落新婦苷的穩(wěn)定性及生物活性研究進(jìn)展

陳荷瑩 劉 毅 劉會(huì)珍 陳佳倩 金 晨 黃慧蓮

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌,330004)

落新婦苷具有“藥食同源”性,存在于很多自然界植物和食物中,如黃杞[1]、土茯苓[2]、龜苓膏[3]、葡萄酒[4]等,具有選擇性免疫抑制、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種生物活性。近年來,國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)其進(jìn)行了廣泛研究,本文將從落新婦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、純化技術(shù)、藥代動(dòng)力學(xué)、生物活性等方面進(jìn)行綜述,為深入研究提供依據(jù)。

1 化學(xué)結(jié)構(gòu)及其立體異構(gòu)體

落新婦苷,即(2R,3R)-花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷,是1950年由Kozo Hayashi等首次從植物落新婦中提取得到的化合物[5]。它也是土茯苓中主要有效成分,被2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》列為含量測(cè)定指標(biāo)。由于C-2、C-3的位置構(gòu)型不同,它有4個(gè)立體異構(gòu)體,分別是落新婦苷(2R,3R)、新落新婦苷(2S,3S)、新異落新婦苷(2S,3R)和異落新婦苷(2R,3S)。這4個(gè)立體異構(gòu)體通常都同時(shí)存在植物中,能夠通過中間體查爾酮相互轉(zhuǎn)化,其中落新婦苷是主要成分[6-7]。

2 穩(wěn)定性研究

黃酮類化合物通常有水溶性差、不穩(wěn)定等特點(diǎn)。MAINI等[8]使用高效液相色譜法和紫外檢測(cè)比較了高良姜素、山柰酚、槲皮素和楊梅素4種黃酮類化合物在培養(yǎng)基中通過紫外輻射后穩(wěn)定性的大小,結(jié)果表明黃酮醇的穩(wěn)定性會(huì)隨著B環(huán)上取代基數(shù)目的增加而降低。ZHANG等[9]、付瑩娟[10]也證實(shí)了這一結(jié)論:4′-羥基取代的B環(huán)的落新婦苷比3′,4′-二羥基取代的B環(huán)更穩(wěn)定。落新婦苷及其立體異構(gòu)體都不太穩(wěn)定,容易受到外界溫度、pH、金屬離子等因素的影響。pH和溫度能影響落新婦苷的異構(gòu)化和降解反應(yīng),pH值和溫度越高,異構(gòu)化和降解速度越快。落新婦苷在pH值為4～5、溫度為50 ℃以下的環(huán)境中比較穩(wěn)定,在中性、弱堿性溶液中以異構(gòu)化為主,分解速度較慢,當(dāng)pH>10時(shí),落新婦苷的分解速度變快[10-12]。當(dāng)溫度為25～40 ℃時(shí),落新婦苷異構(gòu)化成新異落新婦苷,異落新婦苷異構(gòu)化成新落新婦苷;在60～80 ℃時(shí),落新婦苷和新異落新婦苷都異構(gòu)化為新落新婦苷[13]。

落新婦苷的穩(wěn)定性會(huì)因其所溶解的溶劑不同而有差異,依次為50%乙醇>乙醇>甲醇>50%甲醇>水。它在不同的培養(yǎng)基中穩(wěn)定性也不一樣,依次為水>RPMI1640>高糖DMEM>低糖DMEM[10]。常見食品添加劑及金屬離子也能影響落新婦苷穩(wěn)定性:維生素C抗壞血酸和蔗糖可以抑制落新婦苷的分解,但是會(huì)促進(jìn)其異構(gòu)化;抗壞血酸對(duì)落新婦苷具有保護(hù)作用,但是也會(huì)加速其異構(gòu)化;常用防腐劑苯甲酸鈉無明顯影響;Mg2+、Ca2+、Na+、K+等金屬離子對(duì)落新婦苷有一定的增穩(wěn)作用;Al3+可以完全抑制落新婦苷異構(gòu)化,而對(duì)其分解沒有任何影響;Cu2+、Zn2+、Fe3+能夠加快落新婦苷分解,降低其穩(wěn)定性,其中Fe3+特別明顯[12,14]。

