臭蟲擊倒抗性基因突變檢測及抗性測定

李 婷,曹玉峰,王常祿,徐 業(yè),李偉軍,林 莉,Abdul Hafiz Ab Majid,王松灌,王建國*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學入侵生物實驗室,南昌 330045;2. Department of Entomology, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ 08901, USA; 3. Household and Structural Urban Entomology Laboratory, Vector Control Research Unit, School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, 11800 Minden, Penang, Malaysia; 4. Institute for Tropical Biology and Conservation, Universiti Malaysia Sabah, Jalan UMS, 88400 Kota Kinabalu, Sabah Malaysia)

在對擬除蟲菊酯和DDT具有抗性的昆蟲中發(fā)現(xiàn)一種常見的抗性機制,即電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel, VGSC)點突變介導的“擊倒抗性”(Knockdown resistance)(Daviesetal., 2007)。在我國,許多病媒昆蟲如白紋伊蚊Aedesalbopictus(朱彩英等, 2020)、埃及伊蚊Aedesaegypt(蘭學梅等, 2020)、三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus(姜進勇等, 2017)、中華按蚊Anophelessinensis(武松等, 2010)、淡色庫蚊Culexpipienspallens(宋鋒林等, 2005)和農(nóng)業(yè)昆蟲如小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(趙麗萍等, 2015)等都存在擊倒抗性基因突變。

近20多年來臭蟲(Cimexspp.)在世界范圍內(nèi)再次猖獗,化學防治是控制臭蟲的主要手段。擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有對害蟲擊倒速度快、對哺乳動物較安全的特性,在中國被廣泛用于臭蟲等衛(wèi)生害蟲的防治中(姜志寬和張桂林, 2007)。此外,一些有機磷農(nóng)藥也用于臭蟲防治,但其對哺乳動物具有高毒性,部分殺蟲劑在我國已被限制使用,如敵敵畏(馬世偉和劉小閃, 2014)。新煙堿類農(nóng)藥是常用的防治臭蟲效果較好的藥劑(Potteretal., 2015; Wangetal., 2016)。

隨著殺蟲劑的大量使用,臭蟲形成一套復雜的適應(yīng)性策略來克服殺蟲劑的影響(Yoonetal., 2008; Zhuetal., 2013)。臭蟲的抗藥性日益嚴重,成為了目前臭蟲防治過程中所面臨的主要問題之一(Wangetal., 2013)。在過去的幾年里,越來越多的研究證實kdr突變是導致臭蟲對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗藥性的機制之一(Yoonetal., 2008; Adelmanetal., 2011; Dangetal., 2015a, 2015b)。從采自紐約的溫帶臭蟲Cimexlectularius樣本(NY-BB種群)中檢測出首個kdr突變,纈氨酸到亮氨酸突變(V419L)和亮氨酸到異亮氨酸突變(L925I),并結(jié)合殺蟲劑生物測定,NY-BB種群的低死亡率證實了這些kdr突變賦予溫帶臭蟲對擬除蟲菊酯的抗性(Yoonetal., 2008)。在我國,溫帶臭蟲的kdr突變在2019年被首次報道(劉念等, 2019)。近年來,在非洲(Myambaetal., 2002)、斯里蘭卡(Karunaratneetal., 2007)、泰國(Tawatsinetal., 2011;Dangetal., 2015b)、澳大利亞、印度、馬來西亞(Dangetal., 2015b)和中國(Zhaoetal., 2020)等國家/地區(qū)均有關(guān)于熱帶臭蟲Cimexhemipterus擬除蟲菊酯抗性基因的報道。Dang等2015年研究發(fā)現(xiàn)在澳大利亞、泰國、印度、肯尼亞和馬來西亞采集的熱帶臭蟲樣本的VGSC基因中有6個突變位點,其中蛋氨酸到異亮氨酸突變位點(M918I)和亮氨酸到苯丙氨酸突變位點(L1014F)是主要的kdr突變位點,這一結(jié)果與其他昆蟲對擬除蟲菊酯抗性基因結(jié)果吻合(Williamsonetal., 1996;Rinkevichetal., 2013)。及時監(jiān)測臭蟲種群的敏感性、了解其耐藥機制,尤其是對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性機制,對臭蟲的有效防治具有重要意義。

