基于HPLC-Q-Orbitrap-MSn的血三七化學(xué)成分分析

嚴(yán)晟 李漓 黃晨存 趙元 許光明

〔摘要〕 目的 鑒定血三七藥材的化學(xué)成分。方法 采用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術(shù)分析及鑒定血三七中的化學(xué)成分。色譜條件：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脫，柱溫30 °C，流速1 mL/min，波長280 nm，進(jìn)樣體積5 μL。質(zhì)譜條件：加熱電噴霧電離源（HESI）;正、負(fù)離子檢測模式;鞘氣60 mL/min;輔助氣體流量20 mL/min;噴霧電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度380 ℃;輔助氣加熱器溫度380 ℃;掃描模式：FuLL MS/dd-MS2，F(xiàn)uLL MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500;掃描范圍m/z 100～1200;碰撞能量為30 eV。數(shù)據(jù)庫、對照品及相關(guān)文獻(xiàn)比對質(zhì)譜信息，分析化學(xué)元素組成和裂解途徑，推斷化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 鑒定了33種化合物，包括9種酚酸類、6種黃酮類、10種香豆素類、7種苷類和其他類成分1種。結(jié)論 從血三七中首次發(fā)現(xiàn)了24個(gè)化合物，其中1個(gè)成分為潛在的新巖白菜素類化合物。

〔關(guān)鍵詞〕 血三七;高效液相色譜;四級桿軌道阱高分辨質(zhì)譜;鑒定;化學(xué)成分

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.012

〔Abstract〕 Objective To identify the chemical composition of Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）. Methods High-resolution mass spectrometry （HPLC-Q-Orbitrap-MSn） technology was used to identify the chemical composition in Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）. Chromatographic conditions were as follows： the column was C18 column [Shimadzu， DiamondiL （250 mm × 4.6 mm × 5 μm）]; the mobile phase was 0.1% formic acid water-methanol for gradient elution; the column temperature was 30 ℃; the flow rate was 1 mL/min; the wavelength was 280 nm， and the sample volume was 5 μL. Mass spectrometry conditions were established： heated electrospray ionization source （HESI）; positive and negative ion detection mode; sheath gas （60 mL/min）; auxiliary gas flow （20 mL/min）; spray voltage （3.5 kV）; capillary temperature （380 ℃）; auxiliary gas heater temperature （380 ℃）. Samples were analyzed in two scan modes： Full MS （resolution： 70000） and dd-MS2 （resolution： 17500）， with can range of m/z100～1200 and collision energy of 30eV. Database， control articles and related literature were used to compare MS spectrometry information， and the chemical element composition and cleavage pathways were analyzed to infer the chemical structure. Results A total of 33 compounds were identified， including 9 phenolic acids， 6 flavonoids， 10 coumarins， 7 glycosides， and 1 other component. Conclusion A total of 24 compounds were first identified from Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）， one of these components is a potential new rock cabbage compound.

〔Keywords〕 Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）; high performance liquid chromatography; quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry; identification; chemical composition

血三七，蓼科植物中華抱莖蓼（Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）的根莖，分布于湖北、湖南和陜西等地，具有行氣活血、止血生肌、清熱解毒等功效，可治療胃脘痛、痛經(jīng)、崩漏等癥狀，主要作用是散瘀止血、活血止痛[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血三七具有抗動脈粥樣硬化[2]、抗血栓[3]、抗炎[4]、抗真菌[5]、抗氧化[6]等藥理作用。

血三七藥理作用廣泛，化學(xué)成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。多項(xiàng)研究[7-12]表明從石油醚、正丁醇和乙酸乙酯部位發(fā)現(xiàn)主要化學(xué)成分包括黃酮類、酚酸類、機(jī)酸類、香豆素類和蒽醌類等化合物。研究發(fā)現(xiàn)類黃酮[13]具有抗氧化、清除自由基、擴(kuò)張血管、增加血流量以及改善心腦血管循環(huán)等作用，沒食子酸[14]具有抗病毒、消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化作用;綠原酸[15]具有抗病毒和抗菌作用。但是，目前對血三七活性成分的具體研究還有所欠缺，隨著對血三七藥理活性不斷深入研究，全面和快速鑒定其化學(xué)成分成為亟待解決的問題。

