不同凍存方法對(duì)大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

王靜 劉洪利 潘福勤 唐亮

[摘要]目的：研究不同凍存方法對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）生物學(xué)特性的影響。方法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠腹股溝及附睪周?chē)闹窘M織，取第三代ADSCs凍存于液氮。實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組A組為非凍存細(xì)胞，B組使用無(wú)血清非程序凍存液凍存細(xì)胞，C組使用傳統(tǒng)凍存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）凍存細(xì)胞。12個(gè)月后復(fù)蘇ADSCs，通過(guò)對(duì)比ADSCs的表面抗原、細(xì)胞凋亡、增殖及成骨分化情況，分析各組ADSCs生物學(xué)性能的差異。結(jié)果：各組細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90；A、B兩組細(xì)胞的凋亡率顯著低于C組（P＜0.05）；B、C兩組的增殖情況和A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），B組細(xì)胞的成骨分化能力要優(yōu)于C組（P＜0.05）。結(jié)論：無(wú)血清非程序凍存液凍存ADSCs的效果要優(yōu)于傳統(tǒng)凍存液。

[關(guān)鍵詞]脂肪來(lái)源干細(xì)胞；低溫保存；凍存液；凋亡率；成骨分化

[中圖分類(lèi)號(hào)]R331? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）06-0108-04

Effects of Different Cryopreservation Methods on Biological Characteristics of Adipose Stem Cells in Rats

WANG Jing，LIU Hongli，PAN Fuqin，TANG Liang

（Cangzhou Medical College，Cangzhou 061000，Hebei，China）

Abstract： Objective? To study the effects of different cryopreservation methods on the biological characteristics of ADSCs. Methods? Tissue from groin and epididymis of SD rats was isolated and cultured invitro， the third passage cells were frozen in liquid nitrogen. The experiment was divided into three groups： control group A was non-cryopreservation cells， In group B， cells were cryopreserved with serum-free non-programmed cryopreservation method， The cells in group C were cryopreserved with conventional cryopreservation method （DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）. ADSCs were resuscitated after 12 months， Through contrast the surface antigen of ADSCs， cell apoptosis， cell proliferation assay and osteogenic differentiation results. To analyse the difference of ADSCs in each group. Results? CD29 and CD90 were highly expressed in each group.The apoptosis rate of cells in group A and B was significantly lower than that in group C（P＜0.05）.There was no significant difference in proliferation between group B and group C（P＞0.05）. The osteogenic differentiation ability of group B was better than that of group C（P＜0.05）. Conclusion? The effect of serum-free non-programmed cryopreservation method on ADSCs was better than that of conventional cryopreservation method.

Key words： adipose-derived stem cells; cryopreservation; cryoprotectants; apoptosis rate; osteogenic differentiation

ADSCs取材容易，具有自我增殖和多向分化潛能[1-2]，可通過(guò)分泌各種因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合[3]，在醫(yī)療美容中有重要作用。多項(xiàng)研究證實(shí)ADSCs與支架材料結(jié)合后，其成骨能力明顯提高[4-7]，有望成為骨組織工程理想的種子細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)的治療方面具有良好的臨床應(yīng)用前景[8]。隨著美容醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)ADSCs的需求量隨之越來(lái)越大。目前，低溫冷凍是細(xì)胞長(zhǎng)期保存的常用方法，一方面可降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)，另一方面能減少細(xì)胞因傳代而引起的遺傳變異，避免細(xì)胞衰老。然而，在細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程產(chǎn)生的低溫?fù)p傷會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、代謝途徑及活性產(chǎn)生極大影響，因此需要找到一種適宜的凍存方法，使低溫冷凍細(xì)胞的活性可以接近正常水平，從而降低細(xì)胞凍存凋亡率。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：雄性SD大鼠，購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)中心；L-DMEM、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清FBS（Gibco，美國(guó)）、細(xì)胞凍存液（普諾賽，中國(guó)）、Annexin V APC凋亡檢測(cè)試劑盒（BioGems，美國(guó)）、CCK-8（博士德，中國(guó)）；單克隆抗體CD29、CD90（Abcam，美國(guó)）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國(guó)）；茜素紅染色試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)）；OCN、RUN-2單克隆抗體（Thermo，美國(guó)）；DMSO、地塞米松、β-磷酸甘油鈉、抗壞血酸、維生素D3（Sigma，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠ADSCs的提取：無(wú)菌條件下從SD大鼠腹股溝及附睪周?chē)蛛x脂肪組織，PBS沖洗2次，去掉肉眼可見(jiàn)的結(jié)締組織，眼科剪剪成漿糊狀，用2倍體積的I型膠酶37℃消化60 min，終止消化后200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心10 min，DMEM重懸細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞的凍存與分組：①A組取正常培養(yǎng)的第4～6代ADSCs；②B組取第3～5代ADSCs，胰酶消化后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，加入無(wú)血清非程序凍存液，裝入凍存管。-80℃冰箱過(guò)夜，24 h之后轉(zhuǎn)入液氮；③C組取第3～5代ADSCs，胰酶消化后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，加入凍存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1），裝入凍存管，4℃冰箱30 min，-20℃冰箱2 h，-80℃冰箱過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮。