傳統(tǒng)測定臭蟲或一個害蟲種群的抗藥性水平方法是使用點滴法得出致死中濃度(LD50)(Romeroetal., 2007; Zhaetal., 2017),該種方法耗時長,需要大量的活蟲才能確定敏感基線。在活蟲數(shù)量有限的情況下,可使用區(qū)分劑量測定1個種群是否產(chǎn)生了抗性(Romeroetal., 2007)。除了生測,kdr檢測也可提供臭蟲種群抗藥性水平檢測的一個輔助手段,分子檢測不局限于活蟲,適合用于采集樣本量少時使用。此外,溫帶臭蟲和熱帶臭蟲的kdr突變位點的發(fā)生與擬除蟲菊酯殺蟲劑之間的關(guān)系并未報道。本研究以我國8個臭蟲的地理種群作為實驗材料,對其中的2個溫帶臭蟲種群采用點滴法檢測了其對5種殺蟲劑的毒性及抗性水平,對2個溫帶臭蟲和2個熱帶臭蟲種群用區(qū)分劑量快速測定了臭蟲種群抗性,并用分子檢測kdr突變方法對表型抗性與kdr突變之間的關(guān)系進行分析。

1 材料與方法

1.1 臭蟲種群

實驗室內(nèi)飼養(yǎng)4個地理種群的臭蟲:溫帶臭蟲實驗種群(L-NJ)和野外種群(L-BJ),熱帶臭蟲野外種群(H-PY和H-SZa)。其中L-NJ種群,1980年在南京居民家中被發(fā)現(xiàn)后,一直飼養(yǎng)在南京市疾控中心,2009年徐承龍將其引種到中國疾控中心媒介生物實驗室,2020年由作者引種至江西農(nóng)業(yè)大學入侵生物實驗室;L-BJ種群于2019年6月采自北京市大興區(qū)某工廠員工宿舍,H-PY種群于2018年7月采自廣州市番禺區(qū)一家酒店的員工宿舍(Zhangetal., 2021),這兩個種群一直在華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲生態(tài)室飼養(yǎng),2019年9月由作者從華南農(nóng)業(yè)大學引種至江西農(nóng)業(yè)大學入侵生物實驗室;H-SZa種群于2020年7月采自深圳市一戶居民家內(nèi)。臭蟲種群在室內(nèi)用脫纖維羊血進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:熱帶臭蟲溫度28±1℃,溫帶臭蟲溫度25±1℃,相對濕度60%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h。在飼養(yǎng)過程中全部種群未接觸過任何殺蟲劑,其中L-NJ種群長達40年未接觸過殺蟲劑,判定為敏感種群(作為陰性對照)。此外,從野外4個地方采集了活臭蟲,用無水乙醇保存,帶回江西農(nóng)業(yè)大學入侵生物實驗室內(nèi)放置在-20℃的冰箱中長期保存,具體的采集信息見表1。所有臭蟲樣本均采用形態(tài)學和分子生物學方法進行種類鑒定(Usinger, 1966; 劉德星等, 2018; Lewisetal., 2020; Zhangetal., 2021)。

表1 臭蟲樣本的采集信息表Table 1 Bed bug samples used for molecular analysis

1.2 生物測定方法

1.2.1點滴法

選用雙酰胺類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類3類不同類型的5種殺蟲劑進行試驗,98%氯蟲苯甲酰胺(山東濰坊潤豐化工股份有限公司)、99%高效氯氰菊酯(山東大成生物化工有限公司)、98%呋蟲胺、95%吡蟲啉、98%噻蟲嗪(后3種殺蟲劑均由山東海利爾化工有限公司提供)和丙酮(分析純,東莞市昊豐化工有限公司)。通過微量進樣器(中國,生工生物工程(上海)股份有限公司)采用點滴法對2個地理種群的溫帶臭蟲(L-BJ, L-NJ)進行生物測定。試蟲為取食2周后的成蟲。通過預試驗確定濃度范圍,用丙酮稀釋5種原藥,各按等比稀釋配制成5個濃度。滴藥部位在臭蟲腹部第2～3對足中間,所有供試臭蟲點滴相對應(yīng)濃度的藥液量都為2 μL,每個濃度3個重復,每個重復10頭(9雄1雌),用丙酮作為對照。處理完后將其移到溫度為25±1℃、相對濕度60%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h的恒溫恒濕箱中,處理24、36、48和72 h后分別記錄臭蟲的死亡數(shù)量。臭蟲只有1只足動或者完全不動判定為死亡。