3 落新婦苷的純化技術(shù)

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography,HSCCC)是一種可行的分離黃酮類化合物的技術(shù)。FAN等[15]采用高速逆流色譜法,使用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10,v/v/v)組成的兩相溶劑體系,從菝葜提取物中純化落新婦苷、新異落新婦苷,其純度均大于98%。GUO等[16]提出了一種非傳統(tǒng)的高速逆流色譜法,能夠有效地從植物根莖中分離化合物。一種基于擠出模式的離線二維循環(huán)型高速逆流色譜(2D R-HSCCC)先將混合物收集于儲(chǔ)存柱中,循環(huán)分離最后采集得到純度大于96%的落新婦苷。WU等[17]建立了從土茯苓粗提物中分離和純化的高效離心分配色譜(Centrifugal Partition Chromatograph,CPC)法,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10)作為兩相溶劑系統(tǒng),獲得化合物純度為98.5%。

4 藥代動(dòng)力學(xué)研究

落新婦苷在體內(nèi)的代謝過程符合二室開放模型[18],具有水溶性差、口服吸收困難、生物利用度低的特點(diǎn)。研究人員給大鼠口服不同濃度的落新婦苷,采用液質(zhì)色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy,LC-MS/MS)測(cè)定大鼠血漿和各種組織樣品中落新婦苷的濃度,藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示12 mg/kg、24 mg/kg的落新婦苷給藥大鼠后,化合物生物利用度分別為(1.16±0.695)%和(1.27±0.379)%,血漿半衰期分別為(101±35.8)min和(109±25.3)min[19]。聚維酮和吐溫80結(jié)合使用可以顯著改善落新婦苷的吸收能力,提高口服生物利用度[20-21]。用玉米蛋白-酪蛋白酸納米顆粒包封落新婦苷可以提高化合物的口服生物利用度,用納米顆粒制備的落新婦苷能夠提高其穩(wěn)定性[22]。ZHAO等[23]用超高液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Ultra Performance Liquid Chromatography-quadrupole/Time Of Flight-mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)1中文錯(cuò)誤,2給出英文和英文縮寫分析落新婦苷在人體腸道細(xì)菌中的代謝物,檢測(cè)到細(xì)菌樣品中有槲皮素和圣草酚2種生物活性代謝物。

5 藥理學(xué)與毒理學(xué)研究

5.1 選擇性免疫抑制作用 正常的免疫反應(yīng)是機(jī)體維持自我平衡和抵御外來入侵的主要機(jī)制,而過度的免疫反應(yīng)則會(huì)引起各種自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。免疫抑制藥物通過抑制免疫反應(yīng)來治療相關(guān)疾病。然而免疫抑制治療大都受限于缺乏抗原特異性,這通常導(dǎo)致整個(gè)免疫系統(tǒng)功能的普遍抑制和各種不良反應(yīng)的發(fā)生[24-26]。落新婦苷具有獨(dú)特的免疫抑制模式,可以選擇性地消除參與某些特定疾病的淋巴細(xì)胞群而不降低機(jī)體的整體免疫活性,不同于環(huán)孢菌素A和其他免疫抑制劑。

落新婦苷能選擇性抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的效應(yīng)期而非誘導(dǎo)期,通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase2,MMP2)和MMP-9的活性選擇性抑制淋巴細(xì)胞功能,包括細(xì)胞遷移,從而抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的炎癥[27]。它還能影響Th1/Th2細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)平衡,選擇性地抑制活化的Th1細(xì)胞,而不影響Th2細(xì)胞。細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)控也是選擇性免疫抑制的重要機(jī)制。落新婦苷一方面通過抑制Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生,上調(diào)白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的下游蛋白、細(xì)胞因子信號(hào)傳送阻抑物1(Suppressor of Cytokine Signaling,SOCS)1和SOCS3;另一方面減少腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和γ-干擾素,在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)其接觸性超敏反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能[27-28]。與常用的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A相比,落新婦苷能選擇性抑制活化的T淋巴細(xì)胞,而對(duì)正常T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞無影響,不良反應(yīng)較弱,更有益于治療慢性免疫疾病。

