計(jì)算機(jī)輔助模擬技術(shù)在脲酶抑制劑篩選中的應(yīng)用*

謝勇飛, 束維正, 李慧敏, 胡婷婷, 陳 駿

(中鹽安徽紅四方肥業(yè)股份有限公司 安徽合肥 231602)

0 前言

脲酶是一種能夠催化尿素水解的土壤含鎳酶。 尿素進(jìn)入土壤后,酰胺態(tài)氮并不能被作物直接吸收利用,脲酶可催化酰胺態(tài)氮水解為銨態(tài)氮,作物以銨態(tài)氮或硝態(tài)氮形式吸收轉(zhuǎn)化氮營(yíng)養(yǎng)元素[1]。 尿素過(guò)快轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮會(huì)造成氨揮發(fā),降低了施入土壤的氮素利用率。 脲酶抑制劑可與尿素形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制,減少尿素的過(guò)量轉(zhuǎn)化,降低尿素的水解速率,減緩銨態(tài)氮的揮發(fā)和硝化過(guò)程。

研究發(fā)現(xiàn),脲酶抑制劑的作用機(jī)制包括以下4 個(gè)方面:一是脲酶抑制劑競(jìng)爭(zhēng)占居了土壤中脲酶催化活性中心位置,減少了尿素與脲酶結(jié)合的概率,降低了酶的活性;二是脲酶抑制劑多具有還原性,還原性物質(zhì)可改變土壤氧化水平,減弱脲酶在土壤中的催化效果;三是部分脲酶抑制劑為脲酶生物合成抑制劑,可減弱合成脲酶的微生物的代謝,使脲酶生物合成過(guò)程受阻,減少土壤中脲酶的含量,參與反應(yīng)的尿素變少,水解速率降低;四是選擇與尿素結(jié)構(gòu)相似的化合物,使其在隨水移動(dòng)的過(guò)程中與脲酶發(fā)生作用,替代尿素進(jìn)行分解或結(jié)合,起到保護(hù)尿素不被分解的目的。 田間施用尿素的同時(shí)追施一定量的脲酶抑制劑,可有效降低土壤中脲酶的活性,減緩尿素的分解速率,減少土壤中氨的揮發(fā),減弱對(duì)銨的硝化作用。

脲酶抑制劑發(fā)揮作用需要土壤具備適當(dāng)?shù)臈l件。 影響脲酶抑制劑活性的因素包括土壤的酸堿度、通透性、有機(jī)物含量、水含量等,同時(shí)需要考慮土壤中尿素含量。 脲酶抑制劑的種類較多,作用的環(huán)境條件也不同。 如苯基磷酰二胺(PPD)是一種被認(rèn)為有潛力的脲酶抑制劑,對(duì)酸堿度比較敏感,容易分解形成酚類物質(zhì),而酚是一種比較弱的脲酶抑制劑。 對(duì)苯二酚(HQ)在通氣性良好的條件下使用時(shí),效果比正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)和PPD 差。 NBPT 受土壤酸堿度的影響相對(duì)較小,有文獻(xiàn)報(bào)道,在堿性土壤中更適合使用NBPT[2]。 因此,各種脲酶抑制劑由于作用機(jī)制、土壤作用條件不同,使用方法也不同,但在脲酶活性高的土壤上施用脲酶抑制劑,抑制作用較好。

NBPT 和HQ 是兩種研究較多的脲酶抑制劑。HQ 通過(guò)減少尿素的水解以降低氨的揮發(fā)和硝化作用,提高了酰胺態(tài)氮的利用率,延長(zhǎng)了銨態(tài)氮對(duì)作物的有效持續(xù)供應(yīng)時(shí)間并減少了損失。 邢衛(wèi)等[3]的研究發(fā)現(xiàn),在土壤中施用尿素,當(dāng)NBPT 的用量為尿素氮的0.2%時(shí),可直接減少氨的揮發(fā)損失,延長(zhǎng)銨態(tài)氮的持續(xù)供應(yīng)時(shí)間。 與普通尿素相比,NBPT 增效劑尿素能顯著增加春油菜的角果數(shù)和角粒數(shù),春油菜折合產(chǎn)量為4 075.6 kg/hm2,較對(duì)照不施氮肥處理的增產(chǎn)2 425.6 kg/hm2,增產(chǎn)率為147.0%;較施氮135 kg/hm2處理的增產(chǎn)367.6 kg/hm2,增產(chǎn)率為9.9%[4]。