中醫(yī)藥是中華民族的寶庫，但中藥成分成千上萬且含量較低，定性分析需提供準(zhǔn)確、可靠且豐富的化合物信息;Orbitrap高分辨質(zhì)譜在中藥組分分析中具有較高的靈敏度和掃描速度，可對痕量組分進(jìn)行分析，其獨(dú)特的優(yōu)勢在中藥組分分析中發(fā)揮日益重要的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術(shù)，快速鑒定了血三七中的化學(xué)成分，為血三七的質(zhì)量控制和藥效研究提供了物質(zhì)研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)藥材

血三七藥材（安徽亳州，湖南振興中藥有限公司，批號為190920），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周小江教授鑒定為蓼科屬植物中華抱莖蓼的根莖。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

沒食子酸（批號：DSTDM000801）、阿魏酸（批號：DSTDF008102）、表兒茶素（批號：DSTDB003501）均購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。甲醇為色譜純;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

Q-ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司）;YM-020S超聲波清洗機(jī)（深圳市方奧微電子有限公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;DFD-700智能儀表恒溫水浴鍋（上海錦錨工業(yè)科技有限公司）;T-214電子天平（美國丹佛儀器公司）;H1850高速離心機(jī)（湘儀儀器有限公司）;GN-0005超純水儀（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1? 供試品溶液的制備

精密稱定血三七粉末1.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，靜置2 h，回流提取1 h，取1 mL溶液，甲醇稀釋。置于進(jìn)樣小瓶中，待測。

2.2? 對照品溶液的制備

分別精密稱定各對照品2.0 mg，甲醇溶液定容，制成40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，即得。

2.3? HPLC-ESI-MS條件

色譜柱為C18柱（日本島津，DiamondiL系列，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為A（0.1%甲酸水）-B（甲醇），洗脫條件：0～5 min，5%～18% B;5～14 min，18%～24% B;14～19 min，24%～24% B;19～34 min，24%～46%B;34～40 min，46%～64% B;40～50 min，64%～95% B。柱溫30 °C，流速1 mL/min，波長280 nm，進(jìn)樣體積5 μL。

離子源：加熱電噴霧電離源（ESI）;正、負(fù)離子檢測模式;鞘氣60 mL/min;輔助氣體流量20 mL/min;噴霧電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度380 ℃;輔助氣加熱器溫度380 ℃;掃描模式：FuLL MS/dd-MS2，F(xiàn)uLL MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500;掃描范圍m/z 100～1200;碰撞能量為30 eV。

3 結(jié)果

3.1? HPLC-MS/MS分析結(jié)果

按照“2.3”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件，進(jìn)行分析，樣品總離子圖如圖1。

3.2? 結(jié)構(gòu)鑒定

XcaLibur軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0軟件進(jìn)行峰提取和歸一化;質(zhì)量偏差<10 ppm（1 ppm=1×10-6），化合物推測通過檢索HMDB數(shù)據(jù)庫及標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行指認(rèn)，從血三七中發(fā)現(xiàn)了33個(gè)化學(xué)成分。詳見表1。

3.3? 血三七化學(xué)成分裂解規(guī)律

3.3.1? 酚酸類化合物結(jié)構(gòu)鑒定? 酚酸類化合物主要是沒食子酸類以及少量奎寧酸類和阿魏酸類。根據(jù)沒食子酸類化合物二級質(zhì)譜及裂解規(guī)律，化合物9～12，19，24～27和33被鑒定為沒食子酸類化合物。見圖2，以化合物9的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律為例，化合物9質(zhì)核比為m/z 343，推測分子式為C14H15O10，根據(jù)二級質(zhì)譜可知，在負(fù)離子模式下存在m/z 169和m/z 125的離子碎片，表明結(jié)構(gòu)存在一部分沒食子酸。由于結(jié)構(gòu)中存在酯鍵，在質(zhì)譜中酯基容易斷裂形成豐度更高的m/z 189的離子碎片。結(jié)構(gòu)中環(huán)烷烴對位羥基處發(fā)生RDA裂解，再進(jìn)一步脫去一分子水和末端雙鍵，形成m/z 267的離子碎片，推測該化合物為3-沒食子酰基奎寧酸?；衔?～12，19，24～27和33均首次在血三七中報(bào)道。

