絞股藍(lán)總苷對(duì)急性期缺血性腦卒中小鼠NF-κB及TNF-α表達(dá)的影響

解燕昭,楊梅柳,趙景茹,虞 武,董立朋,陳彥霞

(1. 河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051;2. 衡水學(xué)院,河北 衡水 053000;3. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,河北 石家莊 050000)

缺血性腦卒中是腦卒中最常見(jiàn)的類型,約占腦卒中總?cè)藬?shù)的80%[1]。存活的腦卒中患者多數(shù)存在不同程度的失語(yǔ)、運(yùn)動(dòng)障礙、卒中后抑郁、癡呆等后遺癥,且有25%～30%的患者會(huì)復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)者比首次患病者有更高的病死率及致殘率[2]。目前研究證實(shí),缺血性腦卒中發(fā)生后,神經(jīng)元以及血管內(nèi)的炎性細(xì)胞均可被激活并釋放炎癥因子及促炎因子,在閉塞的血管和缺血腦細(xì)胞中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)會(huì)進(jìn)一步引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致全身免疫反應(yīng),形成惡性循環(huán),加重腦組織損傷,影響預(yù)后[3]。核因子-κB(NF-κB)是炎癥反應(yīng)的樞紐,缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)NF-κB被激活,可促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達(dá),加重腦損傷的病理過(guò)程[4-5]。絞股藍(lán)皂苷是絞股藍(lán)的有效成分,其可減輕高原腦水腫小鼠的血腦屏障破壞,抑制NF-κB信號(hào)通路激活,具有很好的抗炎功效[6]。基于上述研究,本實(shí)驗(yàn)觀察了絞股藍(lán)總苷對(duì)缺血性腦卒中小鼠的腦保護(hù)作用及對(duì)NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響,旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57小鼠24只,體重23～26 g,10～12周齡,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SYXK(冀)2020-005。小鼠飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件:標(biāo)準(zhǔn)飼料,純凈水喂養(yǎng),12 h光照-黑暗循環(huán),室溫平均約24 ℃,實(shí)驗(yàn)遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑 絞股藍(lán)總苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo;兔抗鼠NF-кB單克隆抗體、兔抗鼠TNF-α購(gòu)自Abcam公司;β-actin抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司;Trizol RNA抽提試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;引物購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將24只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血性腦卒中組、絞股藍(lán)總苷低劑量組、絞股藍(lán)總苷高劑量組,每組6只。除假手術(shù)組外,其余組小鼠采用Longa線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈建立缺血性腦卒中模型[7]。具體方法:小鼠稱重后,應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,做頸部正中長(zhǎng)約1.5 cm切口,小心分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,頸總動(dòng)脈近心端置絲線備用,頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎,離斷,頸外動(dòng)脈的殘端插入線栓(假手術(shù)組不插入線栓),扭轉(zhuǎn)插至頸內(nèi)動(dòng)脈1 cm左右,有輕微阻力即到達(dá)大腦中動(dòng)脈開口,結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈,剪斷線栓,縫合,消毒切口。以左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失,倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲,行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈,右側(cè)出現(xiàn)霍納綜合征為缺血性腦卒中建模成功。術(shù)后2 h,絞股藍(lán)總苷低、高劑量組分別給予絞股藍(lán)總苷100 mg/kg、200 mg/kg腹腔注射,假手術(shù)組和缺血性腦卒中組均給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后24 h,采用單盲法對(duì)各組小鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):小鼠無(wú)神經(jīng)損傷癥狀記為0分,小鼠不能伸展對(duì)側(cè)前肢記為1分,小鼠側(cè)前肢屈曲記為2分,小鼠輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為3分,小鼠嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為4分,小鼠向?qū)?cè)跌倒記為5分。