1.2.3 大鼠ADSCs的復(fù)蘇：凍存12個(gè)月后，從液氮中將ADSCs取出，立即放入37℃水浴箱，振蕩使其快速融化，向凍存管中加入少量培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% FBS的DMEM，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 大鼠ADSCs的鑒定：取復(fù)蘇的ADSCs，胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×l08/L，每管加入200 ?l細(xì)胞懸液，5 ?l CD29抗體、2 ?l CD90抗體，冰上避光孵育30 min，PBS沖洗2次后重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 大鼠ADSCs的凋亡：染色緩沖液清洗細(xì)胞2次，1×106/ml的細(xì)胞濃度重懸細(xì)胞，100 ?l細(xì)胞懸液中加入5 ?l的Annexin V共軛物，5 ?l 7-AAD溶液，混勻細(xì)胞，25℃避光孵育15 min，加入400 ?l Annexin V結(jié)合緩沖液，采用凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 大鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)：將細(xì)胞接種到６孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10% FBS的DMEM+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-磷酸甘油鈉+0.05 g/L抗壞血酸）進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔2 d換液１次。

1.2.7 大鼠ADSCs的增殖情況：CCK-8法測(cè)定成骨誘導(dǎo)后各組ADSCs的增殖水平，分別在成骨誘導(dǎo)第1、3、5、7、9 d時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×1010/L，取100 ?l細(xì)胞懸液移入96孔板，每孔加10 ?l CCK-8培養(yǎng)基，孵育1.5 h，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm下的OD值。

1.2.8 ALP染色和茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)7 d后，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞2 min，PBS清洗后用TBST潤(rùn)洗并浸泡，棄去TBST，每孔加入ALP染色試劑500μl，室溫下避光孵育10～15 min，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。成骨誘導(dǎo)14 d后，4℃，4%多聚甲醛，固定細(xì)胞25 min，PBS清洗，40 mmol/L茜素紅（pH 4.1）室溫染色20 min，觀察拍照。

1.2.9 免疫熒光染色：免疫熒光染色觀察OCN、RUNX2的蛋白表達(dá)情況，成骨誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛，室溫孵育細(xì)胞25 min，PBS清洗3次，每次5 min，0.5% Triton X-100室溫通透膜細(xì)胞15 min，PBS清洗3次，5%BSA室溫封閉1 h，PBS清洗，分別加入一抗OCN（1∶100）和RUNX2（1∶100），孵育細(xì)胞并4℃過(guò)夜，第2天，PBS清洗3次，避光孵育二抗（1∶50）1 h，DAPI染色15 min，共聚焦顯微鏡觀察。

2? 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs的表面抗原：凍存組ADSCs復(fù)蘇后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs的表面特異性標(biāo)記物，結(jié)果顯示B、C組CD29和CD90的共同陽(yáng)性表達(dá)率分別為97.85%、97.45%，與未凍存組A組（98.74%）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明凍存復(fù)蘇對(duì)ADSCs表面抗原無(wú)明顯影響，細(xì)胞并未因凍存而發(fā)生變異。見(jiàn)圖1。