趙略等[5]研究了NBPT 對(duì)土壤中脲酶活性和細(xì)菌、放線菌生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,結(jié)果表明:NBPT 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.5%時(shí),對(duì)土壤中脲酶的活性影響較小;當(dāng)NBPT 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí),對(duì)氨的揮發(fā)抑制效果最顯著;低質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL)的NBPT 對(duì)細(xì)菌等菌種的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,但是中等質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度處理組表現(xiàn)出了菌種生長(zhǎng)受到抑制的現(xiàn)象;NBPT 對(duì)放線菌、細(xì)菌的產(chǎn)酶有非常明顯的抑制效果,最大抑制率分別為55.5%和67.2%。

當(dāng)前對(duì)脲酶抑制劑的研究,有些側(cè)重于農(nóng)作物的產(chǎn)量、土壤銨含量和氨揮發(fā)等方面,有些則側(cè)重于抑制劑的作用機(jī)制,結(jié)果都表明脲酶抑制劑在抑制尿素水解、提升氮肥利用率方面具有顯著效果。 脲酶抑制劑是化學(xué)試劑,存在生產(chǎn)成本高、價(jià)格高、田間降解能力弱、對(duì)作物有化學(xué)污染等缺點(diǎn),如HQ 不僅價(jià)格較貴,而且有毒,人食用5 g 即可致死,需慎重考慮其生物安全性。

脲酶抑制劑多為有機(jī)化合物,受環(huán)境影響較大,施用上具有一定的局限性,在選擇脲酶抑制劑時(shí),需了解土壤的狀況和周圍的環(huán)境情況。 因此,尋找一種既可起到抑制脲酶活性和尿素水解,又適用于大多數(shù)土壤,且對(duì)環(huán)境友好的化合物成為一種需求。

1 研究方法

1.1 脲酶晶體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:/ /www. rcsb. org)獲取4gy7 菜豆脲酶的晶體結(jié)構(gòu)。 利用PyMOL 軟件,保留蛋白的A 鏈和C 鏈,除去其他鏈和水分子。在AutoDock 4.2 軟件中,將準(zhǔn)備好的pdb 格式文件添加氫原子并對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行補(bǔ)齊,計(jì)算電荷,設(shè)置原子類型為Assign AD4 type。 利用PyMOL 軟件,從蛋白晶體復(fù)合物中提取出共晶配體,以該配體所在的雙鎳活性位點(diǎn)作為活性中心,打開pdb 格式文件,設(shè)置Grid 參數(shù),以蛋白的活性位點(diǎn)為中心;設(shè)置x=50、y=50、z=50,x、y、z分別表示在各方向上格點(diǎn)的數(shù)量;Spacing 設(shè)置為0.3×10-10m,設(shè)置完成后保存為grid. gpf 格式文件。

1.2 天然產(chǎn)物活性小分子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

通過(guò)ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)下載天然化合物,先使用ChemDraw 軟件繪制出單體化合物的結(jié)構(gòu),再用Caculations-MM2-Minimize Energy 模塊對(duì)小分子化合物進(jìn)行能量?jī)?yōu)化,并保存成mol2 格式。 在Autodock 軟件的Read Molecule 中,選擇mol 文件并打開后,導(dǎo)入配體小分子。 將mol2 格式批量轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式。