1.2.2區(qū)分劑量快速抗性鑒定方法

根據(jù)點滴測定結(jié)果,選用濃度為1 000 mg/L的99%高效氯氰菊酯(山東大成生物化工有限公司),采用點滴法對溫帶臭蟲L-NJ實驗室種群和L-BJ野外種群、熱帶臭蟲H-SZa和H-PY野外種群的抗藥性進行檢測。因為熱帶臭蟲沒有敏感種群,所以用L-NJ(溫帶臭蟲的實驗室種群)作為敏感對照。選用試蟲均為雄成蟲,每頭試蟲用藥量2 μL,4個重復,每個重復10頭,點滴處理后的試蟲放置在培養(yǎng)皿中觀察。1/6、2/6、3/6、4/6、5/6、1、2、3、4、5、6和24 h后分別記錄臭蟲死亡數(shù)量,每次記錄數(shù)據(jù)后將死亡個體分別放置在1.5 mL離心管中用無水乙醇保存,用于后續(xù)的DNA提取。試驗結(jié)束后,活著的個體也進行相同的處理。試驗環(huán)境同1.2.1。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件Probit對不同濃度藥劑試驗所統(tǒng)計的臭蟲死亡總數(shù)進行分析,估算各藥劑對臭蟲的LD50值。用溫帶臭蟲野外種群L-BJ的LD值除以溫帶臭蟲實驗室種群的LD值,求出各藥劑的相對抗性倍數(shù)(RR50)?？剐员稊?shù)劃分為低(1 25)(Leongetal., 2020)。

1.3 kdr抗性基因突變檢測方法

1.3.1DNA提取

對8個臭蟲地理種群保存的樣本(每個種群的具體檢測數(shù)量見表3)進行擊倒抗性基因突變的檢測。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒對單個標本進行總DNA的提取,提取后的DNA放置在-20℃冰箱保存,用于后續(xù)試驗。

1.3.2PCR擴增與測序

利用PCR儀對提取的DNA進行擴增,測定臭蟲鈉離子通道蛋白基因2個區(qū)域的kdr突變位點,特異性擴增所用引物為CHVG-SC-F: GGAATTGA AGCTGCCATGAAGTTG; CHVG-SC-R: TGCCTATT CTGTCGAAAGCCTCAG; BBpara-F: AACCTGGATA CATGCCTTCAAGG; BBpara-R: TGSTGGAGATTTT GCCACTGATG。利用引物分別擴增L925和V419位點(Dangetal., 2015; Zhaoetal., 2020),擴增反應(yīng)體系為25 μL,PCR反應(yīng)條件為:94℃預變性5 min(4 min);94℃變性1 min,46℃(50℃)復性1 min,72℃延伸2 min(75 s),共35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。將擴增好的序列送至安徽通用(股份)有限公司測序。使用反向引物作為2個區(qū)域的測序引物。

1.3.3序列分析

用ClustalW對序列進行比對,利用BioEdit和MEGA 7.0軟件進行分析。將測序后的檢測樣本VGSC基因與溫帶臭蟲敏感種群(FJ031996)和抗性種群(FJ031997)的基因序列進行對比,找出突變位點(Yoonetal., 2008)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種殺蟲劑對溫帶臭蟲的毒力作用

氯蟲苯甲酰胺、呋蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪和高效氯氰菊酯等5種藥劑對溫帶臭蟲敏感種群和野外種群的毒力測定結(jié)果如表2所示。新煙堿類的3種殺蟲劑效果明顯高于其他2種殺蟲劑。其中呋蟲胺和吡蟲啉的毒性最強,其次是噻蟲嗪,而氯蟲苯甲酰胺和高效氯氰菊酯的毒性最弱。LD50值表明,L-BJ種群對氯蟲苯甲酰胺和高效氯氰菊酯產(chǎn)生了低水平的(即LD50比率<5倍)抗性(表2),對呋蟲胺和吡蟲啉也有低抗性,對噻蟲嗪無明顯抗性。