1.4.2腦梗死體積 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)估結(jié)束后斷頭處死各組小鼠,連續(xù)等距冠狀切腦組織5片,浸入2% TTC染液,37 ℃下處理15 min,應(yīng)用4%多聚甲醛固定24 h,數(shù)碼相機(jī)拍照,Image J軟件分析圖像,紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織,蒼白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)腦組織,水腫修正后腦梗死體積占比=[總梗死體積-(梗死側(cè)半球體積-梗死對(duì)側(cè)半球體積)]/梗死對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.4.3腦組織中NF-κB及TNF-α表達(dá)情況經(jīng)神經(jīng)功能缺損評(píng)分及TTC染色篩選出絞股藍(lán)總苷的有效劑量為200 mg/kg,故不對(duì)絞股藍(lán)總苷低劑量組小鼠進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3.1NF-κB及TNF-α蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):冰上取小鼠梗死側(cè)腦組織,凍存于-80 ℃冰箱。取50 mg腦組織,加入適量裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑,剪碎后應(yīng)用組織研磨儀將組織充分勻漿,勻漿液加入抽提劑蛋白磷酸酶抑制劑,低溫離心后留存蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),10%的分離膠,5%的濃縮膠,濃縮膠凝固后垂直拔出梳子,然后將膠放入電泳槽,取總蛋白50 μg,等體積上樣緩沖液混合,變性低溫離心后小心加入加樣孔。濃縮膠80 V、分離膠100 V進(jìn)行電泳,電泳完畢后將膠剝離下來(lái)。切膠后,將濾紙、PVDF膜、膠及濾紙依次疊放,在轉(zhuǎn)膜緩沖液中將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,然后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中,室溫封閉2h,分別加入一抗、NF-κB(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),室溫振搖1 h后轉(zhuǎn)入4 ℃過(guò)夜。第2天TBST洗膜3次,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,隨后掃描成像,采用Image J軟件進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算。

1.4.3.2NF-κB及TNF-α mRNA表達(dá)情況 采用qRT-PCR法檢測(cè):取液氮凍存的小鼠梗死側(cè)腦組織50 mg,在預(yù)冷研缽中充分研磨后,置入1.5 mL離心管中, 加入Trizol試劑1 mL、氯仿0.2 mL,高速離心15 min,小心吸取上清液,與預(yù)冷的異丙醇充分混勻,冰上10 min后高速離心15 min,棄掉上清,75% DEPC乙醇洗滌沉淀后晾干,加水溶解,紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度;應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照說(shuō)明書于冰上配置反應(yīng)混合液,然后分裝到每個(gè)反應(yīng)管,加入RNA樣品,42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,cDNA稀釋至50 μL,qRT-PCR檢測(cè):95℃ 2min;95℃ 15s,60℃ 15s,72℃1 min;40個(gè)循環(huán)。引物序列:NF-κB上游引物序列為5’-CTGGCCTTTGAGTGCATCAC-3’,下游引物序列為5’-CGCTAACAACAATGTCCACCT-3’;TNF-α上游引物序列為5’-CAGATGGGCTGTACCTTATC-3’,下游引物序列為5’-GGTATGAAATGGCAAATCGG-3’;β-actin上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3,下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布計(jì)量資料比較采用方差分析,不符合正態(tài)分布計(jì)量資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分;缺血性腦卒中組、絞股藍(lán)總苷低劑量組、絞股藍(lán)總苷高劑量組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(3.15±0.93)分、(2.60±0.88)分、(2.00±0.97)分,絞股藍(lán)總苷低劑量組與缺血性腦卒中組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),絞股藍(lán)總苷高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于缺血性腦卒中組和絞股藍(lán)總苷低劑量組(P均<0.05)。

2.2各組小鼠腦梗死體積比較 絞股藍(lán)總苷低、高劑量組小鼠的腦梗死體積占比均明顯低于缺血性腦卒中組(P均<0.05),且絞股藍(lán)總苷高劑量組腦梗死體積占比明顯低于絞股藍(lán)總苷低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 缺血性腦卒中各組小鼠腦梗死情況

