRNA表達(dá)情況 與模型組比較,三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組TRAF6和AMBRA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),NEDD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與三七總皂苷低劑量組比較,三七總皂苷高劑量組TRAF6和AMBRA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均更高(P均<0.05),NEDD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量更低(P<0.05)。見表7。

表7 各組腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中泛素化蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

PI3K/Akt通路在細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和炎癥的調(diào)節(jié)中起作用。mTOR是PI3K/Akt通路的重要下游靶標(biāo),影響蛋白質(zhì)合成,被認(rèn)為是自噬的基本控制器。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活能抑制細(xì)胞凋亡,激活自噬,減弱ROS活性,減輕炎癥反應(yīng)[12-14]。細(xì)胞凋亡途徑包括死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑、以線粒體為中心的內(nèi)源性凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。在外源性凋亡途徑中,死亡受體與配體在細(xì)胞膜上結(jié)合導(dǎo)致Caspase-8募集和活化,進(jìn)一步激活下游Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。而當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑時(shí),促凋亡的BH3蛋白抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W,隨后激活促凋亡蛋白Bax等,在線粒體外膜上形成多孔缺陷,從而使得凋亡因子細(xì)胞色素C等從細(xì)胞器釋放到細(xì)胞質(zhì)中,導(dǎo)致Caspase-9的募集和活化,而Caspase-9經(jīng)過蛋白水解加工后激活下游Caspase-3,發(fā)生Caspase依賴性凋亡[16-17]。由此可見,無論是在外源性還是內(nèi)源性凋亡途徑中,Caspase-3均作為了凋亡的效應(yīng)分子。氧化應(yīng)激是IRI的重要因素,在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。MDA、LDH、SOD和ROS在維持細(xì)胞內(nèi)氧化和還原平衡中起關(guān)鍵作用,是急性腎損傷發(fā)病過程中評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的主要指標(biāo)[18-19]。IL-1β通常由循環(huán)中被激活的單核細(xì)胞、組織內(nèi)浸潤(rùn)性的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生,主要參與全身的免疫反應(yīng)[20];IL-6是一種B細(xì)胞刺激因子,其表達(dá)水平在急性腎損傷患者血清和尿液中均升高[21];IL-18也被稱為干擾素-γ誘導(dǎo)因子,屬于IL-1超家族,其也在損傷的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)升高[22-23]。因此,IL-1β、IL-6和IL-18均被視作急性腎損傷的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組BUN、Cr、IL-1β、IL-6、IL-18水平和腎組織中MDA、ROS、LDH含量及p-mTOR、Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組,腎組織中SOD含量和p-Akt、PI3K、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組,病理?yè)p傷明顯輕于模型組。表明三七總皂苷通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,減輕腎損傷,保護(hù)腎功能。

研究表明,自噬在IRI所致體內(nèi)外急性腎損傷模型中被激活[4]。PI3Ks分為三類,它們均參與自噬的調(diào)控,其中Ⅰ類PI3K的激活通過經(jīng)典的PI3K/Akt/mTORC1途徑抑制自噬,而Ⅲ類PIK3C3/Vps34與PIK3R4、自噬蛋白Beclin形成蛋白復(fù)合物,產(chǎn)生自噬起始和進(jìn)展所必需的磷脂酰肌醇3-磷酸[24]。自噬激活常表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,LC3Ⅱ/Ⅰ比率與自噬體形成呈正相關(guān)。ATG8蛋白及LC3是自噬發(fā)生的關(guān)鍵因子,而多種泛素化相關(guān)蛋白也參與了自噬的調(diào)控。其中AMBRA1能將蛋白激酶ULK1募集到泛素連接酶TRAF6,后者能促進(jìn)ULK1泛素化,促進(jìn)自噬。與TRAF6和AMBRA1相反,泛素連接酶NEDD4可促進(jìn)Beclin-1蛋白酶體降解以抑制自噬[25-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三七總皂苷高劑量組和三七總皂苷低劑量組腎組織中Beclin-1、ATG8、LC3 Ⅱ/Ⅰ、TRAF6、AMBRA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組,NEDD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組。說明三七總皂苷可以通過PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬,可調(diào)控UPS相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)自噬。

綜上所述,三七總皂苷可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路,促進(jìn)UPS相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)自噬,從而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減輕腎缺血再灌注損傷。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。