表2 5種殺蟲劑對2個溫帶臭蟲地理種群的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 2 Susceptibility of the two strains of Cimex lectularius to five topically applied insecticides

2.2 區(qū)分劑量快速抗性鑒定結(jié)果

在抗性種群篩選研究中,發(fā)現(xiàn)溫帶臭蟲野外種群(L-BJ)對高效氯氰菊酯有明顯的抗性。在10 min內(nèi)高效氯氰菊酯對L-NJ種群(敏感種群)的致死率近50%,而L-BJ種群成蟲需約90 min達到50%死亡率,表明L-BJ種群對高效氯氰菊酯產(chǎn)生了中等抗性(即致死50%的時間與敏感種群比高于5)。熱帶臭蟲野外種群H-SZa和H-PY比溫帶臭蟲野外種群有更高的抗性,經(jīng)高效氯氰菊酯處理60 min后僅有3%的成蟲死亡,24 h后的致死率為34%(圖1)。

圖1 高效氯氰菊酯對4個臭蟲種群成蟲的致死率Fig.1 Mortality of two populations of Cimex lectularius (L-NJ, L-BJ)and two populations of Cimex hemipterus (H-SZ, H-PY) after exposure to beta-cypermethrin at different time points

2.3 kdr抗性基因突變分析

克隆了VGSC基因的2個基因片段,其中包含了與kdr型害蟲對擬除蟲菊酯抗性相關(guān)的kdr突變位點。其中溫帶臭蟲在第1個片段(約500 bp)發(fā)現(xiàn)了突變位點V419L,在第2個片段(約800 bp)檢測到突變位點L925I(圖2)。熱帶臭蟲種群在第1個片段中均未發(fā)現(xiàn)V419的位點堿基變化,在第2個片段中檢測到2個kdr突變,即M918I和L1014F。熱帶臭蟲的第2個片段中L925位點處發(fā)生了堿基T與C的顛換,但未導致氨基酸的變化(見圖3)。

圖2 溫帶臭蟲kdr基因突變序列分析Fig.2 Sequence analysis of kdr mutation in Cimex lectularius注:A,L-NJ種群;B,L-BJ種群;C,L-BJ種群。采用氨基酸位點(密碼子)的格式表示:V,纈氨酸;L,亮氨酸;I,異亮氨酸;A、C、T和G,為堿基代號。Note: A, L-NJ population; B, L-BJ population; C, L-BJ population. Format: Amino acid site (codon); V, Valine; L, Leucine; I, Isoleucine; A, C, T and G, The bases.

圖3 熱帶臭蟲kdr基因突變序列分析Fig.3 Sequence analysis of kdr mutation in Cimex hemipterus注:A,L-NJ種群;B,H-SZa種群、H-PY種群、H-GX種群、H-DGa種群、H-DGb種群、H-SZb種群。采用氨基酸位點(密碼子)的格式表示:L,亮氨酸;M,蛋氨酸;I,異亮氨酸;F,苯丙氨酸;A、C、T和G,為堿基代號。Note: A, L-NJ population; B, H-SZa population, H-PY population, H-GX population, H-DGa population, H-DGb population, H-SZb population. Format: Amino acid site (codon): L, Leucine; M, Methionine; I, Isoleucine; F, Phenylalanine; A, C, T and G, The bases.

2.4 不同地理種群kdr突變頻率

對8個種群的174個個體的2個VGSC基因片段進行PCR擴增。序列比對鑒定出4個突變位點,參照Zhu等(2012)年的單倍型分類,其中溫帶臭蟲的2個地理種群可分為2種類型:A-無突變位點,B-同時有L925I和V419L。南京(L-NJ)為A類型,北京(L-BJ)為B類型。熱帶臭蟲的6個野外種群(深圳(H-SZa、H-SZb)、番禺(H-PY)、廣西(H-GX)、東莞(H-DGa、H-DGb)只有1種C類型:均出現(xiàn)M918I和L1014F這兩個突變位點(表3)。