2.3各組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)情況比較 缺血性腦卒中組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),絞股藍(lán)總苷高劑量組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于缺血性腦卒中組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 缺血性腦卒中各組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)情況

2.4各組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 缺血性腦卒中組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),絞股藍(lán)總苷高劑量組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于缺血性腦卒中組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 缺血性腦卒中各組小鼠腦組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)情況

3 討 論

缺血性腦卒中發(fā)生后,局部血液供應(yīng)中斷會(huì)引起缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng),一方面缺血細(xì)胞可以釋放介質(zhì)激活先天免疫系統(tǒng)并啟動(dòng)炎性反應(yīng),導(dǎo)致全身免疫炎癥風(fēng)暴,產(chǎn)生的免疫介質(zhì)因血腦屏障的破壞而進(jìn)一步加重腦組織損傷[8-9];另一方面,腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中發(fā)生后幾分鐘內(nèi)即被激活[10],其中M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放TNF-α等多種促炎因子,并可通過(guò)多種信號(hào)通路如NF-κB通路而產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[11-14],加重神經(jīng)功能缺損。NF-κB是炎癥反應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子,參與多種促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo),如細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等[15]。有研究顯示,NF-κB的活性與腦卒中病情嚴(yán)重程度有關(guān),下調(diào)NF-κB的表達(dá)可以減輕腦水腫及神經(jīng)損傷,減少細(xì)胞凋亡,縮小梗死體積[16-17]。因此,影響NF-κB活性的因素都可能會(huì)調(diào)控缺血性腦卒中的炎癥過(guò)程,深入探討缺血性腦卒中后抗炎策略,有望為該病的治療提供新靶點(diǎn)。

絞股藍(lán)總苷可以雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其可降低巨噬細(xì)胞中TNF-α等促炎介質(zhì)的mRNA表達(dá),同時(shí)可降低TNF-α、IL-6水平,抑制NO產(chǎn)生[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)總苷可逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的膽固醇升高,通過(guò)LPS/TLR4信號(hào)通路改善非酒精性脂肪性肝病大鼠的脂質(zhì)代謝[19];還可通過(guò)抑制NF-κB、TNF-α的表達(dá),減少炎癥因子的釋放而減輕代謝性相關(guān)脂肪性肝病及腸黏膜組織損傷[20]。Yu等[21]報(bào)道,絞股藍(lán)總皂甙可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和保護(hù)線粒體功能而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。Xie等[22]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)皂苷XVⅡ可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和改善線粒體代謝功能而減輕腦缺血再灌注損傷。Cao等[23]研究報(bào)道,絞股藍(lán)總苷可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào),減少TNF-α等下游炎癥細(xì)胞因子的釋放,并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變。但對(duì)于缺血性腦卒中,絞股藍(lán)總苷是否可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型之間的轉(zhuǎn)換、降低炎癥反應(yīng)尚需進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)采用Longa線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈建立缺血性腦卒中模型,小鼠腦組織病理學(xué)改變與人類腦卒中相似。通過(guò)觀察神經(jīng)功能缺損評(píng)分和梗死體積,發(fā)現(xiàn)高劑量絞股藍(lán)總苷能明顯減輕小鼠神經(jīng)功能缺損,縮小梗死體積,有更好的腦保護(hù)作用;通過(guò)檢測(cè)腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總苷高劑量組NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯低于缺血性腦卒中組,提示絞股藍(lán)總苷可調(diào)節(jié)NF-κB和TNF-α表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述,絞股藍(lán)總苷可通過(guò)下調(diào)缺血性腦卒中小鼠腦組織中NF-κB和TNF-α表達(dá),改善炎癥微環(huán)境,減輕神經(jīng)功能障礙,縮小腦梗死體積,絞股藍(lán)總苷或可成為缺血性腦卒中的潛在治療藥物。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。