此外,落新婦苷對(duì)樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)也有選擇作用。它通過抑制DC的成熟和抗原呈遞功能,阻止T細(xì)胞活化,從而抑制心臟同種異體移植物排斥反應(yīng)。當(dāng)落新婦苷與環(huán)孢菌素A共同給藥時(shí),顯著延長(zhǎng)了移植物的存活率,且呈劑量依賴性[29]。DING等[30]報(bào)道了落新婦苷能誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠DC中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)和IL-10的產(chǎn)生,在DC中內(nèi)源性TGF-β的產(chǎn)生促進(jìn)了CD4+、CD25+、叉頭框蛋白P(Forkhead Box P,Foxp)3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)以及CD103+的表達(dá),同時(shí)它還抑制DC分泌IL-1β、IL-12 p40和CD86+。因此,落新婦苷可以作為候選藥物通過誘導(dǎo)DC介導(dǎo)其調(diào)節(jié)功能來治療炎癥性腸病和其他炎癥性疾病,如多發(fā)性硬化、牛皮癬和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[31]。

5.2 抗氧化作用 類黃酮是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的重要化合物。它們具有在體內(nèi)螯合過渡金屬離子、清除自由基和誘導(dǎo)抗氧化酶的能力。因此,大多數(shù)類黃酮化合物都是有效的天然抗氧化劑。落新婦苷能有效清除2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical,DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]和超氧陰離子的自由基,抑制亞油酸過氧化。其效果與合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(Butyl hydroxyanisole,BHA)和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(Butylated hydroxytoluene,BHT)相當(dāng)[32]。落新婦苷能抑制超氧陰離子的生成,抑制細(xì)胞色素P450還原酶誘導(dǎo)的微粒體脂質(zhì)過氧化,保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化溶血[33]。PETACCI等[34]報(bào)道落新婦苷以濃度依賴性關(guān)系抑制髓過氧化物酶和辣根過氧化物酶活性,并有效清除次氯酸。類黃酮環(huán)中的取代模式可以增加或降低抗氧化活性,落新婦苷B環(huán)中的3′,4′-鄰二羥基構(gòu)型和C環(huán)中的4-羰基具有自由基清除活性。ZHANG等[35]利用落新婦苷的抗氧化作用來研究其對(duì)鎘毒性的拮抗作用,結(jié)果表明它可以通過氧化應(yīng)激緩解鎘誘導(dǎo)的鯉魚頭腎淋巴細(xì)胞的凋亡。

5.3 抗炎作用 炎癥反應(yīng)是機(jī)體一種重要的免疫防御機(jī)制。巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞,可參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程。脂多糖通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活巨噬細(xì)胞進(jìn)入炎癥狀態(tài),增加炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá),從而導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。HUANG等[36]研究發(fā)現(xiàn)落新婦苷對(duì)脂多糖刺激的小鼠巨噬細(xì)胞中Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLR)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白1和環(huán)氧化酶-2具有抑制作用。它還可以顯著抑制一氧化氮和TNF-α的產(chǎn)生,以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和TNF-α的mRNA表達(dá),這些作用可能與p65、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal Kinase)通路有關(guān)[37]。落新婦苷能抑制急性肺損傷大鼠的支氣管肺泡中炎癥介質(zhì)、趨化因子的產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞抑制因子的表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng)[38-39]。此外,落新婦苷還可以抑制膠原蛋白-Ⅰ和膠原蛋白-Ⅲ的表達(dá),降低了炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),有效改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷[40]。