2.2 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ADSCs的凋亡情況：凍存組ADSCs復(fù)蘇后，用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ADSCs的凋亡情況，其中各組細(xì)胞的凋亡率分別為2.41%、2.54%和5.53%，C組ADSCs的凋亡率明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而無(wú)血清非程序凍存液B組和未凍存組A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 CCK-8測(cè)定ADSCs的增殖活性：CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力，前2 d細(xì)胞的生長(zhǎng)處于滯留期，之后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)迅速。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)，因接觸抑制導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)抑制階段，生長(zhǎng)曲線呈“S”形。凍存組（B組、C組）細(xì)胞在第7天后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，而未凍存組A組細(xì)胞在第9天時(shí)活性依然較高，其中凍存組B、C組細(xì)胞的增殖能力與未凍存組A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但B組更接近未凍存組。見(jiàn)圖3。

2.4 ALP染色和茜素紅染色評(píng)估ADSCs的成骨分化能力：細(xì)胞成骨能力隨ALP含量的增加而呈遞增趨勢(shì)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后ALP染色結(jié)果見(jiàn)圖4，A、B組細(xì)胞內(nèi)ALP染色基本持平，C組細(xì)胞ALP染色明顯降低。成骨誘導(dǎo)14 d后茜素紅染色結(jié)果見(jiàn)圖5，與A、B兩組相比，C組細(xì)胞內(nèi)茜素紅染色顯著降低，這可能和細(xì)胞的凋亡率增加導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。見(jiàn)圖4～5。

2.5 免疫熒光檢測(cè)OCN、RUNX2的表達(dá)：用免疫熒光染色檢測(cè)特定成骨蛋白OCN，RUNX2在ADSCs的蛋白表達(dá)。A組與B組OCN熒光強(qiáng)度相近，且細(xì)胞數(shù)量較多。而C組OCN的熒光強(qiáng)度稍低，細(xì)胞數(shù)量較少。RUNX2免疫熒光染色圖像和OCN顯示同樣的結(jié)果。見(jiàn)圖6。

3? 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨及軟骨再生、創(chuàng)面愈合、改善瘢痕等方面有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛能[9]，ADSCs屬于多能間充質(zhì)干細(xì)胞，除了能分泌多種生物活性因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移進(jìn)而加速血管生成外，還可以通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸促進(jìn)相鄰組織細(xì)胞的增殖和遷移[10]。ADSCs能貼附支架材料生長(zhǎng)，并在特定條件下（添加成骨誘導(dǎo)液）定向成骨分化，于體內(nèi)、體外均具良好的成骨效應(yīng)[11-13]，是骨組織工程的理想選擇。然而體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)傳代，會(huì)使細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，影響細(xì)胞功能。低溫凍存是長(zhǎng)期保存細(xì)胞的有效方法，可彌補(bǔ)以上不足。

低溫凍存和復(fù)蘇的過(guò)程，可對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生致死性的破壞，因此需加入冷凍保護(hù)劑。目前最常用的細(xì)胞凍存液是DMSO結(jié)合一定濃度的FBS溶液。DMSO是一種滲透性保護(hù)劑，但有一定的毒性，長(zhǎng)期保存會(huì)增加細(xì)胞死亡率。血清中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)整細(xì)胞內(nèi)滲透壓，減少凍存和儲(chǔ)存中活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害[14]。但價(jià)格昂貴，且血清所含促細(xì)胞因子及活性物質(zhì)的比例不同，凍存效果不一。因此，本研究應(yīng)用了一種無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液。

該凍存液中添加了細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑，可延緩細(xì)胞在凍存過(guò)程中的沉降速率，防止細(xì)胞互相擠壓，影響凍存效果。另外，添加了細(xì)胞膜保護(hù)劑、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑、非滲透性細(xì)胞保護(hù)劑等多種冷凍保護(hù)劑，這些成分在溶液中同水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過(guò)程使溶液的黏性增加從而減少冰晶的形成，能大大降低細(xì)胞在凍存過(guò)程中冰晶對(duì)于細(xì)胞的損傷，有效提高細(xì)胞復(fù)蘇存活率。

