柴歸湯對(duì)高血壓小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2及腸道菌群的干預(yù)作用

朱紅俊 徐 辰 龔少愚 毛愛琴 周春剛 陸 曙

(1 無錫市中醫(yī)醫(yī)院,無錫,214000; 2 江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,無錫,214000)

原發(fā)性高血壓是臨床常見心血管疾病之一。我國(guó)成年居民的高血壓患病率達(dá)到27.9%[1]。在原發(fā)性高血壓的治療領(lǐng)域,中醫(yī)藥的臨床療效的提高尚需要?jiǎng)?chuàng)新思路與方藥。因此,我們基于五運(yùn)六氣理論將高血壓分為陽明型、太陽型、厥陰型3型,進(jìn)行分型治療,臨床療效顯著[2-4]。其中對(duì)脈象平弦的厥陰型高血壓采用柴歸湯治療,在降低舒張壓(Diastolic Blood Pressure,DBP)方面優(yōu)于厄貝沙坦或氨氯地平單藥治療[4]。但是,對(duì)柴歸湯干預(yù)高血壓的具體機(jī)制尚不清楚。我們通過高鹽誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型對(duì)柴歸湯的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)血漿及腎組織的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)水平,以及腸道菌群可能是柴歸湯對(duì)小鼠血壓水平的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取40只5周齡雄性C57BL6小鼠,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(合格證編號(hào):20170005022803),飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[許可證號(hào):SYXK(蘇)2017-0052]。動(dòng)物房環(huán)境清潔，通風(fēng)設(shè)備良好。溫度保持在20～25 ℃，相對(duì)濕度50%。所有小鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)，12 h燈光晝夜交替，飲食(普通標(biāo)準(zhǔn)飼料由江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)、飲水自由。高血壓小鼠飼養(yǎng)及模型建立、分組干預(yù)在江南大學(xué)完成，本研究經(jīng)動(dòng)物論述委員會(huì)批準(zhǔn)通過(倫理審查號(hào):JN.No20191230c1300630〔373〕)。

1.1.2 藥物 1)柴歸湯灌胃藥劑由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。柴歸湯由張仲景經(jīng)方小柴胡湯和當(dāng)歸芍藥散合方。小柴胡湯組成:“柴胡半斤,黃芩、人參、甘草、生姜各3兩,大棗12枚,半夏半升?！盵5]當(dāng)歸芍藥散組成:當(dāng)歸3兩,芍藥1斤,茯苓、白術(shù)各4兩,澤瀉半斤、川芎半斤[6]。根據(jù)我們臨床經(jīng)驗(yàn)及《中國(guó)老年高血壓管理指南2019》《中國(guó)高血壓防治指南(2018年修訂版)》,減去了甘草和大棗,人參用北沙參代替。參照《傷寒雜病論》合方時(shí)柴胡用量減半例,柴胡劑量由8兩減少到4兩。臨床常用經(jīng)方劑量換算以1兩=3 g、1兩=5 g、1兩=15 g最為多見[7]。因此,我們?nèi)「邉┝?兩=15 g進(jìn)行計(jì)算。最終柴歸湯處方組成與劑量:柴胡60 g(批號(hào):19123001)、北沙參45 g(批號(hào):20021401)、姜半夏40 g(批號(hào):20032101)、澤瀉120 g(批號(hào):2022201),從江蘇亞邦中藥飲片有限公司購(gòu)入;黃芩45 g(批號(hào):200301)、生姜45 g(市場(chǎng)鮮貨)、當(dāng)歸45 g(批號(hào):200323)、生白芍240 g(批號(hào):200418)、茯苓60 g(批號(hào):200404)、生白術(shù)60 g(批號(hào):200404)、川芎120 g(批號(hào):200316),從蘇州天靈中藥飲片有限公司購(gòu)入。全方由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制作成水煎劑。每劑煎成2袋,90 mL/袋。2)貝那普利(北京諾華制藥有限公司,批號(hào):X2872)由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供。采用生理鹽水配置成0.2 mg/mL溶液。3)8%NaCl高鹽飼料(南通特洛菲公司,貨號(hào):TP6032)。