3 結(jié)論與討論

溫帶臭蟲野外種群(L-BJ)和實驗室種群(L-NJ)的致死中量和區(qū)分劑量快速抗性鑒定結(jié)果都表明:與L-NJ種群相比,L-BJ種群對擬除蟲菊酯殺蟲劑(高效氯氰菊酯)具有高抗性。熱帶臭蟲2個野外種群(H-SZa和H-PY)的區(qū)分劑量快速抗性鑒定結(jié)果顯示:H-SZa和H-PY種群對高效氯氰菊酯的抗性程度幾乎一致,具有比溫帶臭蟲野外種群更高抗性。對L-NJ、L-BJ、H-SZa和H-PY 4個種群收集的149個樣本進行kdr突變位點檢測發(fā)現(xiàn)溫帶臭蟲的L-NJ實驗室種群個體均未發(fā)生位點突變,L-BJ野外種群個體均發(fā)生L925I和V419L位點的kdr突變,而熱帶臭蟲的H-SZa和H-PY野外種群個體均發(fā)生M918I和L1014F位點的突變。因為V419L和L925I這2個kdr突變已經(jīng)被鑒定為溫帶臭蟲種群對溴氰菊酯高抗藥性的原因(Yoonetal., 2008; Zhuetal., 2010; Seongetal., 2010),而M918I和L1014F被鑒定為熱帶臭蟲中對擬除蟲菊酯殺蟲劑高抗性的原因(Dangetal., 2015)。所以kdr突變位點檢測結(jié)果表明L-BJ、H-SZa和H-PY 3個種群可能對擬除蟲菊酯殺蟲劑具有高抗藥性。結(jié)合這兩個檢測結(jié)果,表明變異位點與溫帶臭蟲及熱帶臭蟲對高效氯氰菊酯的敏感程度具有密切的關(guān)聯(lián),kdr基因突變檢測結(jié)果可以推測出該臭蟲種群是否存在擬除蟲菊酯抗藥性,但本研究只檢測了3個野外種群,需要對更多的野外種群做檢測才可以更準確的了解突變位存在與抗藥性的關(guān)系,進而對于消殺策略的制定提供指導。所檢測的7個野外種群都存在突變,說明我國臭蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗藥性已普遍存在。

基于本研究中的3個試驗結(jié)果,提出未來我國不同區(qū)域的臭蟲抗性治理策略:可以在臭蟲危害較為嚴重的地區(qū),如廣東省深圳市和東莞市加大對kdr基因突變的檢測力度,從而根據(jù)敏感性測定結(jié)果合理選擇滅殺臭蟲的策略,選用2種不同作用機制的殺蟲劑混合使用達到控制臭蟲種群的目的,結(jié)合高溫蒸汽、勤洗衣物用品等物理方法清除臭蟲,并進行全社區(qū)的統(tǒng)防統(tǒng)治,防止臭蟲再次感染;在臭蟲危害較輕的地區(qū),發(fā)現(xiàn)臭蟲后需要及時防治并對其進行定時監(jiān)測,加強居民對臭蟲的防范意識(王德森等, 2020)。

臭蟲除了kdr位點突變導致鈉離子通道敏感性降低這一抗藥性的機理外,還包括表皮穿透能力下降和代謝解毒能力提高(Daviesetal., 2007; Mamidalaetal., 2012; Koganemaruetal., 2013; Lillyetal., 2016),這些抗性機制在臭蟲的抗性種群中很可能同時存在。因此,kdr基因突變的檢測結(jié)果只能從一定程度上反映該地臭蟲種群對擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性水平,如果要全面的了解臭蟲種群的抗藥性水平不能僅局限于靶標抗性檢測,還應(yīng)該對代謝抗性和表皮穿透抗性進行研究。

本研究有助于全面了解臭蟲對溴氰菊酯高抗性的原因,為臭蟲防治提供理論基礎(chǔ)。為了進一步揭示臭蟲抗藥性的內(nèi)在機理,還應(yīng)當在以下方面進行深入探討,如我國不同地理種群的臭蟲耐藥性進行檢測,明確目前我國的臭蟲耐藥水平。此外,VGSC基因其他結(jié)構(gòu)域的突變也可能會影響到臭蟲對擬除蟲菊酯類藥物的抗性,在后續(xù)實驗中應(yīng)當對臭蟲VGSC基因的全長序列進行擴增和比較,以期檢測出新的kdr突變位點。

致謝：本文立意、實驗和稿件修改過程中得到邱星輝研究員、王德森博士等指導,一并致謝。