1.3 分子對(duì)接準(zhǔn)備

在AutoDockTools 中的Docking 模塊打開保存好的pdbqt 格式文件,定義配受體,Search Parameters 選擇遺傳算法(Genetic Algorithm),Number of GA Runs 設(shè)置為10,Maximum Number of Evals 設(shè)置為250 000,其他參數(shù)為默認(rèn),輸出文件保存為dock. dpf 格式文件,通過(guò)run AutoDock生成dlg 格式文件。 在AutoDockTools 的Analyze板塊中對(duì)dlg 格式文件進(jìn)行分析,保存最優(yōu)構(gòu)象后輸出pdb 格式文件。

1.4 相互作用能分析

將分子對(duì)接獲得的最佳分子構(gòu)象pdb 格式文件進(jìn)行MM-PBSA 分子間相互作用力分析,并與脲酶抑制劑NBPT 和HQ、(2-硝基苯基)-磷酸三酰胺(2-NPT)和ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)化合物等進(jìn)行分子間作用力評(píng)估,評(píng)估的結(jié)果以結(jié)合能數(shù)據(jù)表示。

2 模擬結(jié)果

2.1 脲酶晶體和小分子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

菜豆脲酶為三聚體蛋白質(zhì),晶體結(jié)構(gòu)去除水分子后,僅保存A、C 鏈,A、C 鏈各包含840 個(gè)氨基酸,菜豆脲酶的分子結(jié)構(gòu)見圖1,氨基酸序列見圖2。 活性中心根據(jù)原配體所在位置,刪除原有配體,選取原有配體及雙鎳活性中心9×10-10m范圍內(nèi)的腔體作為活性中心,見圖3。

圖1 菜豆脲酶的分子結(jié)構(gòu)

圖2 菜豆脲酶氨基酸序列

圖3 雙鎳活性中心

小分子配體準(zhǔn)備:經(jīng)ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)分析,累計(jì)下載9 617 個(gè)小分子,同時(shí)下載尿素、NBPT、HQ、2-NPT 的分子作為對(duì)照,所有小分子通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行能量最小化優(yōu)化。

2.2 配體半柔性分子對(duì)接

使用經(jīng)能量最小化優(yōu)化后的小分子與脲酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行半柔性分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,再經(jīng)MM-GBSA 進(jìn)行相互作用的結(jié)合能分析。 尿素、NBPT、HQ、2-NPT 與脲酶相互作用的平均結(jié)合能依次為30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol,見表1;作用的主要氨基酸及金屬催化中心為Ni1、Ni2、ALA A:440、ASP A:633、GLY A:550、HIS A:409、ALA A:636、KCX A:490、HIS A:492、HIS A:519、HIS A:593、ARG A:609、MET A:637、CME A:592 等,作用的類型主要為范德華力、氫鍵、金屬配位、電荷吸引力等,見圖4～7。

表1 尿素和常用脲酶抑制劑與脲酶相互作用的結(jié)合能kJ/mol

圖4 尿素與脲酶抑制劑作用情況分析

2.3 基于ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)的有效產(chǎn)物篩選

使用ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù),共下載9 617 個(gè)小分子,再經(jīng)Minimize Energy 處理,得到優(yōu)化后的小分子,賦予charmm 力場(chǎng)。 優(yōu)化后的小分子和脲酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)半柔性分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,獲得5 883 個(gè)小分子具有可能的結(jié)合能力;然后經(jīng)MM-GBSA 相互作用能分析,以平均結(jié)合能大于55 kJ/mol 的分子作為考察對(duì)象,見表2。