1.1.3 試劑與儀器 Mouse ACE2 ELISA試劑(ABCAM公司,美國(guó),批號(hào):GR3326353-1);腎臟組織ACE2 ELISA試劑(RB公司,美國(guó),貨號(hào):DRE-M3394c);腎素ELISA試劑(RB公司,美國(guó),貨號(hào):DRE-M0560c)。無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(IITC Life Science公司,美國(guó),型號(hào):Mrbp-mmc);冷凍高速離心機(jī)(Thermo Fisher,美國(guó),型號(hào):Fresco 17);酶標(biāo)儀(Bio Tek Instruments,美國(guó),型號(hào):ELx800)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只C57BL6小鼠預(yù)適應(yīng)1周后,按照無特定病原體(Specefic Pathogen Free,SPF)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性飼養(yǎng),進(jìn)行標(biāo)號(hào)并分為對(duì)照組10只和高鹽組30只。其中對(duì)照組飼喂正常的飼料和水,高鹽組先喂高鹽飼料1個(gè)月,1個(gè)月之后3 d測(cè)1次血壓,檢測(cè)血壓達(dá)到高血壓標(biāo)準(zhǔn)后,開始通過尾壓法連續(xù)測(cè)血壓,觀察小鼠的血壓變化情況。當(dāng)小鼠收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)持續(xù)穩(wěn)定維持在130 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上時(shí),表明高血壓模型誘導(dǎo)成功。建模成功后,隨機(jī)抽取10只小鼠作為模型組。其他20只高血壓模型小鼠隨機(jī)分為貝那普利干預(yù)組(貝那普利組)、柴歸湯干預(yù)組(柴歸湯組)。

1.2.2 干預(yù)方法 柴歸湯組每只小鼠給予灌胃1次/d。按照人體標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg,換算后,每20 g體質(zhì)量小鼠給予灌胃柴歸湯0.5 mL。貝那普利組小鼠給予灌胃貝那普利0.2 mg/mL水溶液,1次/d,按照小鼠體質(zhì)量6 mg/kg給藥。干預(yù)期間,每周檢測(cè)1次血壓并記錄,連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)血壓異常指標(biāo):本研究通過尾壓法測(cè)量小鼠的SBP和DBP。使用了嚙齒動(dòng)物無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)。2)將小鼠腎臟組織存儲(chǔ)在-80 ℃冰箱中。檢測(cè)前,預(yù)先在低溫環(huán)境下各組小鼠均取1個(gè)完整腎臟組織,-80 ℃保存?zhèn)錂z。檢測(cè)時(shí),首先將全自動(dòng)快速研磨儀的模塊和研磨珠放置于-20 ℃冰箱中冷卻。將預(yù)先稱重好的小鼠腎臟和3粒研磨珠置于無RNA酶的2 mL離心管中,并加入預(yù)冷的1 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS),將該離心管置于預(yù)冷的模塊中并在研磨儀上固定。設(shè)置參數(shù)為1 500 r/min,運(yùn)行20 s,間隔10 s,重復(fù)3次,得到小鼠腎臟勻漿。然后于冷凍高速離心機(jī),12 000 r/min,離心半徑5 cm,離心20 min,取上清備用。3)血漿ACE2水平、腎臟組織腎素和ACE2水平:血漿ACE2水平、腎臟組織腎素和ACE2水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量。血清及組織勻漿酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)均在無錫市中醫(yī)院心血管疾病實(shí)驗(yàn)室采用酶標(biāo)儀測(cè)定。4)蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色觀察:腎臟組織HE染色委托本院病理科完成。5)腸道菌群檢測(cè)方法:腸道菌群豐度委托武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血壓情況比較 每周重復(fù)血壓測(cè)量顯示,隨著時(shí)間的變化,柴歸湯和貝那普利可持續(xù)穩(wěn)定降低小鼠SBP和DBP水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖1～2。

圖1 柴歸湯對(duì)高血壓小鼠收縮壓(SBP)的干預(yù)作用注:組間重復(fù)測(cè)量方差分析,F=25.266,P<0.001

圖2 柴歸湯對(duì)高血壓小鼠舒張壓(DBP)的干預(yù)作用注:組間重復(fù)測(cè)量方差分析,F=19.369,P<0.001

2.2 干預(yù)4周后各組小鼠血壓和血漿ACE2的水平比較 干預(yù)4周后,柴歸湯組、貝那普利組、對(duì)照組的SBP、DBP水平均顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。柴歸湯組、貝那普利組、對(duì)照組血壓水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較,模型組血漿ACE2水平顯著下降;貝那普利、柴歸湯則升高了高血壓小鼠降低的血漿ACE2水平,且貝那普利組血漿ACE2水平高于柴歸湯組;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。見表1。

表1 干預(yù)4周后各組小鼠血壓及血漿ACE2水平比較

2.3 各組小鼠的腎臟組織病理觀察和腎臟組織腎素、ACE2水平比較 各組小鼠的腎組織病理HE染色差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組、貝那普利組、柴歸湯組的腎臟組織腎素、ACE2水平及其比值均低于對(duì)照組;干預(yù)后柴歸湯組、貝那普利組的組織腎素、ACE2水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柴歸湯組和貝那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3,表2。