Th17細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[41-42]。銀屑病俗稱牛皮癬,是免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病,其發(fā)病與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)有關(guān)[43]。落新婦苷可以通過抑制Th17相關(guān)的炎癥反應(yīng)來減輕牛皮癬樣皮膚損傷。落新婦苷可以改善咪喹莫特誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,減少CD3+細(xì)胞向牛皮癬病變組織的浸潤(rùn),并改善循環(huán)CD4+和CD8+T細(xì)胞和炎癥介質(zhì)(IL-17A,TNF-α,IL-6,IFN-γ和IL-2)的升高。在體外,落新婦苷抑制Th17細(xì)胞分化、IL-17分泌和Jak/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),同時(shí)上調(diào)牛皮癬病變中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription,STAT)3抑制劑SCOSE3的表達(dá)[44-45]。

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中,落新婦苷和低劑量氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)的聯(lián)合使用,會(huì)顯著抑制血清中的抗體(IgG,IgG1,IgG2a,IgM和抗膠原IgG)和炎癥介質(zhì)(IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ和IL-17A)的表達(dá)[46]。宋偉等[47]為了探討落新婦苷抗骨關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)落新婦苷可能直接作用于STAT1、STAT3、RAS等靶點(diǎn),通過影響AGE/RAGE信號(hào)通路,抑制TNF-α表達(dá)促進(jìn)CCND1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。李中華等[48]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)落新婦苷可以有效緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀,其原因可能與抗炎和軟骨機(jī)制降解有關(guān)。

NAKAHARA等[49]證實(shí)落新婦苷不僅可以增加Caco-2細(xì)胞的跨上皮電阻值、密封蛋白-1和緊密連接蛋白-2的mRNA表達(dá)水平以及密封蛋白-1和緊密連接蛋白-2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,而且還上調(diào)了與TNF-α加γ干擾素共同處理的Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)。其結(jié)果表明落新婦苷可以增強(qiáng)緊密連接蛋白的表達(dá),導(dǎo)致腸細(xì)胞中屏障功能的上調(diào),有效改善結(jié)腸炎。RAO等[50]研究發(fā)現(xiàn)落新婦苷作為膳食補(bǔ)充劑能夠抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠模仿外周感染的神經(jīng)炎癥。落新婦苷能有效減少LPS誘導(dǎo)小鼠的炎癥標(biāo)志物,同時(shí)抑制TLR-4和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)表達(dá),在預(yù)防老年人群急性精神障礙方面擁有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5.4 降血糖、血脂作用 晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是過量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物,能夠加速人體的衰老,引起各種慢性退化性疾病,比如糖尿病。落新婦苷能抑制AGEs的形成,其作用與槲皮素相同[51]。NGUYEN等[52]發(fā)現(xiàn)土茯苓乙酸乙酯提取物對(duì)體內(nèi)2型糖尿病模型的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性,可顯著降低糖尿病小鼠的血糖,并對(duì)肝臟無損害作用。糖尿病腎病是糖尿病患者最重要的并發(fā)癥之一。落新婦苷可以抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞產(chǎn)生TNF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,以及通過PI3K/AKT通路減弱高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬和凋亡來改善糖尿病腎病臨床病癥[53]。

落新婦苷可以通過激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)來抑制脂質(zhì)積累。激活的AMPK不僅可以通過抑制脂肪酸合成酶的活性來降低脂質(zhì)的生物合成,而且還可以提高脂肪三酰甘油脂肪酶的表達(dá),增加激素敏感脂肪酶的磷酸化,從而促進(jìn)脂解[54]。落新婦苷還能夠降低黏菌與擬桿菌的比例,通過增加有益細(xì)菌并減少有害細(xì)菌來改善高脂肪飲食小鼠誘導(dǎo)的腸道微生物生態(tài)失調(diào),從而增強(qiáng)腸道碳水化合物和脂質(zhì)代謝[55]。趙磊等[56]也證實(shí)了土茯苓中的類黃酮提取物能夠緩解肝細(xì)胞的變性程度,調(diào)節(jié)腸道中短鏈脂肪酸的含量,逆轉(zhuǎn)高脂肪飲食誘導(dǎo)的大鼠的腸道生態(tài)失調(diào)。