表2 平均結(jié)合能大于50 kJ/mol 的潛在化合物

圖5 NBPT 與脲酶抑制劑作用情況分析

圖6 2-NPT 與脲酶抑制劑作用情況分析

圖7 HQ 與脲酶抑制劑作用情況分析

3 討論

3.1 尿素、NBPT、HQ、2-NPT 分子對(duì)接

通過(guò)分子對(duì)接,結(jié)果顯示:尿素、NBPT、HQ、2-NPT 與脲酶相互作用的平均結(jié)合能依次為30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol,平均結(jié)合能數(shù)據(jù)表現(xiàn)為NBPT＞HQ＞2-NPT,NBPT 的效果最優(yōu)。徐麗萍等[6]的研究發(fā)現(xiàn),NBPT 能抑制酰胺態(tài)氮的水解,降低氨揮發(fā)量,其中在潮土中NBPT 的抑制作用最顯著,在紅壤中的抑制作用最弱,可能是因?yàn)镹BPT 在酸性土壤中的降解導(dǎo)致抑制效果減弱。 寧國(guó)輝等[7]發(fā)現(xiàn),NBPT 對(duì)于抑制尿素在土壤中的水解比HQ 或P-苯醌更有效。 HQ 對(duì)的揮發(fā)抑制作用最小,可能與其對(duì)硝化作用的抑制有關(guān),與土壤環(huán)境因素?zé)o關(guān)。 HQ 的作用不僅在于延緩尿素的水解和減少氨的揮發(fā),更重要的是影響了尿素水解產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的過(guò)程[8]。 2-NPT 作為新型脲酶抑制劑,具有較高的有效性,對(duì)脲酶的作用也具有耐久效應(yīng)[9]。 俄羅斯于2016 年發(fā)布了《采用高效液相色譜法測(cè)定尿素和含尿素肥料中的N-(2-硝基苯基)磷酸三酰胺(2-NPT)》的標(biāo)準(zhǔn),為后期的化合物設(shè)計(jì)提供了依據(jù),同時(shí)需嚴(yán)格規(guī)避化合物的毒理作用,避免對(duì)人或作物產(chǎn)生毒害作用,開發(fā)天然、環(huán)保、毒副作用小的脲酶抑制劑是環(huán)保、作物高效利用的關(guān)鍵。

3.2 新型脲酶抑制劑的虛擬篩選

ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)中共下載9 617 個(gè)小分子,經(jīng)Minimize Energy 處理得到優(yōu)化后的小分子,賦予charmm 力場(chǎng),通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化、MM-GBSA 分析,獲得5 883 個(gè)小分子與脲酶可能產(chǎn)生相互作用。 表2 中所示化合物平均結(jié)合能大于55 kJ/mol,優(yōu)于尿素、NBPT、HQ 的結(jié)合能,在相互作用能層面上具有較好的結(jié)果,結(jié)合的活性位點(diǎn)與DMPP、NBPT 等具有相同點(diǎn),可在后期針對(duì)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行深度的虛擬突變和化合物分子骨架延長(zhǎng)設(shè)計(jì)。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)脲酶晶體結(jié)構(gòu)、尿素與脲酶的結(jié)合以及NBPT、HQ 等常規(guī)脲酶抑制劑進(jìn)行分子對(duì)接處理,結(jié)果表明:NBPT 效果優(yōu)于HQ 和2-NPT,作為脲酶抑制劑可對(duì)尿素產(chǎn)生有效的競(jìng)爭(zhēng);對(duì)于ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中9 617 個(gè)篩選出的小分子,5 883 個(gè)小分子具有與脲酶相互作用的關(guān)系,其中平均結(jié)合能

基于分子對(duì)接尋找酶抑制劑的方法一直是新藥開發(fā)的重點(diǎn),中鹽安徽紅四方肥業(yè)股份有限公司通過(guò)與高校院所產(chǎn)學(xué)研合作,持續(xù)性地在肥料領(lǐng)域加強(qiáng)科研攻關(guān)力度,通過(guò)先進(jìn)的篩選方法,快速有效地提升脲酶抑制劑的篩選速度;通過(guò)開展實(shí)驗(yàn)室測(cè)定、田間試驗(yàn)示范,驗(yàn)證了不同增效劑在氮肥增效上的應(yīng)用價(jià)值。 后期將進(jìn)行相關(guān)理論數(shù)據(jù)的補(bǔ)充驗(yàn)證,尋找成本低、穩(wěn)定性好、自然環(huán)保的脲酶抑制劑,持續(xù)性地推進(jìn)脲酶抑制劑在氮肥增效上的應(yīng)用與開發(fā)。