表2 各組小鼠腎組織腎素、ACE2水平及其比值的比較

圖3 各組小鼠的腎臟組織病理觀察比較(HE染色,×25)

2.4 腸道菌群16S分析 相對(duì)于對(duì)照組,高血壓組小鼠腸道Bacteroidia菌群豐度降低,而Clostridia菌群豐度升高。柴歸湯組和貝那普利干預(yù)后,高血壓小鼠降低的腸道Bacteroidia菌群豐度升高了,而升高的腸道Clostridia菌群豐度降低了。組間Beta多樣性分析(非加權(quán)UniFirac法),模型組和貝那普利組的菌群多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 腸道菌群豐度多樣性比較注:模型組和貝那普利組的菌群多樣性比較,P=0.026;Blank.對(duì)照組;NN.模型組;N.BNPL.貝那普利組;N.CGT.柴歸湯組

3 討論

厥陰型高血壓患者的脈象特點(diǎn)是弦而不沉,適合柴歸湯治療。通過超高效液相色譜與四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)柴歸湯的化學(xué)組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)行分析,我們確定了柴歸湯的174個(gè)功效成分[5]。但是,柴歸湯對(duì)高血壓的干預(yù)機(jī)制尚不清楚。

高血壓的動(dòng)物模型目前常用的有自發(fā)性高血壓大鼠模型,以及通過高鹽誘導(dǎo)、L-name誘導(dǎo)或血管緊張素2(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)誘導(dǎo)等建立的小鼠高血壓模型。本實(shí)驗(yàn)通過高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型,SBP保持在125～150 mm Hg、DBP保持在95～130 mm Hg,較好地模擬了高血壓的病理狀態(tài)。同時(shí),高鹽誘導(dǎo)的高血壓小鼠,血漿ACE2水平及腎組織的腎素/ACE2的比值顯著下降;且腸道Bacteroidia菌群豐度降低,而Clostridia菌群豐度升高。因此,高鹽誘導(dǎo)的高血壓小鼠,其血壓升高的機(jī)制和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone Aystem,RAAS)、腸道菌群紊亂等機(jī)制有關(guān),這與文獻(xiàn)[6-9]研究一致。

本文通過小柴胡湯和當(dāng)歸芍藥散的合方——柴歸湯對(duì)此模型進(jìn)行了干預(yù)。干預(yù)研究結(jié)果顯示,對(duì)于高鹽誘導(dǎo)的高血壓小鼠,柴歸湯可以穩(wěn)定降低SBP和DBP水平,干預(yù)4周的降壓效果與高劑量貝那普利(相當(dāng)于人40 mg/d)相當(dāng)。其作用機(jī)制和柴歸湯升高高血壓小鼠異常降低的血漿ACE2水平和腎組織的腎素/ACE2的比值、改善高血壓小鼠紊亂的腸道菌群豐度有關(guān)。而ACE2是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin System,RAS)重要組成部分,促進(jìn)血管緊張素(Angiotensin,Ang)(1-7)生成并結(jié)合mas受體舒張血管[10-11]、抗衰老[12]。通過ACE2-Ang(1-7)-Mas軸探討原發(fā)性高血壓中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)也是研究方向之一[13]。研究證實(shí),小柴胡湯可以降低高血壓患者的血壓[14-15],其主要活性成分與ACE2均有較強(qiáng)的結(jié)合力[16],當(dāng)歸芍藥散加味可以顯著提高左旋氨氯地平治療高血壓的療效[17],也顯著提高對(duì)妊高征的治療效果[18]。

本研究中,柴歸湯顯著升高了高血壓小鼠的血漿ACE2水平,提示干預(yù)RAS是柴歸湯治療高血壓的作用機(jī)制之一。而通過調(diào)節(jié)腸道菌群來發(fā)揮治療作用是中醫(yī)藥等天然藥物的治療方式之一。本研究提示,柴歸湯可以升高高血壓小鼠異常降低的腸道Bacteroidia菌群豐度,并降低異常升高的腸道Clostridia菌群豐度。因此,通過調(diào)節(jié)腸道菌群是柴歸湯降低小鼠血壓的另一個(gè)機(jī)制。但是,腸道菌群和ACE2之間的關(guān)聯(lián)尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,柴歸湯對(duì)高鹽誘導(dǎo)的高血壓小鼠具有良好的降血壓作用。其作用機(jī)制與升高血漿ACE2水平并調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。這在我們文獻(xiàn)查閱中未見有相關(guān)報(bào)道,將為研究五運(yùn)六氣理論和張機(jī)經(jīng)方治療高血壓的機(jī)制提供新思路。

利益沖突聲明:無。