5.5 抗腫瘤作用 WANG等[57]利用落新婦苷在人前列腺癌細(xì)胞中測(cè)試發(fā)現(xiàn),落新婦苷具有潛在的抗增殖作用。其抗增殖的作用機(jī)制可能是對(duì)幾種信號(hào)通路的影響的組合,包括炎癥性核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路和一些增殖通路。落新婦苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞也表現(xiàn)出抗增殖作用和促凋亡作用[58]。SA等[59]發(fā)現(xiàn)落新婦苷能夠通過激活線粒體和半胱天冬酶來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B細(xì)胞凋亡,對(duì)肝癌的發(fā)生具有潛在的保護(hù)作用。

5.6 抗血管疾病作用 研究發(fā)現(xiàn),巴西特有物種古柯屬植物的提取物落新婦苷會(huì)顯著抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶,其活性與卡托普利沒有差異,具有潛在的抗高血壓作用[60]。落新婦苷可以改善糖尿病大鼠免受心肌缺血再灌注損傷,減少梗死面積,改善血流動(dòng)力學(xué),減輕心肌損傷,這些作用與糖尿病大鼠缺血心肌組織中炎癥介質(zhì)血清水平、高遷移率族蛋白B1、磷酸化核因子κB的降低相關(guān)。落新婦苷還可以直接刺激心臟血流動(dòng)力學(xué)并抑制心肌細(xì)胞壞死[61]。ZHAO等[62]報(bào)道了落新婦苷通過抑制平滑肌增殖,可以有效地防止同種異體移植中動(dòng)脈硬化的發(fā)生。另有研究報(bào)道落新婦苷的一些衍生物具有顯著的抗傷害性和抗生血管性質(zhì),但如果其衍生物連有糖、羥基和乙?；葮O性基團(tuán)存在時(shí)則會(huì)降低鎮(zhèn)痛活性[63]。

5.7 落新婦苷的細(xì)胞毒性檢驗(yàn) GAO等[64]研究發(fā)現(xiàn)口服不同劑量落新婦苷的大鼠與對(duì)照組的毒性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,未觀察到不良反應(yīng),各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)正常,用Ames試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)和哺乳動(dòng)物微核試驗(yàn)評(píng)估了落新婦苷的遺傳毒性,其結(jié)果顯示測(cè)試菌株都沒有遺傳毒性。該項(xiàng)研究結(jié)果表明,落新婦苷可以安全應(yīng)用,為開發(fā)天然藥物、功能性食品或食品添加劑提供了可能,為未來的臨床研究提供了重要保障。

6 總結(jié)

落新婦苷是二氫黃酮醇苷類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等多種生物活性,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。本文全面系統(tǒng)地總結(jié)了落新婦苷的活性成分研究并且首次對(duì)影響落新婦苷穩(wěn)定性因素進(jìn)行歸納概括,為日后新藥研發(fā)提供更多的參考依據(jù)。近年來,落新婦苷具有選擇性免疫抑制作用并且無口服毒性和遺傳毒性,這一天然優(yōu)勢(shì)引起了科研人員的高度關(guān)注,可能有望研發(fā)出新的免疫抑制藥物。

目前,有關(guān)落新婦苷的研究多集中于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn),臨床研究薄弱,再加上落新婦苷具有水溶性差、生物利用度低的特點(diǎn),尚未開發(fā)出相關(guān)藥物,使其不能很好發(fā)揮藥用價(jià)值。開發(fā)納米新劑型或選擇其他合適溶劑溶解或許是臨床研究的新方向。

利益沖突聲明:無。