該凍存液凍存步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需將細(xì)胞多次轉(zhuǎn)移后再投入液氮中，減少了每次轉(zhuǎn)移過(guò)程中由于溫度急劇變化而造成的細(xì)胞損傷。譚菊等[15]研究發(fā)現(xiàn)鼠胚成纖維細(xì)胞系（STO）細(xì)胞于-70℃冰箱中平衡過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移至液氮中超低溫冷凍是較為理想的保存方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)低溫冷凍后細(xì)胞的均能成功地復(fù)蘇，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)ADSCs相關(guān)的表面抗原CD29、CD90，說(shuō)明細(xì)胞仍保留ADSCs表面抗原的特性，具有低免疫原性。凋亡實(shí)驗(yàn)表明無(wú)血清非程序凍存液B組和對(duì)照組A組凋亡率接近，顯著低于C組。其原因主要在于B組在保存過(guò)程中降溫相對(duì)穩(wěn)定，且包含多種冷凍保護(hù)劑。

本實(shí)驗(yàn)從經(jīng)濟(jì)、合理性考慮，建立了一種較為適合ADSCs的凍存方法，為ADSCs的長(zhǎng)期存儲(chǔ)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為ADSCs在骨組織工程、口腔頜面部疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Post Y，Clevers H.Defining adult stem cell function at its simplest：the ability to replace lost cells through mitosis[J].Cell Stem Cell，2019，25（2）：174-183.

[2]Ho T T，Warr M R，Adelman E R.Autophagy maintains the metabolism and function of young and old stem cells[J].Nature，2017，543（7644）：205-210.

[3]Galipeau J，Sensebe L.Mesenchymal stromal cells：Clinical challenges and therapeutic opportunities[J].Cell Stem Cell，2018，22（6）：824-833.

[4]Liu C，Dong J Y，Yue L L，et al.Rapamycin/sodium hyaluronate binding on nano-hydroxyapatite coated titanium surface improves MC3T3-E1 osteogenesis[J].PLOS One，2017，12（2）：1-13.

[5]Toosi S，Naderi-Meshkin H，Kalalinia F，et al.Bone defect healing is induced by collagen sponge/ polyglycolic acid[J].J Mater Sci Mater Med，2019，30（3）：1-10.

[6]Ko E，Lee J S，Kim H，et al.Electrospun silk fibroin nanofibrous scaffolds with two-stage hydroxyapatite functionalization for enhancing the osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells[J].ACS Appl Mater Interfaces，2018，10（9）：

7614-7625.

[7]Liao H T，Tsai M J，Brahmayya M，et al.Bone regeneration using adipose-derived stem cells in injectable thermo-gelling hydrogel scaffold containing platelet-rich plasma and biphasic calcium phosphate[J].Int J Mol Sci，2018，19（2537）：1-18.

[8]Rigato M，F(xiàn)adini G P.Circulating stem/progenitor cells as prognostic biomarkers in macro-and microvascular disease：a narrative review of prospective observational studies[J].Curr Med Chem，2018，25（35）：4507-4517.

[9]李嘉欣，陳偉華.脂肪來(lái)源干細(xì)胞在改善老化皮膚質(zhì)地中的作用及其臨床應(yīng)用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（5）：187-189.

[10]王彤，劉毅.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2022，31（2）：172-177.

[11]Rad M R，Bohloli M，Rahnama M A，et al.Impact of tissue harvesting sites on the cellular behaviors of adipose-derived stem cells：implication for bone tissue engineering[J].Stem Cells Int，2017，2017（6）：2156478.

[12]Alluri R，Jakus A，Bougioukli S，et al.3D printed hyperelastic "bone" scaffolds and regional gene therapy：A novel approach to bone healing[J].J Biomed Mater Res A，2018，106（4）：1104-1110.

[13]Park S，Heo H A，Lee K B，et al.Improved bone regeneration with multiporous plga scaffold and bmp-2-transduced human adipose-derived stem cells by cell- permeable peptide[J].Implant Dent，2017，26（1）：4-11.

[14]游小燕，何琦琳，劉雪芹，等.一種無(wú)血清凍存液在豬胎兒成纖維細(xì)胞上的應(yīng)用研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2019，38（1）：69-73.

[15]譚菊，武彩紅，文潮潮，等.不同方法對(duì)STO細(xì)胞凍存效果的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（23）：130-132.

[收稿時(shí)間]2022-5-13

本文引用格式：王靜，劉洪利，潘福勤，等.不同凍存方法對(duì)大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（6）：104-111.