3.3.2? 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定? 黃酮類化合物主要是表兒茶素類化合物。根據(jù)對表兒茶素類化合物二級質(zhì)譜及裂解規(guī)律，化合物16、21、28和30被鑒定為表兒茶素類化合物。見圖3，以化合物28的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律為例，化合物質(zhì)核比為m/z 441，推測分子式為C22H18O10。根據(jù)二級質(zhì)譜可知，在負(fù)離子模式下存在m/z 169和m/z 125的離子碎片，表明結(jié)構(gòu)存在一部分沒食子酸。由于結(jié)構(gòu)中存在酯鍵，在質(zhì)譜中酯基容易斷裂形成豐度更高的m/z 289的離子碎片，進(jìn)一步在A環(huán)間位羥基上失去一分子CO2，形成m/z 254的離子碎片，推測該化合物為表兒茶素沒食子酸酯?；衔?6和30首次在血三七中報(bào)道。

3.3.3? 香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定? 香豆素類化合物主要是巖白菜素類化合物。根據(jù)對巖白菜素類化合物二級質(zhì)譜及裂解規(guī)律，化合物13～15、18、20、25和31～33被鑒定為香豆素類化合物。見圖4，以化合物22的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律為例，化合物22質(zhì)核比為m/z 443，推測分子式為C19H24O12。根據(jù)二級質(zhì)譜可知，在負(fù)離子模式下存在m/z 369和m/z 327的離子碎片，化合物22丟失一分子的碳酸甲乙酯基團(tuán)，形成m/z 369的碎片離子;進(jìn)一步丟失C3H8基團(tuán)，形成m/z 327的碎片離子。m/z 327、m/z 249、m/z 234、m/z 201、m/z 192為巖白菜素的質(zhì)譜裂解碎片，主要發(fā)生在C環(huán)上的內(nèi)部裂解。m/z 249為C環(huán)上3，4位RDA裂解形成3，4A碎片離子，進(jìn)一步在A環(huán)上脫去甲基形成m/z 234的碎片離子;在C環(huán)上10b，4a位發(fā)生非典型RDA裂解丟失C4H8O4（120DA）的基團(tuán)，形成m/z 207的10b，4aA特征離子，進(jìn)一步在A環(huán)上脫去甲基形成m/z 192的碎片離子。故推測該化合物為甲基吡啶-O-巖白菜素?；衔?3～15、18、25和31～33首次在血三七中報(bào)道。

4 討論

Q-Orbitrap四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜同時(shí)具有高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，可得到微量成分的高分辨質(zhì)譜信息以及觸發(fā)的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，缺少對照品的情況下，單針進(jìn)樣即可高通量獲取中藥中成百上千化合物的定性信息，提高中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速分析鑒定能力[20]。本研究比較了回流提取和超聲提取、70%乙醇和100%乙醇提取液的提取效率，結(jié)果顯示：回流、超聲提取，在HPLC中差異不明顯;70%乙醇提取液中的質(zhì)譜信息豐富;利用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術(shù)，對血三七的70%乙醇提取部位進(jìn)行快速定性分析，鑒定出33種化合物，首次發(fā)現(xiàn)了24個(gè)化合物，1個(gè)成分為潛在的新巖白菜素類化合物，表明HPLC-Q-Orbitrap-MSn四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜在快速篩查天然藥物方面獨(dú)具優(yōu)勢。

采用ESI正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，分別適用于堿性、酸性基團(tuán)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[24]。血三七中酚酸類和香豆素類等成分在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，故主要以ESI負(fù)離子模式鑒定血三七成分及解析質(zhì)譜裂解規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步豐富了血三七中沒食子酸類、巖白菜素類等化學(xué)成分，較好地闡明血三七的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其更深入的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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